引用本文： 蘇孝瓊, 潘玨, 金建軍, 徐侃, 鄧至, 陳智鴻. 白細胞介素27滴鼻預防給藥通過STAT1信號通路減輕卵白蛋白誘導的哮喘小鼠氣道過敏性炎癥. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(5): 442-448. doi: 10.7507/1671-6205.2015110 復制
近年來，我國的過敏性疾病如過敏性鼻炎、過敏性皮炎和過敏性哮喘的發病率逐漸升高。根據西方國家早年提出的“衛生學說”，T淋巴細胞的Th1和Th2反應失衡，并偏向Th2免疫反應是其主要的致病機制。初始的CD4+ T淋巴細胞能分化為多種Th細胞亞群，如Th1、Th2及Th17等。雖然激活的Th細胞在不同的環境下表現出一定的可塑性，比如感染，但是已經向某一亞型分化的的Th細胞具有下調其向其他亞型分化潛力的趨勢。大量研究表明已經分化的Th1細胞會沉默自身白細胞介素4(IL-4)基因的轉錄[1]；T-box轉錄因子(T-bet)是Th1細胞分化的關鍵性轉錄因子[2-5]，Th2細胞上異常表達的T-bet不僅可以誘導γ干擾素(IFN-γ)的轉錄，還可以抑制IL-4基因的轉錄，而缺乏T-bet的小鼠則因為無法沉默IL-4基因的轉錄表現出自發性的過敏性氣道炎癥[6]；IFN-γ受體(-/-)、信號轉導與轉錄激活子4(STAT4)(-/-)及干擾素調節因子1(IRF-1)(-/-)等基因敲除小鼠即使感染了誘導Th1型炎癥反應的病原體，最終仍容易發展為Th2型炎癥[2, 7]。這些研究結果均表明了促進Th1細胞分化的相關因子可以抑制Th2細胞的分化。
IL-27是2006年新近發現的細胞因子，它主要由活化的樹突狀細胞(DC)分泌，為白細胞介素12(IL-12)家族的成員之一。大量的體外實驗表明IL-27可以通過信號轉導與轉錄激活子1(STAT1)通路促進Th1細胞的分化，從而抑制Th2細胞的分化[8-9]；外源性轉入IL-27基因可抑制利氏曼原蟲感染誘導的Th2反應[9-10]。但近期報道顯示IL-27不能抑制已分化的Th17細胞的再分化過程[11]。且IL-27雖可抑制健康人外周血提取的CD4+ T淋巴細胞的Th2分化，但對哮喘患者CD4+ T淋巴細胞分化的抑制效應幾乎消失[12]。為明確IL-27是否能抑制過敏性哮喘氣道炎癥，我們構建了致敏前小劑量多次給予IL-27預防的小鼠模型及激發最后3 d給予大劑量IL-27治療的小鼠模型，從活體和細胞水平研究IL-27減輕氣道過敏性炎癥的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：清潔級C57小鼠，雌性，體重20~25 g，6~8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗前1周飼養于復旦大學附屬中山醫院動物房，清潔級恒溫(25℃)環境，標準飼料，自由取水，12 h晝夜。
2.主要試劑：卵白蛋白(OVA)干粉(GradeV，美國Sigma公司), 氫氧化鋁(美國Thermo Pierce公司)，鼠IL-27、IL-4、IL-2(美國R&D公司)，抗IFN-γ抗體、抗IL-10抗體、抗IL-4抗體(美國BD公司)，磷酸化STAT1(p-STAT1)抗體、STAT1抗體、HSP70抗體(美國Cell Signaling公司)，抗鼠CD3抗體、抗鼠CD28抗體(美國eBioscience公司)。小鼠IL-4 ELISA試劑盒(上海園創生物技術有限公司)，HE染色套裝(南京建成生物制品研究所)。
二 方法
1.實驗分組及干預方案
(1)IL-27滴鼻預防對小鼠氣道炎癥的影響：①哮喘組(OVA組)：于實驗開始第0和7 d給予腹腔注射100μL致敏液(OVA 100μg，氫氧化鋁2 mg)。第14~18 d為激發階段，麻醉狀態下鼻腔滴入1％OVA溶液50μL，每日1次，連續5 d。末次激發后24 h處死小鼠。②IL-27 50 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 50 ng組)：在實驗開始前至實驗開始第7 d，小鼠在麻醉狀態下(異氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每日2次，共50 ng，連續14 d，其余方法同哮喘組。③IL-27 100 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 100 ng組)：在實驗開始前至實驗開始第7d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入50 ng IL-27溶液，每日2次，共100 ng，連續14 d，其余方法同哮喘組。④對照組(PBS組)：致敏液和激發液均為PBS, 操作時間點同哮喘組，并于末次給藥后24 h處死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蠟包埋。對照組6只小鼠，其余每組8只小鼠，共30只小鼠。
(2)IL-27滴鼻治療對小鼠氣道炎癥的影響：①哮喘組(OVA組)：同上。②IL-27 0.5μg滴鼻治療組(OVA+IL-27 0.5μg組)：哮喘模型的制備同哮喘組，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入0.5μg IL-27溶液，每日1次，連續3 d。③IL-27 1μg滴鼻治療組(OVA+IL-27 1μg組)：哮喘模型的制備同哮喘組，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入1μg IL-27溶液，每日1次，連續3 d。④對照組(PBS組):同上。并于末次給藥后24 h處死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蠟包埋。對照組6只小鼠，其余每組8只小鼠，共30只小鼠。
2.肺組織形態觀察及炎癥病理評分：肺組織切片分別行HE染色，200×光鏡下觀察肺組織病理學改變。根據Curtis等[13]提出的小鼠肺組織炎癥病理評分，對總炎癥、血管周圍炎癥和支氣管周圍炎癥進行評分。
3.脾臟CD4+ T淋巴細胞的分化和培養：用CD4+ T淋巴細胞分離純化試劑盒從小鼠脾臟單個核細胞中分離得到CD4+ T淋巴細胞，24孔板提前用1μg/mL抗CD3抗體，1μg/mL抗CD28抗體包被過夜。基礎培養基包括1640 RPMI，10%胎牛血清，抗IFN-γ抗體。共分5個組：基礎培養組(Th2組)，中性培養組(Neu組)，Th2+IL-27組，Th2+IL-27+抗IFN-γ組，Th2+IL-27+抗IL-10組。根據分組情況加入相應的細胞因子或抗體，如Th2+IL-27+抗IFN-γ組：除基礎培養基外，另加入15 ng/mL IL-4，10 ng/mL IL-27，10μg/mL抗IFN-γ抗體。中性培養組(Neu組)：除基礎培養基外，另加入10μg/mL抗IL-4抗體。不同Th2誘導環境對IL-27抑制作用實驗中的Th2(低)、Th2(中)、Th2(高)培養環境中，除基礎培養基外，IL-4的濃度分別為1、5和20 ng/mL。
4.ELISA檢測IL-4濃度：用含有抗IL-4抗體的包被緩沖液，4℃過夜包被酶標板。每孔加入200μL檢測稀釋液以中和非特異性抗體，沖洗后每孔分別加入IL-4標準液或樣本各100μL，孵育2 h，清洗后每孔加入100μL含有檢測抗體的檢測液，孵育1 h。最后分別加入底物液和終止液。用450 nm的酶標板讀取吸光度值。
5.蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測p-STAT1和總STAT1水平：采用了4種培養環境，分別為中性培養組(Neu組)、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)。第5 d收集細胞。分為2組，一組用IL-27刺激15 min，收集總蛋白；另一組用PBS作用15 min，收集總蛋白。使用NE-PERTM試劑盒提取CD4+ T淋巴細胞總蛋白。10％SDS PAGE分離總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜上，1∶1 000稀釋的抗p-STAT1、STAT1抗體分別進行蛋白印跡分析，ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以HSP70為內參標化各樣品。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。各組數據以
結果
一 IL-27滴鼻預防對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
結果顯示預防性小劑量多次氣道局部給予IL-27給藥可明顯抑制支氣管周圍炎癥細胞的浸潤，抑制氣道上皮細胞的增殖肥厚、杯狀細胞增生和基質層的增生。同時也可輕度抑制血管周圍炎癥細胞的浸潤。對血管周圍和支氣管周圍的炎癥病理評分發現，OVA+IL-27 50 ng組、OVA+IL-27 100 ng組與OVA組比較，炎癥病理評分顯著降低(P＜0.05)，而且小劑量的IL-27即顯示明顯的效果。結果見圖 1和圖 2。
圖1
27滴鼻預防組小鼠肺組織病理檢查像(HE×200)?a:PBS組；b:OVA組；c:OVA+IL-27 50 ng滴鼻預防組；d:OVA+IL-27 100 ng滴鼻預防組
圖2
IL-27滴鼻預防組小鼠氣道炎癥病理評分?a.總炎癥病理評分；b.支氣管旁炎癥病理評分；c.血管旁炎癥病理評分
與OVA組比較，*
二 IL-27滴鼻治療對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
結果顯示在激發期即使使用了大劑量的IL-27給藥，IL-27滴鼻治療對支氣管周圍和血管周圍炎癥細胞的浸潤仍無明顯抑制作用。對血管周圍和支氣管周圍的炎癥病理評分發現OVA+IL-27 0.5μg組、OVA+IL-27 1μg組與OVA組比較，炎癥病理評分無顯著降低(P＞0.05)。結果見圖 3和圖 4。
圖3
IL-27滴鼻治療組小鼠肺組織病理檢查像(HE×200)?a：PBS組；b：OVA組；c：OVA+IL-27 0.5μg滴鼻治療組；d：OVA+IL-27 1μg滴鼻治療組
圖4
IL-27滴鼻治療組小鼠氣道炎癥病理評分?a.總炎癥病理評分；b.支氣管旁炎癥病理評分；c.血管旁炎癥病理評分
三 IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞的Th2分化的抑制作用
小鼠脾臟單個核細胞中分離純化CD4+ T淋巴細胞，采用5組進行分化實驗。其中，可見Th2組即在培養過程中加入IL-4，在第6 d通過佛波酯(PMA)和離子霉素刺激后可分泌大量的IL-4，說明培養和分化效果較好。但若在培養時加入IL-4和IL-27，即Th2+IL-27組，第6 d用PMA和離子霉素刺激后，IL-4的分泌卻受到明顯抑制(與Th2組比較，P＜0.05)。另外，如果培養時同時加入IL-4、IL-27、抗IFN-γ抗體，即Th2+IL-27+抗IFN-γ組，可見IL-27仍能明顯抑制IL-4的分泌，說明IL-27對CD4+ T淋巴細胞分化的抑制不依賴于IFN-γ。同樣的方法也檢測了IL-10, 發現IL-27對CD4+ T淋巴細胞分化的抑制也不依賴于IL-10。結果見圖 5。
圖5
IL-27可抑制初始CD4+ T淋巴細胞的Th2分化且不依賴IFN-γ和IL10
與Th2組比較，*
四 IL-27對CD4+ T淋巴細胞的分化抑制受分化環境的影響
當IL-27用于初始CD4+ T淋巴細胞分化實驗時，給予不同的培養環境，并根據培養基中添加IL-4的濃度，分為Th2(低)、Th2(中)和Th2(高)，其中IL-4的濃度依次為1 ng/mL、5 ng/mL和20 ng/mL。研究中發現隨著誘導向Th2分化的IL-4濃度的升高，IL-27的抑制作用逐漸減弱。采用初始CD4+ T淋巴細胞和已分化為Th2的CD4+ T淋巴細胞的對比實驗，發現IL-27可以抑制初始CD4+ T淋巴細胞的從頭分化，但不能逆轉已分化的細胞再分化。結果見圖 6。
圖6
不同的Th2誘導環境對IL-27抑制作用的影響a.IL-27在不同強度IL-4誘導環境下對Th2分化抑制的影響；b.IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞向Th2分化有明顯的抑制作用；c.IL-27對已分化的Th2-CD4+ T淋巴細胞再分化的抑制效應消失
與Th2組比較，*
五 IL-27對CD4+ T淋巴細胞的分化作用受細胞內信號轉導因子STAT1調控
Western blot檢測結果顯示，在Neu組和Th2(低)組，當細胞用IL-27刺激后，STAT1的磷酸化明顯，而在Th2(中)組和Th2(高)組STAT1的磷酸化受阻。但各組總STAT1水平相當。結果見圖 7。
圖7
不同Th2誘導環境對CD4+ T淋巴細胞STAT1磷酸化的影響a.Western blot檢測像；b.p-STAT1相對表達柱狀圖
討論
IL-27能在細胞水平抑制Th2或Th17分化，但IL-27是否能在動物水平抑制OVA誘導的氣道過敏性炎癥尚不得而知。根據已有的研究，IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞的特定分化抑制效果較好，而對已分化的CD4+ T淋巴細胞的再分化的抑制存在障礙。而哮喘患者體內可能存在已分化的Th2細胞。
因此，我們設計了兩種IL-27干預的動物模型，一種為“IL-27小劑量、多次預防干預”，另一種為“IL-27大劑量、寡次治療干預”。研究結果顯示雖然IL-27治療可以輕度抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，但與OVA組相比，差異無統計學意義。而IL-27小劑量、多次預防給藥組，可以明顯抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，與OVA組相比，差異有統計學意義。
通過提取小鼠脾臟CD4+ T淋巴細胞，進行體外分化及IL-27處理發現，IL-27能明顯抑制初始CD4+ T淋巴細胞向Th2方向分化，且這種作用不依賴于IFN-γ和IL-10。因此推測IL-27在動物水平對OVA誘導的氣道炎癥的預防作用與IL-27抑制T淋巴細胞的Th2分化能力有關。但如果用高劑量的IL-4誘導Th2分化，或誘導已朝Th2分化的細胞再分化，添加IL-27后，其抑制效應明顯減弱。可能的原因是已分化的Th2細胞對IL-27產生耐受。這可以部分解釋我們第二種動物模型的結果，即在激發的晚期使用IL-27治療，對支氣管和血管周圍的炎癥有輕度抑制，但無統計學意義。
Leung等[14]報道了哮喘患者外周血中IFN-γ受體存在缺陷，過高劑量的IL-2或IL-4誘導Th細胞向Th2分化的同時會產生對糖皮質激素的抵抗，且對IL-10和轉化生長因子β(TGF-β)耐受，并發現是MAPK通路介導的。細胞因子是通過酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子(Jak-STAT)信號通路傳遞信號的，STATs家族有1~6個亞型，其中STAT1/T-bet介導了Th1細胞分化[15]。為探究IL-27處理T淋巴細胞后的信號傳遞，我們采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除鼠，發現僅STAT1敲除可抵消IL-27的效應，而IFN-γ和T-bet敲除對IL-27的效應無影響。說明IL-27是借助STAT1信號通路活化而傳遞信號。
小鼠抵抗細菌和病毒感染時會啟動STAT1[16]，人類如果缺乏STAT1，在幼年很可能死于細菌或病毒感染[17]。STAT1基因突變者(尤其是重癥哮喘患者)，則對非典型病原體和病毒易感性增加[18]。已有的研究結果顯示IL-27對細菌和病毒感染的抵抗，很可能是通過STAT1信號通路啟動從而抑制細胞的Th2分化。因此STAT1可能成為高IL-4誘導的對IL-27效應耐受的靶分子。有報道當人外周血CD4+ T淋巴細胞在誘導向Th2分化的過程中，其細胞內總STAT1轉錄水平降低。但在我們的研究中當初始CD4+ T淋巴細胞培養于Neu、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)各種環境時，各組的總STAT1的表達水平恒定，但STAT1磷酸化水平不盡相同：Neu組和Th2(低)組STAT1磷酸化水平正常，但當用中、高劑量IL-4誘導時則出現了STAT1磷酸化水平的明顯降低。磷酸化是STAT1入核前的活化步驟，未磷酸化的STAT1不發揮信號傳遞功能。推測哮喘動物體內的T淋巴細胞存在STAT1功能障礙。
哮喘的細胞因子治療或其他替代治療一直是哮喘機制及新藥研究的熱點[19-21]。IL-27是Th1細胞因子家族的成員之一，它猶如一把雙刃劍，既具有促進Th1分化，同時又可抑制Th2及Th17分化的作用[22]。在對哮喘動物及細胞水平的研究發現，IL-27抑制初始CD4+ T淋巴細胞向Th2分化的作用非常卓越，但對已朝Th2分化的細胞，其抑制作用明顯降低，動物模型也證實IL-27的預防性效果比治療效果顯著。哮喘的本質是氣道過敏性炎癥，患者多于青年發病，成年后也經常反復發作。因此，推測在氣道局部或外周血中業已存在的分化的Th2淋巴細胞是IL-27作用降低的原因。如何克服該效應屏障，發揮出細胞因子在預防及治療哮喘中的作用，還需要深入探索。
近年來，我國的過敏性疾病如過敏性鼻炎、過敏性皮炎和過敏性哮喘的發病率逐漸升高。根據西方國家早年提出的“衛生學說”，T淋巴細胞的Th1和Th2反應失衡，并偏向Th2免疫反應是其主要的致病機制。初始的CD4+ T淋巴細胞能分化為多種Th細胞亞群，如Th1、Th2及Th17等。雖然激活的Th細胞在不同的環境下表現出一定的可塑性，比如感染，但是已經向某一亞型分化的的Th細胞具有下調其向其他亞型分化潛力的趨勢。大量研究表明已經分化的Th1細胞會沉默自身白細胞介素4(IL-4)基因的轉錄[1]；T-box轉錄因子(T-bet)是Th1細胞分化的關鍵性轉錄因子[2-5]，Th2細胞上異常表達的T-bet不僅可以誘導γ干擾素(IFN-γ)的轉錄，還可以抑制IL-4基因的轉錄，而缺乏T-bet的小鼠則因為無法沉默IL-4基因的轉錄表現出自發性的過敏性氣道炎癥[6]；IFN-γ受體(-/-)、信號轉導與轉錄激活子4(STAT4)(-/-)及干擾素調節因子1(IRF-1)(-/-)等基因敲除小鼠即使感染了誘導Th1型炎癥反應的病原體，最終仍容易發展為Th2型炎癥[2, 7]。這些研究結果均表明了促進Th1細胞分化的相關因子可以抑制Th2細胞的分化。
IL-27是2006年新近發現的細胞因子，它主要由活化的樹突狀細胞(DC)分泌，為白細胞介素12(IL-12)家族的成員之一。大量的體外實驗表明IL-27可以通過信號轉導與轉錄激活子1(STAT1)通路促進Th1細胞的分化，從而抑制Th2細胞的分化[8-9]；外源性轉入IL-27基因可抑制利氏曼原蟲感染誘導的Th2反應[9-10]。但近期報道顯示IL-27不能抑制已分化的Th17細胞的再分化過程[11]。且IL-27雖可抑制健康人外周血提取的CD4+ T淋巴細胞的Th2分化，但對哮喘患者CD4+ T淋巴細胞分化的抑制效應幾乎消失[12]。為明確IL-27是否能抑制過敏性哮喘氣道炎癥，我們構建了致敏前小劑量多次給予IL-27預防的小鼠模型及激發最后3 d給予大劑量IL-27治療的小鼠模型，從活體和細胞水平研究IL-27減輕氣道過敏性炎癥的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：清潔級C57小鼠，雌性，體重20~25 g，6~8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗前1周飼養于復旦大學附屬中山醫院動物房，清潔級恒溫(25℃)環境，標準飼料，自由取水，12 h晝夜。
2.主要試劑：卵白蛋白(OVA)干粉(GradeV，美國Sigma公司), 氫氧化鋁(美國Thermo Pierce公司)，鼠IL-27、IL-4、IL-2(美國R&D公司)，抗IFN-γ抗體、抗IL-10抗體、抗IL-4抗體(美國BD公司)，磷酸化STAT1(p-STAT1)抗體、STAT1抗體、HSP70抗體(美國Cell Signaling公司)，抗鼠CD3抗體、抗鼠CD28抗體(美國eBioscience公司)。小鼠IL-4 ELISA試劑盒(上海園創生物技術有限公司)，HE染色套裝(南京建成生物制品研究所)。
二 方法
1.實驗分組及干預方案
(1)IL-27滴鼻預防對小鼠氣道炎癥的影響：①哮喘組(OVA組)：于實驗開始第0和7 d給予腹腔注射100μL致敏液(OVA 100μg，氫氧化鋁2 mg)。第14~18 d為激發階段，麻醉狀態下鼻腔滴入1％OVA溶液50μL，每日1次，連續5 d。末次激發后24 h處死小鼠。②IL-27 50 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 50 ng組)：在實驗開始前至實驗開始第7 d，小鼠在麻醉狀態下(異氟烷吸入性麻醉)鼻腔滴入25 ng IL-27溶液，每日2次，共50 ng，連續14 d，其余方法同哮喘組。③IL-27 100 ng滴鼻預防組(OVA+IL-27 100 ng組)：在實驗開始前至實驗開始第7d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入50 ng IL-27溶液，每日2次，共100 ng，連續14 d，其余方法同哮喘組。④對照組(PBS組)：致敏液和激發液均為PBS, 操作時間點同哮喘組，并于末次給藥后24 h處死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蠟包埋。對照組6只小鼠，其余每組8只小鼠，共30只小鼠。
(2)IL-27滴鼻治療對小鼠氣道炎癥的影響：①哮喘組(OVA組)：同上。②IL-27 0.5μg滴鼻治療組(OVA+IL-27 0.5μg組)：哮喘模型的制備同哮喘組，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入0.5μg IL-27溶液，每日1次，連續3 d。③IL-27 1μg滴鼻治療組(OVA+IL-27 1μg組)：哮喘模型的制備同哮喘組，在第16、17及18 d，小鼠在麻醉狀態下鼻腔滴入1μg IL-27溶液，每日1次，連續3 d。④對照組(PBS組):同上。并于末次給藥后24 h處死小鼠。鼠肺用4％多聚甲醛固定并石蠟包埋。對照組6只小鼠，其余每組8只小鼠，共30只小鼠。
2.肺組織形態觀察及炎癥病理評分：肺組織切片分別行HE染色，200×光鏡下觀察肺組織病理學改變。根據Curtis等[13]提出的小鼠肺組織炎癥病理評分，對總炎癥、血管周圍炎癥和支氣管周圍炎癥進行評分。
3.脾臟CD4+ T淋巴細胞的分化和培養：用CD4+ T淋巴細胞分離純化試劑盒從小鼠脾臟單個核細胞中分離得到CD4+ T淋巴細胞，24孔板提前用1μg/mL抗CD3抗體，1μg/mL抗CD28抗體包被過夜。基礎培養基包括1640 RPMI，10%胎牛血清，抗IFN-γ抗體。共分5個組：基礎培養組(Th2組)，中性培養組(Neu組)，Th2+IL-27組，Th2+IL-27+抗IFN-γ組，Th2+IL-27+抗IL-10組。根據分組情況加入相應的細胞因子或抗體，如Th2+IL-27+抗IFN-γ組：除基礎培養基外，另加入15 ng/mL IL-4，10 ng/mL IL-27，10μg/mL抗IFN-γ抗體。中性培養組(Neu組)：除基礎培養基外，另加入10μg/mL抗IL-4抗體。不同Th2誘導環境對IL-27抑制作用實驗中的Th2(低)、Th2(中)、Th2(高)培養環境中，除基礎培養基外，IL-4的濃度分別為1、5和20 ng/mL。
4.ELISA檢測IL-4濃度：用含有抗IL-4抗體的包被緩沖液，4℃過夜包被酶標板。每孔加入200μL檢測稀釋液以中和非特異性抗體，沖洗后每孔分別加入IL-4標準液或樣本各100μL，孵育2 h，清洗后每孔加入100μL含有檢測抗體的檢測液，孵育1 h。最后分別加入底物液和終止液。用450 nm的酶標板讀取吸光度值。
5.蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測p-STAT1和總STAT1水平：采用了4種培養環境，分別為中性培養組(Neu組)、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)。第5 d收集細胞。分為2組，一組用IL-27刺激15 min，收集總蛋白；另一組用PBS作用15 min，收集總蛋白。使用NE-PERTM試劑盒提取CD4+ T淋巴細胞總蛋白。10％SDS PAGE分離總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜上，1∶1 000稀釋的抗p-STAT1、STAT1抗體分別進行蛋白印跡分析，ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以HSP70為內參標化各樣品。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。各組數據以
結果
一 IL-27滴鼻預防對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
結果顯示預防性小劑量多次氣道局部給予IL-27給藥可明顯抑制支氣管周圍炎癥細胞的浸潤，抑制氣道上皮細胞的增殖肥厚、杯狀細胞增生和基質層的增生。同時也可輕度抑制血管周圍炎癥細胞的浸潤。對血管周圍和支氣管周圍的炎癥病理評分發現，OVA+IL-27 50 ng組、OVA+IL-27 100 ng組與OVA組比較，炎癥病理評分顯著降低(P＜0.05)，而且小劑量的IL-27即顯示明顯的效果。結果見圖 1和圖 2。
圖1
27滴鼻預防組小鼠肺組織病理檢查像(HE×200)?a:PBS組；b:OVA組；c:OVA+IL-27 50 ng滴鼻預防組；d:OVA+IL-27 100 ng滴鼻預防組
圖2
IL-27滴鼻預防組小鼠氣道炎癥病理評分?a.總炎癥病理評分；b.支氣管旁炎癥病理評分；c.血管旁炎癥病理評分
與OVA組比較，*
二 IL-27滴鼻治療對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
結果顯示在激發期即使使用了大劑量的IL-27給藥，IL-27滴鼻治療對支氣管周圍和血管周圍炎癥細胞的浸潤仍無明顯抑制作用。對血管周圍和支氣管周圍的炎癥病理評分發現OVA+IL-27 0.5μg組、OVA+IL-27 1μg組與OVA組比較，炎癥病理評分無顯著降低(P＞0.05)。結果見圖 3和圖 4。
圖3
IL-27滴鼻治療組小鼠肺組織病理檢查像(HE×200)?a：PBS組；b：OVA組；c：OVA+IL-27 0.5μg滴鼻治療組；d：OVA+IL-27 1μg滴鼻治療組
圖4
IL-27滴鼻治療組小鼠氣道炎癥病理評分?a.總炎癥病理評分；b.支氣管旁炎癥病理評分；c.血管旁炎癥病理評分
三 IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞的Th2分化的抑制作用
小鼠脾臟單個核細胞中分離純化CD4+ T淋巴細胞，采用5組進行分化實驗。其中，可見Th2組即在培養過程中加入IL-4，在第6 d通過佛波酯(PMA)和離子霉素刺激后可分泌大量的IL-4，說明培養和分化效果較好。但若在培養時加入IL-4和IL-27，即Th2+IL-27組，第6 d用PMA和離子霉素刺激后，IL-4的分泌卻受到明顯抑制(與Th2組比較，P＜0.05)。另外，如果培養時同時加入IL-4、IL-27、抗IFN-γ抗體，即Th2+IL-27+抗IFN-γ組，可見IL-27仍能明顯抑制IL-4的分泌，說明IL-27對CD4+ T淋巴細胞分化的抑制不依賴于IFN-γ。同樣的方法也檢測了IL-10, 發現IL-27對CD4+ T淋巴細胞分化的抑制也不依賴于IL-10。結果見圖 5。
圖5
IL-27可抑制初始CD4+ T淋巴細胞的Th2分化且不依賴IFN-γ和IL10
與Th2組比較，*
四 IL-27對CD4+ T淋巴細胞的分化抑制受分化環境的影響
當IL-27用于初始CD4+ T淋巴細胞分化實驗時，給予不同的培養環境，并根據培養基中添加IL-4的濃度，分為Th2(低)、Th2(中)和Th2(高)，其中IL-4的濃度依次為1 ng/mL、5 ng/mL和20 ng/mL。研究中發現隨著誘導向Th2分化的IL-4濃度的升高，IL-27的抑制作用逐漸減弱。采用初始CD4+ T淋巴細胞和已分化為Th2的CD4+ T淋巴細胞的對比實驗，發現IL-27可以抑制初始CD4+ T淋巴細胞的從頭分化，但不能逆轉已分化的細胞再分化。結果見圖 6。
圖6
不同的Th2誘導環境對IL-27抑制作用的影響a.IL-27在不同強度IL-4誘導環境下對Th2分化抑制的影響；b.IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞向Th2分化有明顯的抑制作用；c.IL-27對已分化的Th2-CD4+ T淋巴細胞再分化的抑制效應消失
與Th2組比較，*
五 IL-27對CD4+ T淋巴細胞的分化作用受細胞內信號轉導因子STAT1調控
Western blot檢測結果顯示，在Neu組和Th2(低)組，當細胞用IL-27刺激后，STAT1的磷酸化明顯，而在Th2(中)組和Th2(高)組STAT1的磷酸化受阻。但各組總STAT1水平相當。結果見圖 7。
圖7
不同Th2誘導環境對CD4+ T淋巴細胞STAT1磷酸化的影響a.Western blot檢測像；b.p-STAT1相對表達柱狀圖
討論
IL-27能在細胞水平抑制Th2或Th17分化，但IL-27是否能在動物水平抑制OVA誘導的氣道過敏性炎癥尚不得而知。根據已有的研究，IL-27對初始CD4+ T淋巴細胞的特定分化抑制效果較好，而對已分化的CD4+ T淋巴細胞的再分化的抑制存在障礙。而哮喘患者體內可能存在已分化的Th2細胞。
因此，我們設計了兩種IL-27干預的動物模型，一種為“IL-27小劑量、多次預防干預”，另一種為“IL-27大劑量、寡次治療干預”。研究結果顯示雖然IL-27治療可以輕度抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，但與OVA組相比，差異無統計學意義。而IL-27小劑量、多次預防給藥組，可以明顯抑制支氣管及血管周圍的炎癥細胞浸潤，與OVA組相比，差異有統計學意義。
通過提取小鼠脾臟CD4+ T淋巴細胞，進行體外分化及IL-27處理發現，IL-27能明顯抑制初始CD4+ T淋巴細胞向Th2方向分化，且這種作用不依賴于IFN-γ和IL-10。因此推測IL-27在動物水平對OVA誘導的氣道炎癥的預防作用與IL-27抑制T淋巴細胞的Th2分化能力有關。但如果用高劑量的IL-4誘導Th2分化，或誘導已朝Th2分化的細胞再分化，添加IL-27后，其抑制效應明顯減弱。可能的原因是已分化的Th2細胞對IL-27產生耐受。這可以部分解釋我們第二種動物模型的結果，即在激發的晚期使用IL-27治療，對支氣管和血管周圍的炎癥有輕度抑制，但無統計學意義。
Leung等[14]報道了哮喘患者外周血中IFN-γ受體存在缺陷，過高劑量的IL-2或IL-4誘導Th細胞向Th2分化的同時會產生對糖皮質激素的抵抗，且對IL-10和轉化生長因子β(TGF-β)耐受，并發現是MAPK通路介導的。細胞因子是通過酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子(Jak-STAT)信號通路傳遞信號的，STATs家族有1~6個亞型，其中STAT1/T-bet介導了Th1細胞分化[15]。為探究IL-27處理T淋巴細胞后的信號傳遞，我們采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除鼠，發現僅STAT1敲除可抵消IL-27的效應，而IFN-γ和T-bet敲除對IL-27的效應無影響。說明IL-27是借助STAT1信號通路活化而傳遞信號。
小鼠抵抗細菌和病毒感染時會啟動STAT1[16]，人類如果缺乏STAT1，在幼年很可能死于細菌或病毒感染[17]。STAT1基因突變者(尤其是重癥哮喘患者)，則對非典型病原體和病毒易感性增加[18]。已有的研究結果顯示IL-27對細菌和病毒感染的抵抗，很可能是通過STAT1信號通路啟動從而抑制細胞的Th2分化。因此STAT1可能成為高IL-4誘導的對IL-27效應耐受的靶分子。有報道當人外周血CD4+ T淋巴細胞在誘導向Th2分化的過程中，其細胞內總STAT1轉錄水平降低。但在我們的研究中當初始CD4+ T淋巴細胞培養于Neu、Th2(低)、Th2(中)及Th2(高)各種環境時，各組的總STAT1的表達水平恒定，但STAT1磷酸化水平不盡相同：Neu組和Th2(低)組STAT1磷酸化水平正常，但當用中、高劑量IL-4誘導時則出現了STAT1磷酸化水平的明顯降低。磷酸化是STAT1入核前的活化步驟，未磷酸化的STAT1不發揮信號傳遞功能。推測哮喘動物體內的T淋巴細胞存在STAT1功能障礙。
哮喘的細胞因子治療或其他替代治療一直是哮喘機制及新藥研究的熱點[19-21]。IL-27是Th1細胞因子家族的成員之一，它猶如一把雙刃劍，既具有促進Th1分化，同時又可抑制Th2及Th17分化的作用[22]。在對哮喘動物及細胞水平的研究發現，IL-27抑制初始CD4+ T淋巴細胞向Th2分化的作用非常卓越，但對已朝Th2分化的細胞，其抑制作用明顯降低，動物模型也證實IL-27的預防性效果比治療效果顯著。哮喘的本質是氣道過敏性炎癥，患者多于青年發病，成年后也經常反復發作。因此，推測在氣道局部或外周血中業已存在的分化的Th2淋巴細胞是IL-27作用降低的原因。如何克服該效應屏障，發揮出細胞因子在預防及治療哮喘中的作用，還需要深入探索。
