引用本文： 王穎治, 陳愉, 李時悅. 良性氣道狹窄小標本培養成纖維細胞方法中抗生素濃度的探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(3): 286-290. doi: 10.7507/1671-6205.2015070 復制
近年來，良性氣道狹窄有增長的趨勢，其病理機制倍受關注。成纖維細胞在瘢痕肉芽組織的形成中起關鍵作用，異常成纖維細胞常表現為遷移能力增強、細胞增殖異常、對凋亡誘導信號調節異常、細胞外基質過度分泌等，但具體機制尚未完全明確。國內外一些研究利用動物造模或人胚胎肺組織來源的成纖維細胞作研究對象[1-4]，但畢竟這些來源的成纖維細胞與人氣道內肉芽組織的成纖維細胞存在一定的生物學差異。為給后續疾病的機制研究提供直接來源于人良性氣道狹窄的成纖維細胞，以便能直接研究良性氣道狹窄成纖維細胞的病理生理特點以及進行蛋白組學分析，尋找出臨床治療靶點，本研究探討了用支氣管鏡獲取良性氣道狹窄患者氣道內肉芽，通過組織塊法培養原代成纖維細胞方法中抗生素濃度的影響。
組織塊培養法是把活體的一小片組織置于底物上孵育，細胞自其周圍移出并增殖。原代培養絕大多數細胞并不馬上開始增殖，需經歷一段適應或潛伏期，最先可見組織塊邊緣“長出”細胞，這些細胞通常并不是增殖產生而是從原代組織塊中游走出來的，因而原代早期較少見到分裂細胞。最早游出的細胞多以成纖維細胞為主，成纖維細胞生長速度快，適應性好，細胞為長梭形，多呈放射狀或漩渦狀分布。常用的細胞生長狀況的觀察方法有細胞計數、細胞生長曲線、細胞分裂指數等，但這些方法適用于已進行傳代培養或已培養出一定數量的細胞的生長狀況的觀察。本研究觀察細胞培養狀況主要是細胞的原代培養，是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養，且此時細胞的數量較少，尤其前24 h，故以上方法不適合本研究的觀察。本研究以測量組織塊周圍細胞增殖最遠半徑作為觀察細胞生長情況的方法，方法操作簡單，且不會損傷細胞，不會影響細胞增殖的速度，能直觀地反映不同預處理方法對原代成纖維細胞生長狀況的影響。
對象與方法
一 對象
氣道內肉芽組織來源于2013年3月至2013年12月廣州醫科大學附屬第一醫院經支氣管鏡活檢的14例良性氣道狹窄患者，共獲得15份氣道內肉芽組織標本，其中男10例，女4例；年齡2~71歲，平均年齡(43.7±20.7)歲。標本的相關信息見表 1。本研究方案經廣州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審批通過，入選患者均已簽署知情同意書。
表1
標本的一般資料(n=5)
二 方法
1.分組：根據標本預處理方法的不同分為3組：(1)常規抗生素濃度預處理組(組1)，5份標本，給予1%～2%青霉素/鏈霉素(簡稱雙抗)的磷酸鹽緩沖液(PBS)預處理；(2)高濃度抗生素預處理組(組2)，5份標本，給予6%雙抗PBS預處理；(3)酒精聯合高濃度抗生素預處理組(組3)，5份標本，先用75%酒精漂洗3～4 s，再用含6%雙抗PBS漂洗干凈。所有標本經不同的預處理后均用組織塊法進行培養。
2.主要試劑：杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)高糖培養液(Hyclone，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，PBS粉劑(博士德，中國)，0.25%胰酶/0.2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(Bloind，以色列)，青霉素/鏈霉素雙抗(Genom，中國)。
3.標本處理及培養方法：標本依次按照以下過程處理：①所有標本均采用標準方法處理[5]，標本用無菌生理鹽水漂洗干凈后浸泡并于4 ℃保存，3 h內送實驗室處理。②各組采用的預處理方法：組1，用含1%～2%雙抗PBS漂洗干凈；組2，用含6%雙抗PBS漂洗干凈；組3，先用75%酒精漂洗3～4 s，再用含6%雙抗PBS漂洗干凈。③所有標本均采用標準方法培養[5]，標本加入含20%胎牛血清，1%雙抗DMEM高糖培養液，在37 ℃，5%CO2條件下孵育，每日更換適量的培養。
4.細胞免疫組織化學鑒定：將細胞接種于24孔板中，培養至對數生長期。吸去完全培養液，用PBS洗細胞3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛固定，時間30 min。棄固定液，PBS洗3次，每次10 min。0.3%H2O2孵育10 min。棄0.3%H2O2，PBS洗3次，每次10 min。0.3%Triton-X室溫孵育30 min。棄0.3%Triton-X，PBS洗3次，每次10 min。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育1 h。棄封閉液，加一抗，不加一抗為陰性對照，4 ℃過夜。棄一抗，PBS洗3次，每次10 min。加二抗，室溫孵育45 min。PBS洗3次，每次10 min。加DAB顯色。10%磷酸甘油封片。鏡檢，若細胞胞漿呈棕褐色即為陽性，否則為陰性。
三 統計學處理
采用SPSS 19.0統計軟件進行多個獨立樣本非參數檢驗分析，不同組間比較采用單因素ANOVA檢驗，實驗數據所有計量資料用
結果
一 細胞鏡下形態學特征及免疫組織化學鑒定
標本貼培養皿培養20 d后，顯微鏡下觀察可見大量細胞于標本周圍呈放射狀排列，細胞間相互融合，部分區域呈單層細胞，部分區域呈多層重疊。結果見圖 1。經細胞免疫組織化學鑒定，細胞的胞漿中因表達波形蛋白而呈現出棕褐色，不表達角蛋白而不被染色，與成纖維細胞特征一致，培養的原代細胞為人成纖維細胞。結果見圖 2。
圖1
氣道肉芽組織成纖維細胞倒置相差顯微鏡結果 a.E2標本肉芽組織成纖維細胞(×200)；b.A3標本肉芽組織成纖維細胞(×200)；c. B2標本肉芽組織成纖維細胞(×400)；d. B3標本肉芽組織成纖維細胞(×400) ? ?圖 2 氣道肉芽組織成纖維細胞免疫組織化學鑒定結果 a.成纖維細胞表達波形蛋白(+)；b.成纖維細胞不表達角蛋白
二 不同預處理方法培養原代成纖維細胞的情況
組1的5份標本A1～E1經含1%～2%雙抗PBS處理后未能成功培養出成纖維細胞；組2經含6%雙抗PBS處理的標本A2～E2、組3經先后使用75%酒精和含6%雙抗PBS預處理的標本A3～E3均能成功培養出成纖維細胞。結果見圖 3。圖 3可顯示各標本在觀察時間內的增長情況，標本A1、B1及E1于培養24～48 h后鏡下發現大量細菌生長，細胞增殖最遠半徑迅速變小，最后無細胞生長；標本A2～E2、A3～E3隨著時間的增長，細胞數目的增長速度也越快，且未見明顯的細菌生長。細胞增殖最遠半徑與觀察時間呈正相關。
圖2
各標本成纖維細胞生長觀察圖
3種預處理方法培養成纖維細胞，細胞的增殖最遠半徑在不同時間點的差異具有統計學意義(P<0.01)。3種預處理方法培養成纖維細胞，在24、48及72 h，3種方法間無差異(P>0.05)，在96 h，3種方法間比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中組1與組2比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。組2和組3的細胞增殖最遠半徑隨時間均呈上升的趨勢，組1的細胞最遠半徑48 h后呈下降的趨勢。結果見表 2和圖 4。
圖3
各種預處理方法對細胞增殖最遠半徑的影響
表2
各種預處理方法對細胞增殖最遠半徑的影響(n=5,mm，討論
隨著各種重癥搶救技術氣管插管、氣管切開等廣泛開展，以及氣管支氣管結核在國內仍然較普遍存在，良性中央氣道狹窄有增多的趨勢[6]。而中央氣道的氣道狹窄對呼吸功能的影響很大，可以引起呼吸困難，甚至窒息，是呼吸系統常見的急重癥之一。外科手術對創傷性良性氣道狹窄有較好的療效，但部分患者由于病變范圍較廣，不適合手術治療；氣道介入技術(如球囊擴張、激光、冷凍、支架、局部給藥等)也是另一類常見的治療方法，近期療效良好，但常常出現再狹窄，需要反復多次治療且療效不佳[6-10]，是介入呼吸病學世界性難題之一。目前對良性氣道狹窄尚無有效的治療方法。研究發現異常成纖維細胞表現的遷移能力增強、細胞增殖異常、對凋亡誘導信號調節異常、細胞外基質過度分泌等，在增生性瘢痕的發生發展中起著關鍵作用，是導致瘢痕肉芽組織過度形成的主要因素[11]，但成纖維細胞增殖凋亡調控機制尚未完全明確。成纖維細胞與良性氣道狹窄的發生密切相關，利用氣道狹窄部位的成纖維細胞進行相關的研究，如成纖維細胞各種蛋白質的功能變化等，對找出良性氣道狹窄的診治靶點具有重要臨床意義。
目前國內研究良性氣道狹窄的成纖維細胞主要來源于動物模型或人胚胎肺組織，甚少采用直接來源于人體氣道內肉芽組織的成纖維細胞，這些來源的成纖維細胞與人氣道內肉芽組織的成纖維細胞存在一定的生物學差異，不能準確反映良性氣道狹窄患者成纖維細胞各種蛋白質成分及功能的變化，不利于發現有意義的與疾病相關的差異蛋白。人良性氣道狹窄的肉芽組織可通過手術或支氣管鏡活檢獲得。外科手術獲取標本體積大，容易進行細胞培養等各種研究，但是手術患者數量甚少，技術難度大，可行性低；經支氣管鏡活檢獲取標本有操作簡易、可重復性、能在最大程度上保持組織塊及細胞的活力等優點，但是由于小標本體外組織培養的方法尚未成熟，難以培養原代細胞[12]。以上因素影響了對成纖維細胞在良性氣道狹窄發生發展中有關作用機制的研究。
氣道小標本組織培養成纖維細胞已有成功培養的方法。如陳楠等[13]利用莫西沙星預處理肉芽組織標本方法。但成功培養成纖維細胞有很多影響因素，如抗生素濃度、抗生素種類、操作人員技術水平等。我們應用常規的處理標本的方法未能成功，經過多次的嘗試，增加處理液雙抗的濃度，以及利用75%酒精進行預處理，成功地培養出氣道肉芽小標本的成纖維細胞，考慮主要有以下因素：氣道狹窄局部細菌感染或定植。氣道狹窄影響氣道分泌物引流，氣道常存在細菌感染或局部定植，特別是狹窄肉芽處。文獻也報道對于長期氣道狹窄的患者多有合并嚴重氣道感染[14]。從我們臨床實踐中也發現氣道狹窄患者氣道常有大量分泌物，且難以自己咳出。近年來抗生素使用日益廣泛，這些患者出現氣道狹窄前已使用了大量的廣譜抗生素，且青霉素/鏈霉素在臨床上已經有較長的使用歷史，較多細菌已對常規濃度的青/鏈霉素產生耐藥性，標本的預處理如果按照常規濃度青霉素/鏈霉素不足以殺滅細菌。因此，針對標本細菌普遍存在，且之前已廣泛使用抗生素的情況，需選用濃度更高、殺菌效果更強的抗生素等方法進行預處理。陳楠等[13]采用傳統抗生素處理標本亦未能成功培養成纖維細胞，但更換抗生素為莫西沙星預處理氣道肉芽標本后，便成功培養出成纖維細胞。說明對標本細菌進行針對性處理是氣道小標本肉芽培養成纖維細胞的關鍵因素之一。
綜上所述，經支氣管鏡獲取氣道肉芽組織的小標本，有效殺滅標本細菌的預處理方法是培養原代成纖維細胞的重要因素，可采用增加抗生素的濃度和酒精漂洗進行預處理。
近年來，良性氣道狹窄有增長的趨勢，其病理機制倍受關注。成纖維細胞在瘢痕肉芽組織的形成中起關鍵作用，異常成纖維細胞常表現為遷移能力增強、細胞增殖異常、對凋亡誘導信號調節異常、細胞外基質過度分泌等，但具體機制尚未完全明確。國內外一些研究利用動物造模或人胚胎肺組織來源的成纖維細胞作研究對象[1-4]，但畢竟這些來源的成纖維細胞與人氣道內肉芽組織的成纖維細胞存在一定的生物學差異。為給后續疾病的機制研究提供直接來源于人良性氣道狹窄的成纖維細胞，以便能直接研究良性氣道狹窄成纖維細胞的病理生理特點以及進行蛋白組學分析，尋找出臨床治療靶點，本研究探討了用支氣管鏡獲取良性氣道狹窄患者氣道內肉芽，通過組織塊法培養原代成纖維細胞方法中抗生素濃度的影響。
組織塊培養法是把活體的一小片組織置于底物上孵育，細胞自其周圍移出并增殖。原代培養絕大多數細胞并不馬上開始增殖，需經歷一段適應或潛伏期，最先可見組織塊邊緣“長出”細胞，這些細胞通常并不是增殖產生而是從原代組織塊中游走出來的，因而原代早期較少見到分裂細胞。最早游出的細胞多以成纖維細胞為主，成纖維細胞生長速度快，適應性好，細胞為長梭形，多呈放射狀或漩渦狀分布。常用的細胞生長狀況的觀察方法有細胞計數、細胞生長曲線、細胞分裂指數等，但這些方法適用于已進行傳代培養或已培養出一定數量的細胞的生長狀況的觀察。本研究觀察細胞培養狀況主要是細胞的原代培養，是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養，且此時細胞的數量較少，尤其前24 h，故以上方法不適合本研究的觀察。本研究以測量組織塊周圍細胞增殖最遠半徑作為觀察細胞生長情況的方法，方法操作簡單，且不會損傷細胞，不會影響細胞增殖的速度，能直觀地反映不同預處理方法對原代成纖維細胞生長狀況的影響。
對象與方法
一 對象
氣道內肉芽組織來源于2013年3月至2013年12月廣州醫科大學附屬第一醫院經支氣管鏡活檢的14例良性氣道狹窄患者，共獲得15份氣道內肉芽組織標本，其中男10例，女4例；年齡2~71歲，平均年齡(43.7±20.7)歲。標本的相關信息見表 1。本研究方案經廣州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審批通過，入選患者均已簽署知情同意書。
表1
標本的一般資料(n=5)
二 方法
1.分組：根據標本預處理方法的不同分為3組：(1)常規抗生素濃度預處理組(組1)，5份標本，給予1%～2%青霉素/鏈霉素(簡稱雙抗)的磷酸鹽緩沖液(PBS)預處理；(2)高濃度抗生素預處理組(組2)，5份標本，給予6%雙抗PBS預處理；(3)酒精聯合高濃度抗生素預處理組(組3)，5份標本，先用75%酒精漂洗3～4 s，再用含6%雙抗PBS漂洗干凈。所有標本經不同的預處理后均用組織塊法進行培養。
2.主要試劑：杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)高糖培養液(Hyclone，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，PBS粉劑(博士德，中國)，0.25%胰酶/0.2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(Bloind，以色列)，青霉素/鏈霉素雙抗(Genom，中國)。
3.標本處理及培養方法：標本依次按照以下過程處理：①所有標本均采用標準方法處理[5]，標本用無菌生理鹽水漂洗干凈后浸泡并于4 ℃保存，3 h內送實驗室處理。②各組采用的預處理方法：組1，用含1%～2%雙抗PBS漂洗干凈；組2，用含6%雙抗PBS漂洗干凈；組3，先用75%酒精漂洗3～4 s，再用含6%雙抗PBS漂洗干凈。③所有標本均采用標準方法培養[5]，標本加入含20%胎牛血清，1%雙抗DMEM高糖培養液，在37 ℃，5%CO2條件下孵育，每日更換適量的培養。
4.細胞免疫組織化學鑒定：將細胞接種于24孔板中，培養至對數生長期。吸去完全培養液，用PBS洗細胞3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛固定，時間30 min。棄固定液，PBS洗3次，每次10 min。0.3%H2O2孵育10 min。棄0.3%H2O2，PBS洗3次，每次10 min。0.3%Triton-X室溫孵育30 min。棄0.3%Triton-X，PBS洗3次，每次10 min。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育1 h。棄封閉液，加一抗，不加一抗為陰性對照，4 ℃過夜。棄一抗，PBS洗3次，每次10 min。加二抗，室溫孵育45 min。PBS洗3次，每次10 min。加DAB顯色。10%磷酸甘油封片。鏡檢，若細胞胞漿呈棕褐色即為陽性，否則為陰性。
三 統計學處理
采用SPSS 19.0統計軟件進行多個獨立樣本非參數檢驗分析，不同組間比較采用單因素ANOVA檢驗，實驗數據所有計量資料用
結果
一 細胞鏡下形態學特征及免疫組織化學鑒定
標本貼培養皿培養20 d后，顯微鏡下觀察可見大量細胞于標本周圍呈放射狀排列，細胞間相互融合，部分區域呈單層細胞，部分區域呈多層重疊。結果見圖 1。經細胞免疫組織化學鑒定，細胞的胞漿中因表達波形蛋白而呈現出棕褐色，不表達角蛋白而不被染色，與成纖維細胞特征一致，培養的原代細胞為人成纖維細胞。結果見圖 2。
圖1
氣道肉芽組織成纖維細胞倒置相差顯微鏡結果 a.E2標本肉芽組織成纖維細胞(×200)；b.A3標本肉芽組織成纖維細胞(×200)；c. B2標本肉芽組織成纖維細胞(×400)；d. B3標本肉芽組織成纖維細胞(×400) ? ?圖 2 氣道肉芽組織成纖維細胞免疫組織化學鑒定結果 a.成纖維細胞表達波形蛋白(+)；b.成纖維細胞不表達角蛋白
二 不同預處理方法培養原代成纖維細胞的情況
組1的5份標本A1～E1經含1%～2%雙抗PBS處理后未能成功培養出成纖維細胞；組2經含6%雙抗PBS處理的標本A2～E2、組3經先后使用75%酒精和含6%雙抗PBS預處理的標本A3～E3均能成功培養出成纖維細胞。結果見圖 3。圖 3可顯示各標本在觀察時間內的增長情況，標本A1、B1及E1于培養24～48 h后鏡下發現大量細菌生長，細胞增殖最遠半徑迅速變小，最后無細胞生長；標本A2～E2、A3～E3隨著時間的增長，細胞數目的增長速度也越快，且未見明顯的細菌生長。細胞增殖最遠半徑與觀察時間呈正相關。
圖2
各標本成纖維細胞生長觀察圖
3種預處理方法培養成纖維細胞，細胞的增殖最遠半徑在不同時間點的差異具有統計學意義(P<0.01)。3種預處理方法培養成纖維細胞，在24、48及72 h，3種方法間無差異(P>0.05)，在96 h，3種方法間比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中組1與組2比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。組2和組3的細胞增殖最遠半徑隨時間均呈上升的趨勢，組1的細胞最遠半徑48 h后呈下降的趨勢。結果見表 2和圖 4。
圖3
各種預處理方法對細胞增殖最遠半徑的影響
表2
各種預處理方法對細胞增殖最遠半徑的影響(n=5,mm，討論
隨著各種重癥搶救技術氣管插管、氣管切開等廣泛開展，以及氣管支氣管結核在國內仍然較普遍存在，良性中央氣道狹窄有增多的趨勢[6]。而中央氣道的氣道狹窄對呼吸功能的影響很大，可以引起呼吸困難，甚至窒息，是呼吸系統常見的急重癥之一。外科手術對創傷性良性氣道狹窄有較好的療效，但部分患者由于病變范圍較廣，不適合手術治療；氣道介入技術(如球囊擴張、激光、冷凍、支架、局部給藥等)也是另一類常見的治療方法，近期療效良好，但常常出現再狹窄，需要反復多次治療且療效不佳[6-10]，是介入呼吸病學世界性難題之一。目前對良性氣道狹窄尚無有效的治療方法。研究發現異常成纖維細胞表現的遷移能力增強、細胞增殖異常、對凋亡誘導信號調節異常、細胞外基質過度分泌等，在增生性瘢痕的發生發展中起著關鍵作用，是導致瘢痕肉芽組織過度形成的主要因素[11]，但成纖維細胞增殖凋亡調控機制尚未完全明確。成纖維細胞與良性氣道狹窄的發生密切相關，利用氣道狹窄部位的成纖維細胞進行相關的研究，如成纖維細胞各種蛋白質的功能變化等，對找出良性氣道狹窄的診治靶點具有重要臨床意義。
目前國內研究良性氣道狹窄的成纖維細胞主要來源于動物模型或人胚胎肺組織，甚少采用直接來源于人體氣道內肉芽組織的成纖維細胞，這些來源的成纖維細胞與人氣道內肉芽組織的成纖維細胞存在一定的生物學差異，不能準確反映良性氣道狹窄患者成纖維細胞各種蛋白質成分及功能的變化，不利于發現有意義的與疾病相關的差異蛋白。人良性氣道狹窄的肉芽組織可通過手術或支氣管鏡活檢獲得。外科手術獲取標本體積大，容易進行細胞培養等各種研究，但是手術患者數量甚少，技術難度大，可行性低；經支氣管鏡活檢獲取標本有操作簡易、可重復性、能在最大程度上保持組織塊及細胞的活力等優點，但是由于小標本體外組織培養的方法尚未成熟，難以培養原代細胞[12]。以上因素影響了對成纖維細胞在良性氣道狹窄發生發展中有關作用機制的研究。
氣道小標本組織培養成纖維細胞已有成功培養的方法。如陳楠等[13]利用莫西沙星預處理肉芽組織標本方法。但成功培養成纖維細胞有很多影響因素，如抗生素濃度、抗生素種類、操作人員技術水平等。我們應用常規的處理標本的方法未能成功，經過多次的嘗試，增加處理液雙抗的濃度，以及利用75%酒精進行預處理，成功地培養出氣道肉芽小標本的成纖維細胞，考慮主要有以下因素：氣道狹窄局部細菌感染或定植。氣道狹窄影響氣道分泌物引流，氣道常存在細菌感染或局部定植，特別是狹窄肉芽處。文獻也報道對于長期氣道狹窄的患者多有合并嚴重氣道感染[14]。從我們臨床實踐中也發現氣道狹窄患者氣道常有大量分泌物，且難以自己咳出。近年來抗生素使用日益廣泛，這些患者出現氣道狹窄前已使用了大量的廣譜抗生素，且青霉素/鏈霉素在臨床上已經有較長的使用歷史，較多細菌已對常規濃度的青/鏈霉素產生耐藥性，標本的預處理如果按照常規濃度青霉素/鏈霉素不足以殺滅細菌。因此，針對標本細菌普遍存在，且之前已廣泛使用抗生素的情況，需選用濃度更高、殺菌效果更強的抗生素等方法進行預處理。陳楠等[13]采用傳統抗生素處理標本亦未能成功培養成纖維細胞，但更換抗生素為莫西沙星預處理氣道肉芽標本后，便成功培養出成纖維細胞。說明對標本細菌進行針對性處理是氣道小標本肉芽培養成纖維細胞的關鍵因素之一。
綜上所述，經支氣管鏡獲取氣道肉芽組織的小標本，有效殺滅標本細菌的預處理方法是培養原代成纖維細胞的重要因素，可采用增加抗生素的濃度和酒精漂洗進行預處理。
