引用本文： 李芬, 楊翃, 陳輝, 陳仲清. 血小板線粒體功能在膿毒癥病情監測的意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(1): 48-51. doi: 10.7507/1671-6205.2015012 復制
作為多器官功能障礙綜合征(MODS)的一個重要的致病原因，膿毒癥的研究不斷受到關注，但是其具體病理生理學機制尚未明確[1]。研究表明在重度膿毒癥中細胞內存在氧利用障礙，引起能量代謝水平降低，繼而引起廣泛的組織甚至器官損傷[2]。線粒體是細胞代謝中氧化磷酸化的主要場所，在膿毒癥的發生、發展與轉歸中有重要作用[3]。因此，本研究從動物模型和臨床病例標本兩個方面，以線粒體為靶點，探討并驗證外周血小板線粒體功能與膿毒癥預后的關系，以期為膿毒癥的監測與治療提供新思路。
材料與方法
一 動物實驗
1．主要實驗材料：成年雄性SD大鼠40只，SPF級，體重(250±20)g，動物學實驗操作符合生命倫理學規范。Calcein-AM(美國Invitrogen公司)，CoCl2(美國Sigma公司)，熒光素-熒光素酶試劑盒(美國Promega公司)，JC-1線粒體膜電位試劑盒(美國Invitrogen公司)，Percoll液(美國通用電氣公司)。
2．動物處理方法：采用133 g/L烏拉坦+5 g/L氯醛糖按0.65 mL/kg腹腔麻醉動物后，將40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組(A組、B組、C組)和假手術組(D組)，每組10只。模型組參照Rittirsch等[4]的方法，以盲腸穿孔結扎術(CLP)復制大鼠膿毒癥模型，按照結扎部分占盲腸總長度的比例(10%、30%、50%)，采用不同結扎長度復制不同程度膿毒癥模型，即分為A組、B組、C組，統一于術后24 h采集血樣。假手術組(D組)僅開腹分離盲腸并原路縫合，不予穿孔結扎。
3．血清炎癥因子水平檢測：CLP術后造成嚴重的腹腔感染，用5 mL注射器緩慢抽血約3 mL置于5 mL離心管中，靜置約60 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清，以ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6等重要的促炎細胞因子，按照說明書倍比稀釋后30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值，根據標準曲線查出相應促炎因子含量。
4．血小板分離提純：模型組(A、B、C組)分別于術后24 h經腹主動脈插管采血2 mL，假手術組(D組)采血2 mL，干燥采血管中加入50 U/mL肝素抗凝。用9 g/L的鹽水等倍稀釋后，經Percoll(1.06 g/mL)密度梯度離心法(20℃，2 000 r/min，7 min)取F2白色絮狀層，PBS冷凍洗滌3遍以上即得到分離純化的血小板。
5．血小板線粒體通透性轉變孔的檢測：在細胞正常狀態時，Calcein可進入線粒體內發出綠色強熒光，僅在細胞線粒體膜受損后，通透性轉變孔開放的情況下，CoCl2可進入線粒體內淬滅該熒光。因此，該技術可用于判斷細胞內線粒體通透性轉變孔的開放程度，間接判斷線粒體是否損傷。以Calcein-AM與CoCl2共同孵育血小板15 min，冷凍PBS洗滌后，采用流式細胞儀(BD Facs verse)進行定量檢測，以細胞平均綠色熒光強度衡量線粒體通透性轉變孔的狀態。
6．血小板線粒體跨膜電位檢測：采用JC-1染色方法鑒定細胞內線粒體跨膜電位ΔΨm的變化。以JC-1孵育血小板15 min后，PBS冷凍洗滌，采用流式細胞儀進行定量檢測，以綠色熒光(低ΔΨm細胞)所占百分比衡量血小板線粒體去極化的百分數。
7．血小板線粒體內三磷酸腺苷(ATP)含量檢測：以熒光素-熒光素酶法檢測血小板線粒體ATP水平，血小板懸液(2×106/mL)與檢測試劑等比混合，室溫孵育15 min，采用Spectra Max M5酶標儀檢測熒光強度(RLU)。
二 臨床試驗
1．一般資料收集：收集南方醫科大學附屬第三醫院重癥醫學科2012年至2013年期間入院膿毒癥患者外周血樣。根據美國胸科醫師學會/危重病醫學會的膿毒癥診斷標準[5]，篩選符合標準的29例膿毒癥患者(男19例，女10例)。患者入院前2周內均未服用阿司匹林、肝素等影響血小板功能的藥物，無血液病、惡性腫瘤等病史。按照急性生理學和慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)進行評分，其中≥20分有9例，11~19分有8例，≤10分有12例。該研究經患者知情同意，并經醫院倫理委員會批準。
2．樣品處理：將新鮮血樣肝素抗凝處理，Percoll密度梯度離心法提取純化血小板，混懸液(2×106/mL)加入96孔板，以PBS作為陰性對照，用熒光素-熒光素酶法檢測熒光強度。
三 統計學處理
采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。4組大鼠的相關數據的比較采用多個樣本均數間的多重比較檢驗分析，即One-way ANOVA檢驗。病例的相關數據以Spearman積差相關系數方法分析。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 大鼠外周血清炎癥因子、血小板線粒體通透性轉變孔、跨膜電位、ATP水平的變化
大鼠CLP模型中，結扎程度越長，24 h后外周血清炎癥因子水平越高，結果見表 1。而膿毒癥的嚴重程度對血小板線粒體ATP水平、Calcein熒光強度、ΔΨm有影響，結果見表 2。
表1
不同結扎程度實驗大鼠血清炎癥因子水平(n=10，pg/mL，
表2
不同結扎程度實驗大鼠血小板線粒體ATP、Calcein熒光強度及ΔΨm(n=10，二 膿毒癥患者外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的相關性
外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的秩次呈負相關關系(Spearman相關系數r=－0.895，P<0.05)，結果見表 3和圖 1。
表3
膿毒癥患者外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的秩次
圖1
ATP與APACHEⅡ評分的秩次散點分布圖
討論
膿毒癥的發病機制十分復雜，包括細胞炎癥因子、凝血因子、血管活性物質等介質的釋放[6]。本研究的動物實驗發現，隨著CLP程度的加重，大量活化的炎癥細胞經過持續放大的級聯反應產生大量的炎癥介質，大鼠外周血血小板ATP水平下降，跨膜電位減低，通透性轉變孔開放增加。這些變化說明了血小板線粒體的功能和CLP嚴重程度有關。隨后的臨床試驗發現血小板ATP水平與APACHEⅡ評分呈負相關。這兩方面的結果支持血小板線粒體功能可作為臨床膿毒癥嚴重程度的一個有效監測指標。
線粒體ATP水平可以間接反映細胞內能量代謝，研究表明氧化應激模型的細胞中線粒體膜電位下降[7]。膿毒癥早期，盡管線粒體功能降低，仍可維持ATP水平的平衡[8]。但是隨著病情的發展，膿毒癥持續時間過長，機體ATP合成發生了失代償甚至耗竭，引起線粒體不可逆性轉變，如通透性轉變孔開放，線粒體結構破壞繼而細胞壞死，導致廣泛的組織甚至器官損傷。因此，ATP下降往往提示膿毒癥的預后很差[9]。
血小板是外周血中對理化因素最為靈敏的指標之一，血小板的減少在彌散性血管內凝血的發展過程，尤其是繼發性纖溶系統亢進中發揮著重要作用[10]。研究表明膿毒癥患者的血小板計數與死亡風險呈負相關關系[11]，線粒體氧代謝和利用障礙氧化呼吸鏈受到破壞，氧分子供給量減少[11-12]，線粒體電子遺失增加，細胞內能量代謝陷入惡性循環[13]。
本研究證實，在膿毒癥發展過程中，血小板線粒體功能不全與膿毒癥嚴重程度密切相關。一方面，線粒體發生了器質性變化，如線粒體膜結構受損，通透性轉變孔開放，引起離子紊亂，打破線粒體內穩態平衡，而線粒體基質腫脹引起膜間蛋白如細胞色素C等釋放入胞漿，引起膜電位去極化，ΔΨm增加；另一方面，由于炎癥和應激等因素，氧自由基的大量釋放，攻擊線粒體膜上的功能蛋白，干擾氧化呼吸鏈正常運轉，引起ATP合成效率降低并進行性耗竭。
綜上所述，血小板線粒體功能檢測可以作為判斷膿毒癥嚴重程度、預后的有效指標。
作為多器官功能障礙綜合征(MODS)的一個重要的致病原因，膿毒癥的研究不斷受到關注，但是其具體病理生理學機制尚未明確[1]。研究表明在重度膿毒癥中細胞內存在氧利用障礙，引起能量代謝水平降低，繼而引起廣泛的組織甚至器官損傷[2]。線粒體是細胞代謝中氧化磷酸化的主要場所，在膿毒癥的發生、發展與轉歸中有重要作用[3]。因此，本研究從動物模型和臨床病例標本兩個方面，以線粒體為靶點，探討并驗證外周血小板線粒體功能與膿毒癥預后的關系，以期為膿毒癥的監測與治療提供新思路。
材料與方法
一 動物實驗
1．主要實驗材料：成年雄性SD大鼠40只，SPF級，體重(250±20)g，動物學實驗操作符合生命倫理學規范。Calcein-AM(美國Invitrogen公司)，CoCl2(美國Sigma公司)，熒光素-熒光素酶試劑盒(美國Promega公司)，JC-1線粒體膜電位試劑盒(美國Invitrogen公司)，Percoll液(美國通用電氣公司)。
2．動物處理方法：采用133 g/L烏拉坦+5 g/L氯醛糖按0.65 mL/kg腹腔麻醉動物后，將40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組(A組、B組、C組)和假手術組(D組)，每組10只。模型組參照Rittirsch等[4]的方法，以盲腸穿孔結扎術(CLP)復制大鼠膿毒癥模型，按照結扎部分占盲腸總長度的比例(10%、30%、50%)，采用不同結扎長度復制不同程度膿毒癥模型，即分為A組、B組、C組，統一于術后24 h采集血樣。假手術組(D組)僅開腹分離盲腸并原路縫合，不予穿孔結扎。
3．血清炎癥因子水平檢測：CLP術后造成嚴重的腹腔感染，用5 mL注射器緩慢抽血約3 mL置于5 mL離心管中，靜置約60 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清，以ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6等重要的促炎細胞因子，按照說明書倍比稀釋后30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值，根據標準曲線查出相應促炎因子含量。
4．血小板分離提純：模型組(A、B、C組)分別于術后24 h經腹主動脈插管采血2 mL，假手術組(D組)采血2 mL，干燥采血管中加入50 U/mL肝素抗凝。用9 g/L的鹽水等倍稀釋后，經Percoll(1.06 g/mL)密度梯度離心法(20℃，2 000 r/min，7 min)取F2白色絮狀層，PBS冷凍洗滌3遍以上即得到分離純化的血小板。
5．血小板線粒體通透性轉變孔的檢測：在細胞正常狀態時，Calcein可進入線粒體內發出綠色強熒光，僅在細胞線粒體膜受損后，通透性轉變孔開放的情況下，CoCl2可進入線粒體內淬滅該熒光。因此，該技術可用于判斷細胞內線粒體通透性轉變孔的開放程度，間接判斷線粒體是否損傷。以Calcein-AM與CoCl2共同孵育血小板15 min，冷凍PBS洗滌后，采用流式細胞儀(BD Facs verse)進行定量檢測，以細胞平均綠色熒光強度衡量線粒體通透性轉變孔的狀態。
6．血小板線粒體跨膜電位檢測：采用JC-1染色方法鑒定細胞內線粒體跨膜電位ΔΨm的變化。以JC-1孵育血小板15 min后，PBS冷凍洗滌，采用流式細胞儀進行定量檢測，以綠色熒光(低ΔΨm細胞)所占百分比衡量血小板線粒體去極化的百分數。
7．血小板線粒體內三磷酸腺苷(ATP)含量檢測：以熒光素-熒光素酶法檢測血小板線粒體ATP水平，血小板懸液(2×106/mL)與檢測試劑等比混合，室溫孵育15 min，采用Spectra Max M5酶標儀檢測熒光強度(RLU)。
二 臨床試驗
1．一般資料收集：收集南方醫科大學附屬第三醫院重癥醫學科2012年至2013年期間入院膿毒癥患者外周血樣。根據美國胸科醫師學會/危重病醫學會的膿毒癥診斷標準[5]，篩選符合標準的29例膿毒癥患者(男19例，女10例)。患者入院前2周內均未服用阿司匹林、肝素等影響血小板功能的藥物，無血液病、惡性腫瘤等病史。按照急性生理學和慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)進行評分，其中≥20分有9例，11~19分有8例，≤10分有12例。該研究經患者知情同意，并經醫院倫理委員會批準。
2．樣品處理：將新鮮血樣肝素抗凝處理，Percoll密度梯度離心法提取純化血小板，混懸液(2×106/mL)加入96孔板，以PBS作為陰性對照，用熒光素-熒光素酶法檢測熒光強度。
三 統計學處理
采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。4組大鼠的相關數據的比較采用多個樣本均數間的多重比較檢驗分析，即One-way ANOVA檢驗。病例的相關數據以Spearman積差相關系數方法分析。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 大鼠外周血清炎癥因子、血小板線粒體通透性轉變孔、跨膜電位、ATP水平的變化
大鼠CLP模型中，結扎程度越長，24 h后外周血清炎癥因子水平越高，結果見表 1。而膿毒癥的嚴重程度對血小板線粒體ATP水平、Calcein熒光強度、ΔΨm有影響，結果見表 2。
表1
不同結扎程度實驗大鼠血清炎癥因子水平(n=10，pg/mL，
表2
不同結扎程度實驗大鼠血小板線粒體ATP、Calcein熒光強度及ΔΨm(n=10，二 膿毒癥患者外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的相關性
外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的秩次呈負相關關系(Spearman相關系數r=－0.895，P<0.05)，結果見表 3和圖 1。
表3
膿毒癥患者外周血小板線粒體ATP水平與APACHEⅡ評分的秩次
圖1
ATP與APACHEⅡ評分的秩次散點分布圖
討論
膿毒癥的發病機制十分復雜，包括細胞炎癥因子、凝血因子、血管活性物質等介質的釋放[6]。本研究的動物實驗發現，隨著CLP程度的加重，大量活化的炎癥細胞經過持續放大的級聯反應產生大量的炎癥介質，大鼠外周血血小板ATP水平下降，跨膜電位減低，通透性轉變孔開放增加。這些變化說明了血小板線粒體的功能和CLP嚴重程度有關。隨后的臨床試驗發現血小板ATP水平與APACHEⅡ評分呈負相關。這兩方面的結果支持血小板線粒體功能可作為臨床膿毒癥嚴重程度的一個有效監測指標。
線粒體ATP水平可以間接反映細胞內能量代謝，研究表明氧化應激模型的細胞中線粒體膜電位下降[7]。膿毒癥早期，盡管線粒體功能降低，仍可維持ATP水平的平衡[8]。但是隨著病情的發展，膿毒癥持續時間過長，機體ATP合成發生了失代償甚至耗竭，引起線粒體不可逆性轉變，如通透性轉變孔開放，線粒體結構破壞繼而細胞壞死，導致廣泛的組織甚至器官損傷。因此，ATP下降往往提示膿毒癥的預后很差[9]。
血小板是外周血中對理化因素最為靈敏的指標之一，血小板的減少在彌散性血管內凝血的發展過程，尤其是繼發性纖溶系統亢進中發揮著重要作用[10]。研究表明膿毒癥患者的血小板計數與死亡風險呈負相關關系[11]，線粒體氧代謝和利用障礙氧化呼吸鏈受到破壞，氧分子供給量減少[11-12]，線粒體電子遺失增加，細胞內能量代謝陷入惡性循環[13]。
本研究證實，在膿毒癥發展過程中，血小板線粒體功能不全與膿毒癥嚴重程度密切相關。一方面，線粒體發生了器質性變化，如線粒體膜結構受損，通透性轉變孔開放，引起離子紊亂，打破線粒體內穩態平衡，而線粒體基質腫脹引起膜間蛋白如細胞色素C等釋放入胞漿，引起膜電位去極化，ΔΨm增加；另一方面，由于炎癥和應激等因素，氧自由基的大量釋放，攻擊線粒體膜上的功能蛋白，干擾氧化呼吸鏈正常運轉，引起ATP合成效率降低并進行性耗竭。
綜上所述，血小板線粒體功能檢測可以作為判斷膿毒癥嚴重程度、預后的有效指標。
