引用本文： 高俊杰, 張為忠, 紀霞, 李云霄. 瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性在哮喘發病中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(6): 584-587. doi: 10.7507/1671-6205.2014142 復制
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種由多種炎癥細胞和炎癥因子介導的慢性氣道炎癥性疾病。近年來研究表明瘦素作為一種促炎因子，在哮喘的發生與發展過程中具有重要作用。瘦素通過和瘦素受體結合發揮其生物學作用，瘦素受體編碼基因的突變可能會影響瘦素的生物學功能，從而導致瘦素抵抗。研究表明瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性與2型糖尿病、高血壓病、脂肪肝等多種疾病的發生有關，但其和哮喘之間的關系罕見報道。為此，我們通過研究哮喘患者和健康人群瘦素受體基因Gln223Arg位點基因多態性并測定其血清瘦素濃度，旨從分子水平上探討哮喘的發病機制。
對象與方法
一 對象
研究對象分為哮喘組和健康對照組。所有入組者均排除糖尿病、心血管、肝、腎等疾病，且計算體重指數(BMI)于18.5~23.9 kg/m2 之間。其中哮喘組185例，為2009年7月至2012年5月于青島市市立醫院住院或門診就診的哮喘患者，均符合中華醫學會呼吸病學會2008年頒布的《支氣管哮喘防治指南》中哮喘的診斷標準。對照組207例，均為健康志愿者，無過敏性哮喘及其他過敏性疾病病史。所有參加本研究者均簽署知情同意書。本試驗符合1983年頒布的赫爾辛基宣言，獲青島市市立醫院倫理委員會批準。
二 方法
1.標本收集：所有研究對象均留取空腹靜脈血4 mL，用EDTA-K2抗凝，分離血漿和血細胞。應用DNA提取試劑盒(Promega公司，美國)從血細胞中提取基因組DNA。提取后的DNA應用微量核酸蛋白測定儀(NanoVue超微量分光光度計，英國)進行定性、定量分析，若OD260/OD280＞1.8，則DNA純度合格。定量后的DNA和血漿均置于-80 ℃冰箱保存備用。
2.引物合成：聚合酶鏈反應(PCR)的引物設計參照Genebank中提供的基因組序列設計合成，上游引物序列為：5′-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAA TAG-3′，下游引物序列為：5′-AGCTAGCAAATATTT TTGTAAGAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
3.PCR擴增：PCR反應體系總體積25 μL，包括基因組DNA 2 μL，10×反應緩沖液2.5 μL，前、后引物各1 μL，MgCl2 (2.0 mmol/L)1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，dNTPs 0.5 μL(試劑為美國Fermentas公司產品)，以滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后按95 ℃變性45 s、48 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，總共循環35次，最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
4.擴增產物限制性片段長度多態性酶切分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)：總反應體系31 μL，包括10×反應緩沖液2 μL、MspI內切酶1 μL、無核酸水18 μL和擴增產物10 μL，置37 ℃金屬浴中反應5 min。反應終止后，產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-500DNA片段長度為參考標準，使用全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)觀察酶切后的產物電泳情況并拍照保存。
5.血漿瘦素濃度檢測：采用酶聯免疫吸附(ELISA)法，測定血漿瘦素濃度(R&D，美國)。儀器采用BIO-RAD Model 680型酶標儀。
三 統計學處理
計算各組基因型頻率及等位基因頻率，并確認其是否符合Hardy Weinberg平衡；各組基因型頻率及等位基因頻率比較用χ2檢驗，并以優勢比(OR)及其95%可信區間(CI)表示相對風險度。各組瘦素濃度比較采用獨立樣本t檢驗。以上數據應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據采用
結果
一 一般資料
哮喘組與健康組納入對象的年齡、性別及BMI比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，提示兩組具有可比性。結果見表 1。
表1
兩組研究對象的一般資料比較(二 瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性
瘦素受體基因Gln223Arg區域PCR產物片段大小為421 bp，經限制性內切酶MspI酶切后，得到3種基因型：在421 bp處有1條電泳帶為AA型；在128和293 bp處有2條電泳帶為GG型；在128、293和421 bp處有3條電泳帶為GA型 (圖 1)。
圖1
瘦素受體基因Gln223Arg位點PCR-RFLP圖譜
1：基因型AA；2：基因型GA；3：基因型GG；L：DL-500DNA ladder
三 遺傳平衡性檢驗
采用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，健康組與哮喘組該位點基因型和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。
四 瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率比較
哮喘組3種基因型GG、GA、AA的比例分別為80.54%、17.84%和1.62%，健康組分別為68.6%、29.47%和1.93%，兩組之間GG基因型和GA+AA基因型存在差異，其中GG基因型患哮喘的風險較高，為GA+AA基因型的1.895倍 (χ2=7.283，P=0.007，OR=1.895，95%CI 1.187~3.024)。哮喘組等位基因G和A頻率分別為89.46%和10.54%，健康組分別為83.33%和16.67%，哮喘組G等位基因頻率顯著高于健康組，差異有統計學意義 (χ2= 6.173，P=0.013，OR=1.697，95%CI 1.115~2.585)。結果見表 2。
表2
兩組研究對照瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率比較[例(%)]
五 GG基因型和GA+AA基因型血漿瘦素濃度比較
GG基因型血漿瘦素濃度為(2.56±1.47) ng/mL，GA+AA基因型血漿瘦素濃度為(2.16±1.66) ng/mL，兩組比較差異有統計學意義(t=2.256，P=0.025)。結果見圖 2。
圖2
GA+AA基因型和GG基因型血漿瘦素濃度
討論
哮喘是一種多基因遺傳性疾病，其發病機制十分復雜，涉及氧化應激和多種細胞因子、炎癥介質、免疫活性細胞、細胞表面分子等的調節[1]。瘦素是由脂肪細胞分泌的一種多肽類促炎激素，其在感染和炎癥刺激下產生增多，進而刺激單核細胞和巨噬細胞產生炎癥因子，使炎癥反應放大。研究資料顯示，哮喘患者血清瘦素濃度較健康人明顯升高[2]，瘦素在哮喘中的作用逐漸受到人們重視。研究表明，瘦素可以增加氣道高反應性、加重氣道炎癥以及調節Th1/Th2細胞反應[3-5]，進而誘發哮喘發病。
瘦素通過與瘦素受體結合而發揮其生物學功能。瘦素受體屬于Ⅰ類細胞因子超家族，廣泛分布于下丘腦、大腦脈絡叢、脂肪組織、胰島細胞、心臟、腎、脾、肝等，在人和小鼠肺部支氣管和肺泡上皮細胞亦有瘦素受體表達。瘦素受體基因定位于人染色體1p31，包含19個內含子和20個外顯子，其中在第6外顯子223位核苷酸存在A→G(Gln223Arg)替換多態性。本研究顯示，GG基因型組血清瘦素濃度顯著高于AA+GA基因型組，兩者相比具有統計學意義。有研究發現，該基因多態性位點編碼的氨基酸位于瘦素受體細胞外區的瘦素結合位點，發生核苷酸替換后，編碼的氨基酸由原來的谷氨酸轉變為精氨酸，并且該位點的帶電性由中性變為正電性，這一變化可能會影響瘦素受體和瘦素的結合，并干擾結合后的信號傳導通路[6-8]，從而導致瘦素抵抗，引起血清瘦素濃度反饋性升高。另外，我們對哮喘組和健康組進行該位點的基因多態性檢測結果顯示，健康組和哮喘組均有AA、AG和GG 3種基因型，其中以AA基因型頻率最低、GG基因型最高；哮喘組和健康組之間GG基因型和GA+AA基因型存在差異，GG基因型患哮喘的風險為GA+AA基因型的1.895；哮喘組G等位基因頻率也顯著高于健康組(χ2=6.173，P=0.013，OR=1.697，95%CI 1.115~2.585)，提示該位點G等位基因可能是哮喘的遺傳易感因子，GG基因型攜帶者哮喘的患病風險增加。由此我們發現了一個有趣結果：存在受體功能缺陷的GG基因型哮喘的發病率反而增高，瘦素抵抗現象在肺組織及哮喘的發病過程中似乎并未得到體現。對此我們提出以下3種可能：(1)肺組織內還存在其他未知種類的瘦素受體，瘦素通過與這種受體結合誘發哮喘發生；(2)瘦素通過其 他未知的非受體途徑誘發哮喘發生；(3)瘦素可能通過影響其他炎癥介質的產生從而間接誘導哮喘的發病。
哮喘的發病機制復雜，受多基因和多種環境因素影響。瘦素作為一種促炎激素，在哮喘發病中的作用逐漸受到人們重視。但瘦素究竟通過什么途徑和機制誘導哮喘的發生？肺組織內是否還存在其他特殊類型的瘦素受體？對此我們將進行進一步研究，從分子層面上闡明哮喘的發病機制，為哮喘早期診斷和及時干預治療奠定理論基礎。
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種由多種炎癥細胞和炎癥因子介導的慢性氣道炎癥性疾病。近年來研究表明瘦素作為一種促炎因子，在哮喘的發生與發展過程中具有重要作用。瘦素通過和瘦素受體結合發揮其生物學作用，瘦素受體編碼基因的突變可能會影響瘦素的生物學功能，從而導致瘦素抵抗。研究表明瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性與2型糖尿病、高血壓病、脂肪肝等多種疾病的發生有關，但其和哮喘之間的關系罕見報道。為此，我們通過研究哮喘患者和健康人群瘦素受體基因Gln223Arg位點基因多態性并測定其血清瘦素濃度，旨從分子水平上探討哮喘的發病機制。
對象與方法
一 對象
研究對象分為哮喘組和健康對照組。所有入組者均排除糖尿病、心血管、肝、腎等疾病，且計算體重指數(BMI)于18.5~23.9 kg/m2 之間。其中哮喘組185例，為2009年7月至2012年5月于青島市市立醫院住院或門診就診的哮喘患者，均符合中華醫學會呼吸病學會2008年頒布的《支氣管哮喘防治指南》中哮喘的診斷標準。對照組207例，均為健康志愿者，無過敏性哮喘及其他過敏性疾病病史。所有參加本研究者均簽署知情同意書。本試驗符合1983年頒布的赫爾辛基宣言，獲青島市市立醫院倫理委員會批準。
二 方法
1.標本收集：所有研究對象均留取空腹靜脈血4 mL，用EDTA-K2抗凝，分離血漿和血細胞。應用DNA提取試劑盒(Promega公司，美國)從血細胞中提取基因組DNA。提取后的DNA應用微量核酸蛋白測定儀(NanoVue超微量分光光度計，英國)進行定性、定量分析，若OD260/OD280＞1.8，則DNA純度合格。定量后的DNA和血漿均置于-80 ℃冰箱保存備用。
2.引物合成：聚合酶鏈反應(PCR)的引物設計參照Genebank中提供的基因組序列設計合成，上游引物序列為：5′-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAA TAG-3′，下游引物序列為：5′-AGCTAGCAAATATTT TTGTAAGAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
3.PCR擴增：PCR反應體系總體積25 μL，包括基因組DNA 2 μL，10×反應緩沖液2.5 μL，前、后引物各1 μL，MgCl2 (2.0 mmol/L)1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，dNTPs 0.5 μL(試劑為美國Fermentas公司產品)，以滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后按95 ℃變性45 s、48 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，總共循環35次，最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。
4.擴增產物限制性片段長度多態性酶切分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)：總反應體系31 μL，包括10×反應緩沖液2 μL、MspI內切酶1 μL、無核酸水18 μL和擴增產物10 μL，置37 ℃金屬浴中反應5 min。反應終止后，產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-500DNA片段長度為參考標準，使用全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)觀察酶切后的產物電泳情況并拍照保存。
5.血漿瘦素濃度檢測：采用酶聯免疫吸附(ELISA)法，測定血漿瘦素濃度(R&D，美國)。儀器采用BIO-RAD Model 680型酶標儀。
三 統計學處理
計算各組基因型頻率及等位基因頻率，并確認其是否符合Hardy Weinberg平衡；各組基因型頻率及等位基因頻率比較用χ2檢驗，并以優勢比(OR)及其95%可信區間(CI)表示相對風險度。各組瘦素濃度比較采用獨立樣本t檢驗。以上數據應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據采用
結果
一 一般資料
哮喘組與健康組納入對象的年齡、性別及BMI比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，提示兩組具有可比性。結果見表 1。
表1
兩組研究對象的一般資料比較(二 瘦素受體基因Gln223Arg位點多態性
瘦素受體基因Gln223Arg區域PCR產物片段大小為421 bp，經限制性內切酶MspI酶切后，得到3種基因型：在421 bp處有1條電泳帶為AA型；在128和293 bp處有2條電泳帶為GG型；在128、293和421 bp處有3條電泳帶為GA型 (圖 1)。
圖1
瘦素受體基因Gln223Arg位點PCR-RFLP圖譜
1：基因型AA；2：基因型GA；3：基因型GG；L：DL-500DNA ladder
三 遺傳平衡性檢驗
采用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣本的群體代表性，健康組與哮喘組該位點基因型和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。
四 瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率比較
哮喘組3種基因型GG、GA、AA的比例分別為80.54%、17.84%和1.62%，健康組分別為68.6%、29.47%和1.93%，兩組之間GG基因型和GA+AA基因型存在差異，其中GG基因型患哮喘的風險較高，為GA+AA基因型的1.895倍 (χ2=7.283，P=0.007，OR=1.895，95%CI 1.187~3.024)。哮喘組等位基因G和A頻率分別為89.46%和10.54%，健康組分別為83.33%和16.67%，哮喘組G等位基因頻率顯著高于健康組，差異有統計學意義 (χ2= 6.173，P=0.013，OR=1.697，95%CI 1.115~2.585)。結果見表 2。
表2
兩組研究對照瘦素受體基因Gln223Arg位點基因型和等位基因分布頻率比較[例(%)]
五 GG基因型和GA+AA基因型血漿瘦素濃度比較
GG基因型血漿瘦素濃度為(2.56±1.47) ng/mL，GA+AA基因型血漿瘦素濃度為(2.16±1.66) ng/mL，兩組比較差異有統計學意義(t=2.256，P=0.025)。結果見圖 2。
圖2
GA+AA基因型和GG基因型血漿瘦素濃度
討論
哮喘是一種多基因遺傳性疾病，其發病機制十分復雜，涉及氧化應激和多種細胞因子、炎癥介質、免疫活性細胞、細胞表面分子等的調節[1]。瘦素是由脂肪細胞分泌的一種多肽類促炎激素，其在感染和炎癥刺激下產生增多，進而刺激單核細胞和巨噬細胞產生炎癥因子，使炎癥反應放大。研究資料顯示，哮喘患者血清瘦素濃度較健康人明顯升高[2]，瘦素在哮喘中的作用逐漸受到人們重視。研究表明，瘦素可以增加氣道高反應性、加重氣道炎癥以及調節Th1/Th2細胞反應[3-5]，進而誘發哮喘發病。
瘦素通過與瘦素受體結合而發揮其生物學功能。瘦素受體屬于Ⅰ類細胞因子超家族，廣泛分布于下丘腦、大腦脈絡叢、脂肪組織、胰島細胞、心臟、腎、脾、肝等，在人和小鼠肺部支氣管和肺泡上皮細胞亦有瘦素受體表達。瘦素受體基因定位于人染色體1p31，包含19個內含子和20個外顯子，其中在第6外顯子223位核苷酸存在A→G(Gln223Arg)替換多態性。本研究顯示，GG基因型組血清瘦素濃度顯著高于AA+GA基因型組，兩者相比具有統計學意義。有研究發現，該基因多態性位點編碼的氨基酸位于瘦素受體細胞外區的瘦素結合位點，發生核苷酸替換后，編碼的氨基酸由原來的谷氨酸轉變為精氨酸，并且該位點的帶電性由中性變為正電性，這一變化可能會影響瘦素受體和瘦素的結合，并干擾結合后的信號傳導通路[6-8]，從而導致瘦素抵抗，引起血清瘦素濃度反饋性升高。另外，我們對哮喘組和健康組進行該位點的基因多態性檢測結果顯示，健康組和哮喘組均有AA、AG和GG 3種基因型，其中以AA基因型頻率最低、GG基因型最高；哮喘組和健康組之間GG基因型和GA+AA基因型存在差異，GG基因型患哮喘的風險為GA+AA基因型的1.895；哮喘組G等位基因頻率也顯著高于健康組(χ2=6.173，P=0.013，OR=1.697，95%CI 1.115~2.585)，提示該位點G等位基因可能是哮喘的遺傳易感因子，GG基因型攜帶者哮喘的患病風險增加。由此我們發現了一個有趣結果：存在受體功能缺陷的GG基因型哮喘的發病率反而增高，瘦素抵抗現象在肺組織及哮喘的發病過程中似乎并未得到體現。對此我們提出以下3種可能：(1)肺組織內還存在其他未知種類的瘦素受體，瘦素通過與這種受體結合誘發哮喘發生；(2)瘦素通過其 他未知的非受體途徑誘發哮喘發生；(3)瘦素可能通過影響其他炎癥介質的產生從而間接誘導哮喘的發病。
哮喘的發病機制復雜，受多基因和多種環境因素影響。瘦素作為一種促炎激素，在哮喘發病中的作用逐漸受到人們重視。但瘦素究竟通過什么途徑和機制誘導哮喘的發生？肺組織內是否還存在其他特殊類型的瘦素受體？對此我們將進行進一步研究，從分子層面上闡明哮喘的發病機制，為哮喘早期診斷和及時干預治療奠定理論基礎。
