引用本文： 鄒曰坤, 李毅, 薛青, 蔣富強, 張齊, 李彥波, 張春燕, 劉于紅. 血管緊張素轉化酶2在內毒素誘導大鼠急性肺損傷中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(5): 504-507. doi: 10.7507/1671-6205.2014122 復制
急性肺損傷(ALI)及其更嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床重癥常見的急性呼吸衰竭，以非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為主要臨床特征。近年來，針對其危險因素、發病機制、診斷和治療方面的研究已取得了長足的進展。但在治療方面，除機械通氣外，仍缺乏有效的藥物治療手段，是病死率高達50%的重要原因[1]。因此，積極探索有效治療ALI /ARDS的藥物就顯得非常迫切和重要。近年來，有國外學者[2]報道血管緊張素轉化酶2(ACE2)對肺損傷有保護作用，國內也可見類似報道[3]。目前該類研究多局限于動物模型，但何時用藥以取得良好效果，文獻中無共識。結合臨床中ALI最常見原因為感染導致，本實驗通過復制內毒素(LPS)誘導大鼠ALI模型，觀察早期給予ACE2藥物對ALI的治療效果，并試圖闡明其部分機制。
材料與方法
一 實驗動物及主要試劑
Wistar大鼠24只(由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供)，SPF級，雌雄不拘，體重160～180 g；脂多糖(LPS，Escherichia coli O55:B5，Sigma公司，美國)；重組大鼠ACE2(rmACE2，美國R＆D公司生產)；大鼠TNF-α、IL-8、IL-1β酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物公司生產)。
二 方法
1．動物模型建立：Wistar大鼠按隨機數字表法分為對照組、ALI組和ALI+ACE2組(ACE2)組。每組各8只大鼠。ALI組ACE2組大鼠接受頸靜脈注射LPS 6 mg/kg。對照組接受等容量生理鹽水注射。ACE2組在接受LPS注射后立即予重組大鼠ACE2腹腔內注射，注射劑量參照文獻[3-4]，為0.1 mg/kg。對照組及ALI組只接受等容量的生理鹽水腹腔注射。
2．標本采集：給予處理因素后2 h，于大鼠右頸動脈處抽取動脈血0.5 mL送檢。隨后處死大鼠，開胸取全肺。肺組織處理如下：①留取右中肺組織，4%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色；②留取右肺后葉，于4℃冰箱保存，待檢測TNF-α、IL-8、IL-1β；③左肺首先稱濕質量(W)，然后置于80℃烘箱內干燥72 h至恒重，稱肺干質量(D)，計算肺濕干重比(W/D)。
3．檢測指標:①血氣分析：ABL-Ⅲ型血氣分析儀測定頸動脈血pH、PaO2、PaCO2三項指標。②肺組織含水量測定：采用濕干重稱重法測定。左肺稱干濕重，以W/D表示肺組織含水量。③細胞因子濃度測定：各組待檢大鼠肺組織，以冰生理鹽水沖洗除去血液后，濾紙吸干。電子秤取肺組織3 g，于冰RIPA裂解液中剪碎，4℃，600×g離心10 min，棄沉淀；取上清35 000×g再離心20 min。留取沉淀于適量緩沖液中，蛋白含量調整至2g/L。采用ELISA法測定TNF-α、IL-8、IL-1β，步驟參照ELISA試劑盒說明書進行。
4．肺組織病理學檢查及半定量評分：光鏡下觀察肺組織病理形態學改變，參照Mikawar等[4]的方法以4項指標進行半定量評分：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。各指標分別據病變輕重評為0~4分。0分：無或極輕度病變；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：嚴重病變。4項指標評分總和為肺損傷的總評分，總分最多16分。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以
結果
一 血氣分析
ACE2組大鼠PaO2明顯低于對照組(65.55±3.51 vs 95.40±3.78，P < 0.05)，但較ALI組稍高(65.55±3.51 vs 51.44±2.70，P < 0.05)。三組pH值PaCO2差異無統計學意義。結果見表 1。
表1
各組大鼠血氣指標比較(n=8)
二 肺組織W/D比值
ACE2組大鼠肺組織W/D比值明顯低于ALI組(6.70±0.31 vs 8.45±0.28，P < 0.05)，但仍明顯高于對照組(6.70±0.31 vs 4.44±0.28，P < 0.05)。
三 肺組織勻漿中TNF-α、IL-8、IL-1β比較
ALI組和ACE2組肺組織勻漿上清中TNF-α、IL-8和IL-1β濃度均顯著高于對照組(P < 0.05)，ACE2干預后ACE2組TNF-α、IL-8和IL-1β濃度較ALI組均顯著降低(P < 0.05)，見表 2。
表2
各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8、IL-1β比較(n=8，pg/mL)
四 肺組織病理評分比較
各組大鼠肺組織病理鏡下表現見圖 1。對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡間隔均勻一致，肺泡腔中無滲出。ALI組大鼠肺組織可見彌漫性的肺泡壁破壞，透明膜形成，肺間質大量炎細胞浸潤與出血、水腫，血管床不同程度破壞。ACE2組大鼠也存在上述病理改變，但出血程度略輕于ALI組。ALI組和ACE2組大鼠肺組織病理評分分別為14.23±1.56和11.57±1.27，二者均顯著高于對照組1.02±0.11(P < 0.05)，ACE2組大鼠肺組織病理評分與ALI組比較無明顯統計學差異。(P > 0.05)
圖1
ACE2干預對LPS誘導的ALI大鼠肺組織病理損傷的影響(HE×200)
a.對照組；b.ALI組；c.ACE2組
討論
LPS感染是導致肺損傷最主要的危險因素[5]。本實驗中, LPS誘導大鼠在術后2 h出現明顯的ALI/ARDS改變，血氣分析和W /D、肺組織病理，均符合典型的肺損傷特征，動物模型復制成功。
腎素-血管緊張素(RAS)系統是調節血壓、水鹽代謝的最重要的生物活性系統之一，由于其新成員、新受體和新藥物的不斷發現, 至今RAS仍然備受關注。RAS主要成分包括血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)、和AngⅡ。ACE將AngⅠ轉化為AngⅡ, AngⅡ是RAS系統的主要效應蛋白，通過AT1和AT2受體發揮作用。AngⅡ具有促炎、收縮血管等作用。肺組織局部AngⅡ水平升高時，能導致肺部持續過度的炎癥反應，引發ARDS。同時通過組織重構、肺血管收縮等導致肺纖維化及肺動脈高壓，促進ARDS發生發展。ACE2是近年發現的ACE的一個重要的同源物[6]，兩者的催化區序列雖然相似，但功能卻明顯不同。ACE2在RAS中的作用可能與ACE相反，ACE2將AngⅡ水解為Ang-(1-7)，并且這種作用不被ACEI所阻斷。Ang-(1-7)作為AngⅡ的內源性拮抗劑，可能通過調節RAS平衡，抑制炎癥、降低纖維增生等途徑減輕ARDS過程中的肺組織損傷。國外研究顯示，重組ACE2在ALI/ARDS豬動物模型中可降低肺動脈壓、改善氧合及通氣／血流比值[7]。本實驗中也發現，予補充ACE2后，大鼠動脈血氧和水平明顯好于ALI組。
McCarter等[8]發現使用Ang-1治療ALI，可明顯減輕炎癥，降低肺W/D比值。而Imai等[9]也發現，給予ACE2后，ace2基因敲除鼠的肺損傷情況如：肺水腫、血管滲出，炎細胞聚集等，均出現明顯好轉。本實驗觀察到予外源性的ACE2干預后，大鼠肺內出血及肺泡間隔增厚情況稍有改善，肺W/D比值降低，但肺泡充血及炎細胞浸潤情況無明顯改善，總體肺組織病理評分較未干預組也無明顯好轉。推測其可能原因：1)通過補充外源性ACE2來促進Ang-(1-7)的合成或外源性補充Ang-(I-7)，能部分減輕肺損傷炎癥反應，但ALI機制復雜，非單一藥物、單一通路可以逆轉；2)ALI時ACE2表達下調[10]，并可能與炎癥程度相關，本實驗所用重組ACE2劑量不足或注射時間過晚，導致病理形態改善效果不明顯。
細胞因子是促進全身炎性反應過程的重要物質，促進了ALI的形成和發展。早期合理干預，控制過度的炎癥反應，可以進一步保護肺組織的損傷程度。在該研究中，ACE2干預后，ALI大鼠肺組織中炎癥因子表達，包括TNF-α、IL-8和IL-1β，均有下調。其原因可能是ACE2通過促進Ang-(1-7)的生成，抑制NF-κB的活性以及前列腺素和一氧化氮等物質的釋放抑制炎癥反應；下調NF-κB通路下游關鍵基因的反應性，使NF-κB下游的促炎因子基因表達明顯下降[11]。但病理學檢查顯示炎細胞浸潤無明顯改善，考慮與促炎因子較多[12]，或NF-α、IL-8和IL-1β表達雖下調，但仍不足以造成組織大體形態的改變。
總之，ACE2對于治療ALI可能是有益的，但如何達到最佳的臨床效果，包括用藥時間、劑量、頻次，及通過對其作用機制的深入研究，探討與其他治療藥物的聯合治療反應，仍值得繼續深入研究。
急性肺損傷(ALI)及其更嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床重癥常見的急性呼吸衰竭，以非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為主要臨床特征。近年來，針對其危險因素、發病機制、診斷和治療方面的研究已取得了長足的進展。但在治療方面，除機械通氣外，仍缺乏有效的藥物治療手段，是病死率高達50%的重要原因[1]。因此，積極探索有效治療ALI /ARDS的藥物就顯得非常迫切和重要。近年來，有國外學者[2]報道血管緊張素轉化酶2(ACE2)對肺損傷有保護作用，國內也可見類似報道[3]。目前該類研究多局限于動物模型，但何時用藥以取得良好效果，文獻中無共識。結合臨床中ALI最常見原因為感染導致，本實驗通過復制內毒素(LPS)誘導大鼠ALI模型，觀察早期給予ACE2藥物對ALI的治療效果，并試圖闡明其部分機制。
材料與方法
一 實驗動物及主要試劑
Wistar大鼠24只(由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供)，SPF級，雌雄不拘，體重160～180 g；脂多糖(LPS，Escherichia coli O55:B5，Sigma公司，美國)；重組大鼠ACE2(rmACE2，美國R＆D公司生產)；大鼠TNF-α、IL-8、IL-1β酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物公司生產)。
二 方法
1．動物模型建立：Wistar大鼠按隨機數字表法分為對照組、ALI組和ALI+ACE2組(ACE2)組。每組各8只大鼠。ALI組ACE2組大鼠接受頸靜脈注射LPS 6 mg/kg。對照組接受等容量生理鹽水注射。ACE2組在接受LPS注射后立即予重組大鼠ACE2腹腔內注射，注射劑量參照文獻[3-4]，為0.1 mg/kg。對照組及ALI組只接受等容量的生理鹽水腹腔注射。
2．標本采集：給予處理因素后2 h，于大鼠右頸動脈處抽取動脈血0.5 mL送檢。隨后處死大鼠，開胸取全肺。肺組織處理如下：①留取右中肺組織，4%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色；②留取右肺后葉，于4℃冰箱保存，待檢測TNF-α、IL-8、IL-1β；③左肺首先稱濕質量(W)，然后置于80℃烘箱內干燥72 h至恒重，稱肺干質量(D)，計算肺濕干重比(W/D)。
3．檢測指標:①血氣分析：ABL-Ⅲ型血氣分析儀測定頸動脈血pH、PaO2、PaCO2三項指標。②肺組織含水量測定：采用濕干重稱重法測定。左肺稱干濕重，以W/D表示肺組織含水量。③細胞因子濃度測定：各組待檢大鼠肺組織，以冰生理鹽水沖洗除去血液后，濾紙吸干。電子秤取肺組織3 g，于冰RIPA裂解液中剪碎，4℃，600×g離心10 min，棄沉淀；取上清35 000×g再離心20 min。留取沉淀于適量緩沖液中，蛋白含量調整至2g/L。采用ELISA法測定TNF-α、IL-8、IL-1β，步驟參照ELISA試劑盒說明書進行。
4．肺組織病理學檢查及半定量評分：光鏡下觀察肺組織病理形態學改變，參照Mikawar等[4]的方法以4項指標進行半定量評分：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。各指標分別據病變輕重評為0~4分。0分：無或極輕度病變；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：嚴重病變。4項指標評分總和為肺損傷的總評分，總分最多16分。
三 統計學處理
采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以
結果
一 血氣分析
ACE2組大鼠PaO2明顯低于對照組(65.55±3.51 vs 95.40±3.78，P < 0.05)，但較ALI組稍高(65.55±3.51 vs 51.44±2.70，P < 0.05)。三組pH值PaCO2差異無統計學意義。結果見表 1。
表1
各組大鼠血氣指標比較(n=8)
二 肺組織W/D比值
ACE2組大鼠肺組織W/D比值明顯低于ALI組(6.70±0.31 vs 8.45±0.28，P < 0.05)，但仍明顯高于對照組(6.70±0.31 vs 4.44±0.28，P < 0.05)。
三 肺組織勻漿中TNF-α、IL-8、IL-1β比較
ALI組和ACE2組肺組織勻漿上清中TNF-α、IL-8和IL-1β濃度均顯著高于對照組(P < 0.05)，ACE2干預后ACE2組TNF-α、IL-8和IL-1β濃度較ALI組均顯著降低(P < 0.05)，見表 2。
表2
各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8、IL-1β比較(n=8，pg/mL)
四 肺組織病理評分比較
各組大鼠肺組織病理鏡下表現見圖 1。對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡間隔均勻一致，肺泡腔中無滲出。ALI組大鼠肺組織可見彌漫性的肺泡壁破壞，透明膜形成，肺間質大量炎細胞浸潤與出血、水腫，血管床不同程度破壞。ACE2組大鼠也存在上述病理改變，但出血程度略輕于ALI組。ALI組和ACE2組大鼠肺組織病理評分分別為14.23±1.56和11.57±1.27，二者均顯著高于對照組1.02±0.11(P < 0.05)，ACE2組大鼠肺組織病理評分與ALI組比較無明顯統計學差異。(P > 0.05)
圖1
ACE2干預對LPS誘導的ALI大鼠肺組織病理損傷的影響(HE×200)
a.對照組；b.ALI組；c.ACE2組
討論
LPS感染是導致肺損傷最主要的危險因素[5]。本實驗中, LPS誘導大鼠在術后2 h出現明顯的ALI/ARDS改變，血氣分析和W /D、肺組織病理，均符合典型的肺損傷特征，動物模型復制成功。
腎素-血管緊張素(RAS)系統是調節血壓、水鹽代謝的最重要的生物活性系統之一，由于其新成員、新受體和新藥物的不斷發現, 至今RAS仍然備受關注。RAS主要成分包括血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)、和AngⅡ。ACE將AngⅠ轉化為AngⅡ, AngⅡ是RAS系統的主要效應蛋白，通過AT1和AT2受體發揮作用。AngⅡ具有促炎、收縮血管等作用。肺組織局部AngⅡ水平升高時，能導致肺部持續過度的炎癥反應，引發ARDS。同時通過組織重構、肺血管收縮等導致肺纖維化及肺動脈高壓，促進ARDS發生發展。ACE2是近年發現的ACE的一個重要的同源物[6]，兩者的催化區序列雖然相似，但功能卻明顯不同。ACE2在RAS中的作用可能與ACE相反，ACE2將AngⅡ水解為Ang-(1-7)，并且這種作用不被ACEI所阻斷。Ang-(1-7)作為AngⅡ的內源性拮抗劑，可能通過調節RAS平衡，抑制炎癥、降低纖維增生等途徑減輕ARDS過程中的肺組織損傷。國外研究顯示，重組ACE2在ALI/ARDS豬動物模型中可降低肺動脈壓、改善氧合及通氣／血流比值[7]。本實驗中也發現，予補充ACE2后，大鼠動脈血氧和水平明顯好于ALI組。
McCarter等[8]發現使用Ang-1治療ALI，可明顯減輕炎癥，降低肺W/D比值。而Imai等[9]也發現，給予ACE2后，ace2基因敲除鼠的肺損傷情況如：肺水腫、血管滲出，炎細胞聚集等，均出現明顯好轉。本實驗觀察到予外源性的ACE2干預后，大鼠肺內出血及肺泡間隔增厚情況稍有改善，肺W/D比值降低，但肺泡充血及炎細胞浸潤情況無明顯改善，總體肺組織病理評分較未干預組也無明顯好轉。推測其可能原因：1)通過補充外源性ACE2來促進Ang-(1-7)的合成或外源性補充Ang-(I-7)，能部分減輕肺損傷炎癥反應，但ALI機制復雜，非單一藥物、單一通路可以逆轉；2)ALI時ACE2表達下調[10]，并可能與炎癥程度相關，本實驗所用重組ACE2劑量不足或注射時間過晚，導致病理形態改善效果不明顯。
細胞因子是促進全身炎性反應過程的重要物質，促進了ALI的形成和發展。早期合理干預，控制過度的炎癥反應，可以進一步保護肺組織的損傷程度。在該研究中，ACE2干預后，ALI大鼠肺組織中炎癥因子表達，包括TNF-α、IL-8和IL-1β，均有下調。其原因可能是ACE2通過促進Ang-(1-7)的生成，抑制NF-κB的活性以及前列腺素和一氧化氮等物質的釋放抑制炎癥反應；下調NF-κB通路下游關鍵基因的反應性，使NF-κB下游的促炎因子基因表達明顯下降[11]。但病理學檢查顯示炎細胞浸潤無明顯改善，考慮與促炎因子較多[12]，或NF-α、IL-8和IL-1β表達雖下調，但仍不足以造成組織大體形態的改變。
總之，ACE2對于治療ALI可能是有益的，但如何達到最佳的臨床效果，包括用藥時間、劑量、頻次，及通過對其作用機制的深入研究，探討與其他治療藥物的聯合治療反應，仍值得繼續深入研究。
