引用本文： 李小莉, 黃平, 杜秀芳. 慢性阻塞性肺疾病治療期間呼出氣冷凝液中8-異前列腺素、IL-6、IL-10的變化及與氣道炎癥的相關性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(5): 445-448. doi: 10.7507/1671-6205.2014110 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)嚴重影響患者的勞動能力和生活質量，近年其發病率與死亡率在世界范圍內均呈逐漸上升趨勢，日益受到關注。2009年慢性阻塞性肺疾病全球防治創議推薦使用沙美特羅/氟替卡松(50/500μg，bid)聯合治療重度、極重度穩定期慢阻肺患者。多中心研究表明聯合沙美特羅/氟替卡松(50/500μg，bid)治療可改善日常癥狀，改善生活質量，減緩第1秒用力呼氣容積(FEV1)的下降速率，改善肺功能，減少急性加重頻率，減少住院率，并可能降低慢阻肺死亡率[1-2]。但較少有研究對治療期間氣道炎癥改變情況進行探討，本研究擬應用呼出氣冷凝液(EBC)細胞因子動態變化觀察重度穩定期慢阻肺患者治療期間氣道炎癥變化情況，并結合肺功能、生活質量評分分析其臨床意義。
對象與方法
一 對象
收集2011年10月至2012年10月深圳市南山醫院呼吸科門診診斷符合慢阻肺穩定期患者24例及健康對照18例。穩定期慢阻肺患者中，男21例，女3例；年齡49~73歲，平均(61.5±7.6)歲；符合2007年中華醫學會呼吸病學分會制定的慢阻肺穩定期Ⅱ級以上診斷標準；均為非吸煙者(完全不吸煙或已經戒煙1年以上)；治療前2周無呼吸系統感染病史及糖皮質激素、抗生素治療。排除標準：年齡≤40歲；治療過程中出現病情急性加重者；患有慢阻肺以外的呼吸系統慢性疾病史、高血壓病、糖尿病、結締組織性疾病患者。健康對照中，男10例，女8例；年齡52~73歲，平均(61.3±6.6)歲；非吸煙者，經我院體檢科體檢胸片、心電圖、血常規、尿常規、肝腎功能、血糖、腫瘤12項、肺功能檢測無異常；詢問病史無心、腦、肺、腎等相關疾病及風濕性疾病。
二 方法
1．肺功能檢測：采用德國Jaeger公司肺功能儀，測定FEV1、用力肺活量(FVC)和FEV1/FVC。測定方法參考美國胸科學會的程序和標準。
2．EBC的收集和檢測：采用EBC收集裝置(Rtube，Respiratory Research，美國)收集EBC。收集EBC前受檢者用蒸餾水漱口3次。從－10℃冰箱中取出制冷鋁管，組裝成EBC收集器。受檢者取坐位，經口、平靜潮式呼吸，收集時間為10~15 min。收集EBC 1~2 mL，分裝EP管中，凍存于－80℃冰箱待測。
3．細胞因子測定：白細胞介素6(IL-6)、IL-10的檢測采用液相芯片技術，應用LuminexTM 100對樣本進行檢測及分析。該技術原理核心是將不同大小(4.5~7μm)或不同熒光染料染色的聚苯乙烯小球(統稱編碼微球)共價交聯上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。應用時把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯的分子進行特異性地結合，用流式細胞檢測類儀器進行分析，儀器通過兩束激光分別識別編碼微球和檢測微球上報告分子的熒光強度，最后用LuminexTM100進行分析，將熒光信號轉化為濃度。8-異前列腺素(8-iso-PG)的測定選用酶聯免疫吸附法(ELISA)中的競爭法。8-iso-PG和酶標8-iso-PG (8-iso-PG AchE Tracer)競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的Tracer量與受檢8-iso-PG的量成反比，后加入酶底物，溫育顯色測定OD值，計算濃度。以上操作均嚴格按照試劑說明書。
4．圣喬治呼吸問卷(SGRQ)評分：應用SGRQ評分評價慢性氣流受限疾病對生活質量的影響程度。問卷采用患者自我答題形式進行，共有50道題，分為呼吸癥狀、活動能力受限和疾病對日常生活的影響3個部分，患者自我答題，采用加權平均方法對3個部分分別計分，經過處理得出總分。分值范圍為0~100分，分值越低表示患者的癥狀越輕，活動受限越小，對日常生活的影響越小，生活質量也越好。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理。資料呈近似正態分布，結果用
結果
一 慢阻肺患者治療前后EBC中8-iso-PG、IL-6、IL-10的水平及肺功能、SGRQ的變化
治療前重度穩定期慢阻肺患者EBC中各細胞因子濃度水平均高于健康對照組。治療14 d后慢阻肺患者8-iso-PG較治療前顯著下降(P < 0.05)，但在治療后14~90 d保持低水平，各觀測點細胞因子水平比較差異無統計學意義(P > 0.05)。IL-6水平在治療28 d后較治療前顯著降低(P < 0.05)，但與治療90 d后比較差異無統計學意義(P > 0.05)。IL-10水平在治療90 d較治療28 d顯著升高(P < 0.05)。治療后肺功能FEV1、FVC、FEV1/FVC較治療前增加，SGRQ評分下降，治療前后比較差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 1。
表1
兩組各觀察點細胞因子、肺功能及SGRQ評分變化(pg/mL，二 相關性分析結果
相關性分析結果表明，FEV1與EBC中8-iso-PG、IL-6、IL-10水平均無顯著相關性。
討論
慢阻肺是在氣道炎癥與氧化應激共同作用下演變的，吸煙是慢阻肺發展的最主要因素。氣道炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞、CD8+淋巴細胞等在細菌、病毒、粉塵、煙霧等刺激下被激活，釋放炎癥介質和過氧化物質，導致氣道炎癥持續存在。氧化應激由氧化性物質及抗氧化性物質失衡引起。氧化性物質的過度產生損傷正常組織，并促進黏液產生和減弱纖毛清除黏液的功能，加劇氣道及肺部實質的炎癥反應。氣道上皮細胞、膠原纖維、纖毛結構在炎癥及氧化應激的共同作用下被破壞，反復的增生修復破壞造成氣道結構重塑，引起氣流受限，導致咳嗽、咳痰、呼吸困難等臨床癥狀出現。多項研究證實慢阻肺緩解期EBC中反映氣道炎癥、氧化應激的生物標志物高于健康人，而在慢阻肺急性加重期細胞因子水平則進一步升高[3-4]。8-iso-PG作為一種重要的反映肺部氧化應激的生物標志物已被廣泛研究。吸煙可引起下氣道的氧化應激，導致吸煙者EBC中的8-iso-PG水平明顯高于非吸煙者[5]。研究發現慢阻肺患者與健康對照組及健康吸煙者比較，EBC中8-iso-PG水平顯著升高，當疾病處于急性加重期時，EBC中8-iso-PG水平更高[6-7]。
本研究結果顯示慢阻肺患者任何時間觀察點EBC中8-iso-PG水平均高于健康對照組，可能與該類患者長期吸煙有關。吸煙破壞氣道上皮細胞，致氣道清除氧化性物質能力下降，氧化性物質的產生及平衡機制失衡，即使抗炎治療抑制炎癥細胞的過度活化釋放氧化性物質，但氣道仍然存在持續性氧化應激，導致8-iso-PG在慢阻肺患者中高于健康人。隨著抗炎治療時間推移，EBC中8-iso-PG水平呈逐漸下降趨勢，并在14~90 d保持相對穩定水平，提示給予治療后炎癥細胞活性受抑制，釋放氧化性物質減少，氧化應激作用減弱。這與Lehtim?ki等[8]研究結果一致。劉翱等[9]研究顯示，EBC中8-iso-PG的增高與哮喘的嚴重程度有關，提示8-iso-PG還可作為衡量哮喘氣道氧化應激程度的客觀指標。因此，8-iso-PG對于觀察氣道氧化應激變化有極大的價值。
有文獻報道EBC中8-iso-PG的濃度與呼吸困難評分和肺氣腫改變有關，EBC中8-iso-PG能與高分辨率CT一起共同評估肺氣腫改變的進程[10]，提示8-iso-PG可作為一個無創指標用于監測慢阻肺對藥物治療的反應及預示疾病的預后。本研究發現慢阻肺患者經90 d治療后肺功能較治療前升高，SGRQ評分下降，但并未發現8-iso-PG與肺功能FEV1存在相關性，是否與樣本量小有關需進一步探討。
IL-6是由單核細胞/巨噬細胞、T細胞、B細胞及上皮細胞分泌的一種促炎細胞因子。Carpagnano等[11]研究發現EBC中IL-6濃度在慢阻肺急性加重期患者明顯高于慢阻肺穩定期和健康對照組，且慢阻肺穩定期IL-6濃度高于健康對照組，表明EBC中IL-6濃度可作為反映慢阻肺患者氣道炎癥程度的指標，并且IL-6濃度的增加還可反映氣道的氧化應激水平[12]。但IL-6在慢阻肺發病機制中的作用尚不清楚，有報道IL-6部分參與了慢阻肺急性期的免疫反應，且可能是C反應蛋白產生的強誘導劑[13]。Sin等[14]研究發現應用氟替卡松或沙美特羅治療穩定期慢阻肺患者4周后，血清中IL-6水平并未受影響，但與肺損傷有關的特殊蛋白表面活性蛋白D(SP-D)顯著降低。提示吸入治療可針對局部炎癥起改善作用，而不作用于慢阻肺系統性炎癥指標。本研究中穩定期慢阻肺患者EBC中IL-6水平在未用藥前水平偏低，經治療28 d后較治療前顯著降低，而在隨后時間點的水平與28 d比較并無顯著變化，提示IL-6更適合作為反映系統性炎癥而非局部炎癥的指標。
IL-10為具有多向生物活性的細胞因子，由單核巨噬細胞、T/B淋巴細胞等多種細胞產生，在免疫應答和免疫調節中起重要作用。它可以抑制炎癥因子(如TNF-α、GM-CSF)和由抗原遞呈的抗炎細胞因子產生，還能抑制與破壞肺彈性纖維有關的基質金屬蛋白酶，因此有望成為一種抗炎藥物用于慢阻肺的治療。但由于IL-10在EBC中的檢測濃度低，只有極少的研究能檢測到[15]，因此大多數研究主要在誘導痰中進行。朱崢等[16]比較了慢阻肺急性加重期吸入激素及激素聯合β受體激動劑治療前后誘導痰IL-10的水平變化，結果治療后IL-10水平升高更為顯著，提示IL-10可能參與了抗炎機制。我們應用Luminex xMAP?技術，所有EBC標本中IL-10都能被檢測到，盡管檢測的濃度低下，但是治療90 d后IL-10水平與治療28 d比較仍然顯示水平升高，但結果相差甚微，是否有臨床意義有待進一步研究。
本研究納入的所有患者均從未使用或近3個月未使用沙美特羅/氟替卡松，首次使用沙美特羅/氟替卡松能抑制氣道炎癥細胞過度激活，使之處于相對穩定狀態，因此釋放炎癥介質減少，EBC中炎性標志物水平下降，支氣管平滑肌松弛，黏液細胞分泌痰液減少，肺功能提高，胸悶、咳嗽、咳痰等臨床癥狀減輕，生活質量改善。但提高程度不一，這可能與既往吸煙的時間、吸煙量對氣道造成重塑的程度不一樣，以及個體對藥物的治療敏感度存在差異所致。
綜上所述，動態觀察EBC中8-iso-PG的變化可作為監測重度穩定期慢阻肺患者治療期間氣道炎癥變化的指標，評估治療效果及輔助調整治療方案；IL-10可能與氣道抗炎作用有關。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)嚴重影響患者的勞動能力和生活質量，近年其發病率與死亡率在世界范圍內均呈逐漸上升趨勢，日益受到關注。2009年慢性阻塞性肺疾病全球防治創議推薦使用沙美特羅/氟替卡松(50/500μg，bid)聯合治療重度、極重度穩定期慢阻肺患者。多中心研究表明聯合沙美特羅/氟替卡松(50/500μg，bid)治療可改善日常癥狀，改善生活質量，減緩第1秒用力呼氣容積(FEV1)的下降速率，改善肺功能，減少急性加重頻率，減少住院率，并可能降低慢阻肺死亡率[1-2]。但較少有研究對治療期間氣道炎癥改變情況進行探討，本研究擬應用呼出氣冷凝液(EBC)細胞因子動態變化觀察重度穩定期慢阻肺患者治療期間氣道炎癥變化情況，并結合肺功能、生活質量評分分析其臨床意義。
對象與方法
一 對象
收集2011年10月至2012年10月深圳市南山醫院呼吸科門診診斷符合慢阻肺穩定期患者24例及健康對照18例。穩定期慢阻肺患者中，男21例，女3例；年齡49~73歲，平均(61.5±7.6)歲；符合2007年中華醫學會呼吸病學分會制定的慢阻肺穩定期Ⅱ級以上診斷標準；均為非吸煙者(完全不吸煙或已經戒煙1年以上)；治療前2周無呼吸系統感染病史及糖皮質激素、抗生素治療。排除標準：年齡≤40歲；治療過程中出現病情急性加重者；患有慢阻肺以外的呼吸系統慢性疾病史、高血壓病、糖尿病、結締組織性疾病患者。健康對照中，男10例，女8例；年齡52~73歲，平均(61.3±6.6)歲；非吸煙者，經我院體檢科體檢胸片、心電圖、血常規、尿常規、肝腎功能、血糖、腫瘤12項、肺功能檢測無異常；詢問病史無心、腦、肺、腎等相關疾病及風濕性疾病。
二 方法
1．肺功能檢測：采用德國Jaeger公司肺功能儀，測定FEV1、用力肺活量(FVC)和FEV1/FVC。測定方法參考美國胸科學會的程序和標準。
2．EBC的收集和檢測：采用EBC收集裝置(Rtube，Respiratory Research，美國)收集EBC。收集EBC前受檢者用蒸餾水漱口3次。從－10℃冰箱中取出制冷鋁管，組裝成EBC收集器。受檢者取坐位，經口、平靜潮式呼吸，收集時間為10~15 min。收集EBC 1~2 mL，分裝EP管中，凍存于－80℃冰箱待測。
3．細胞因子測定：白細胞介素6(IL-6)、IL-10的檢測采用液相芯片技術，應用LuminexTM 100對樣本進行檢測及分析。該技術原理核心是將不同大小(4.5~7μm)或不同熒光染料染色的聚苯乙烯小球(統稱編碼微球)共價交聯上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。應用時把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯的分子進行特異性地結合，用流式細胞檢測類儀器進行分析，儀器通過兩束激光分別識別編碼微球和檢測微球上報告分子的熒光強度，最后用LuminexTM100進行分析，將熒光信號轉化為濃度。8-異前列腺素(8-iso-PG)的測定選用酶聯免疫吸附法(ELISA)中的競爭法。8-iso-PG和酶標8-iso-PG (8-iso-PG AchE Tracer)競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的Tracer量與受檢8-iso-PG的量成反比，后加入酶底物，溫育顯色測定OD值，計算濃度。以上操作均嚴格按照試劑說明書。
4．圣喬治呼吸問卷(SGRQ)評分：應用SGRQ評分評價慢性氣流受限疾病對生活質量的影響程度。問卷采用患者自我答題形式進行，共有50道題，分為呼吸癥狀、活動能力受限和疾病對日常生活的影響3個部分，患者自我答題，采用加權平均方法對3個部分分別計分，經過處理得出總分。分值范圍為0~100分，分值越低表示患者的癥狀越輕，活動受限越小，對日常生活的影響越小，生活質量也越好。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理。資料呈近似正態分布，結果用
結果
一 慢阻肺患者治療前后EBC中8-iso-PG、IL-6、IL-10的水平及肺功能、SGRQ的變化
治療前重度穩定期慢阻肺患者EBC中各細胞因子濃度水平均高于健康對照組。治療14 d后慢阻肺患者8-iso-PG較治療前顯著下降(P < 0.05)，但在治療后14~90 d保持低水平，各觀測點細胞因子水平比較差異無統計學意義(P > 0.05)。IL-6水平在治療28 d后較治療前顯著降低(P < 0.05)，但與治療90 d后比較差異無統計學意義(P > 0.05)。IL-10水平在治療90 d較治療28 d顯著升高(P < 0.05)。治療后肺功能FEV1、FVC、FEV1/FVC較治療前增加，SGRQ評分下降，治療前后比較差異有統計學意義(P < 0.05)。結果見表 1。
表1
兩組各觀察點細胞因子、肺功能及SGRQ評分變化(pg/mL，二 相關性分析結果
相關性分析結果表明，FEV1與EBC中8-iso-PG、IL-6、IL-10水平均無顯著相關性。
討論
慢阻肺是在氣道炎癥與氧化應激共同作用下演變的，吸煙是慢阻肺發展的最主要因素。氣道炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞、CD8+淋巴細胞等在細菌、病毒、粉塵、煙霧等刺激下被激活，釋放炎癥介質和過氧化物質，導致氣道炎癥持續存在。氧化應激由氧化性物質及抗氧化性物質失衡引起。氧化性物質的過度產生損傷正常組織，并促進黏液產生和減弱纖毛清除黏液的功能，加劇氣道及肺部實質的炎癥反應。氣道上皮細胞、膠原纖維、纖毛結構在炎癥及氧化應激的共同作用下被破壞，反復的增生修復破壞造成氣道結構重塑，引起氣流受限，導致咳嗽、咳痰、呼吸困難等臨床癥狀出現。多項研究證實慢阻肺緩解期EBC中反映氣道炎癥、氧化應激的生物標志物高于健康人，而在慢阻肺急性加重期細胞因子水平則進一步升高[3-4]。8-iso-PG作為一種重要的反映肺部氧化應激的生物標志物已被廣泛研究。吸煙可引起下氣道的氧化應激，導致吸煙者EBC中的8-iso-PG水平明顯高于非吸煙者[5]。研究發現慢阻肺患者與健康對照組及健康吸煙者比較，EBC中8-iso-PG水平顯著升高，當疾病處于急性加重期時，EBC中8-iso-PG水平更高[6-7]。
本研究結果顯示慢阻肺患者任何時間觀察點EBC中8-iso-PG水平均高于健康對照組，可能與該類患者長期吸煙有關。吸煙破壞氣道上皮細胞，致氣道清除氧化性物質能力下降，氧化性物質的產生及平衡機制失衡，即使抗炎治療抑制炎癥細胞的過度活化釋放氧化性物質，但氣道仍然存在持續性氧化應激，導致8-iso-PG在慢阻肺患者中高于健康人。隨著抗炎治療時間推移，EBC中8-iso-PG水平呈逐漸下降趨勢，并在14~90 d保持相對穩定水平，提示給予治療后炎癥細胞活性受抑制，釋放氧化性物質減少，氧化應激作用減弱。這與Lehtim?ki等[8]研究結果一致。劉翱等[9]研究顯示，EBC中8-iso-PG的增高與哮喘的嚴重程度有關，提示8-iso-PG還可作為衡量哮喘氣道氧化應激程度的客觀指標。因此，8-iso-PG對于觀察氣道氧化應激變化有極大的價值。
有文獻報道EBC中8-iso-PG的濃度與呼吸困難評分和肺氣腫改變有關，EBC中8-iso-PG能與高分辨率CT一起共同評估肺氣腫改變的進程[10]，提示8-iso-PG可作為一個無創指標用于監測慢阻肺對藥物治療的反應及預示疾病的預后。本研究發現慢阻肺患者經90 d治療后肺功能較治療前升高，SGRQ評分下降，但并未發現8-iso-PG與肺功能FEV1存在相關性，是否與樣本量小有關需進一步探討。
IL-6是由單核細胞/巨噬細胞、T細胞、B細胞及上皮細胞分泌的一種促炎細胞因子。Carpagnano等[11]研究發現EBC中IL-6濃度在慢阻肺急性加重期患者明顯高于慢阻肺穩定期和健康對照組，且慢阻肺穩定期IL-6濃度高于健康對照組，表明EBC中IL-6濃度可作為反映慢阻肺患者氣道炎癥程度的指標，并且IL-6濃度的增加還可反映氣道的氧化應激水平[12]。但IL-6在慢阻肺發病機制中的作用尚不清楚，有報道IL-6部分參與了慢阻肺急性期的免疫反應，且可能是C反應蛋白產生的強誘導劑[13]。Sin等[14]研究發現應用氟替卡松或沙美特羅治療穩定期慢阻肺患者4周后，血清中IL-6水平并未受影響，但與肺損傷有關的特殊蛋白表面活性蛋白D(SP-D)顯著降低。提示吸入治療可針對局部炎癥起改善作用，而不作用于慢阻肺系統性炎癥指標。本研究中穩定期慢阻肺患者EBC中IL-6水平在未用藥前水平偏低，經治療28 d后較治療前顯著降低，而在隨后時間點的水平與28 d比較并無顯著變化，提示IL-6更適合作為反映系統性炎癥而非局部炎癥的指標。
IL-10為具有多向生物活性的細胞因子，由單核巨噬細胞、T/B淋巴細胞等多種細胞產生，在免疫應答和免疫調節中起重要作用。它可以抑制炎癥因子(如TNF-α、GM-CSF)和由抗原遞呈的抗炎細胞因子產生，還能抑制與破壞肺彈性纖維有關的基質金屬蛋白酶，因此有望成為一種抗炎藥物用于慢阻肺的治療。但由于IL-10在EBC中的檢測濃度低，只有極少的研究能檢測到[15]，因此大多數研究主要在誘導痰中進行。朱崢等[16]比較了慢阻肺急性加重期吸入激素及激素聯合β受體激動劑治療前后誘導痰IL-10的水平變化，結果治療后IL-10水平升高更為顯著，提示IL-10可能參與了抗炎機制。我們應用Luminex xMAP?技術，所有EBC標本中IL-10都能被檢測到，盡管檢測的濃度低下，但是治療90 d后IL-10水平與治療28 d比較仍然顯示水平升高，但結果相差甚微，是否有臨床意義有待進一步研究。
本研究納入的所有患者均從未使用或近3個月未使用沙美特羅/氟替卡松，首次使用沙美特羅/氟替卡松能抑制氣道炎癥細胞過度激活，使之處于相對穩定狀態，因此釋放炎癥介質減少，EBC中炎性標志物水平下降，支氣管平滑肌松弛，黏液細胞分泌痰液減少，肺功能提高，胸悶、咳嗽、咳痰等臨床癥狀減輕，生活質量改善。但提高程度不一，這可能與既往吸煙的時間、吸煙量對氣道造成重塑的程度不一樣，以及個體對藥物的治療敏感度存在差異所致。
綜上所述，動態觀察EBC中8-iso-PG的變化可作為監測重度穩定期慢阻肺患者治療期間氣道炎癥變化的指標，評估治療效果及輔助調整治療方案；IL-10可能與氣道抗炎作用有關。
