糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一個嚴重的健康問題，會導致腎功能逐漸下降，直至腎功能衰竭，同時增加心血管疾病的風險[1]。目前，臨床上可以通過使用胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）受體激動劑或鈉/葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑等藥物以減少高血糖和白蛋白尿，并延緩腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）的下降。然而，應用藥物治療如控制血壓、調控血糖和降低血脂有可能不能有效阻止DN的進展[2]。因此，需要探索更多有效阻止DN進展的治療策略[3]。
減重手術在過去10年中已成為肥胖和相關2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）治療范例的有效手段[4-5]。與非手術藥物治療相比，減重手術可顯著減輕體質量，降低糖化血紅蛋白水平，并降低 T2DM 和肥胖患者的微血管及大血管并發癥發生率[6]。減重手術還與較低的微血管疾病總發病率有關，與常規治療相比，神經病變、腎病和視網膜病變的風險較低[7-9]。在一項隨訪研究中， Christou等[10]發現減肥手術后1年，尿白蛋白肌酐比值從16.5 mg/g降低到6 mg/g。目前，在我國開展最多的減重手術是袖狀胃切除術（sleeve gastrectomy，SG）和胃旁路術（Roux-en-Y gastric bypass，RYGB） [11]，隨著手術量日益增多，SG的復胖[12]問題逐漸增加，而RYGB雖較SG有更顯著的減重降糖效果，但術后殘胃的問題也使得在胃癌高發地區無法得到廣發開展。Santoro等[13]創建了袖狀胃切除加雙通路（sleeve gastrectomy with transit bipartition，SG+TB）的手術方式，作為一種較新的減重術式，其減重和治療肥胖相關合并癥的遠期效果較理想。然而，臨床上減重手術對于治療肥胖合并DN的臨床病例較少，對于不同手術方式改善DN的效果也并不清楚。因此，本實驗動物研究觀察了SG、RYGB和SG+TB 這3種減重手術治療DN的療效以及三者之間的差異，旨在為新型減重手術SG+TB治療DN提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、分組及處理
選取60只8～10周齡SD雄性大鼠（體質量345～400 g），均購自徐州醫科大學實驗動物中心（生產批號：20220323，許可證號：201901008），清潔級別為三級。所有大鼠均為單籠飼養，調整適宜的溫度及濕度，隨機選取12只大鼠作為正常對照組（NC組）以標準飲食（脂肪熱量12%）喂養，其余48只大鼠連續1個月采用高脂飲食（脂肪熱量40%）喂養并聯合低劑量1%鏈脲佐菌素 ［（streptozotocin（STZ），Solarbio，貨號：S8050］ 進行腹腔注射（35 mg/kg），以誘導建立肥胖合并糖尿病大鼠模型。在STZ注射后（1次/d，連續2 d）經大鼠尾部采血測量大鼠隨機血糖，如果連續2次測量的隨機血糖水平均 >16.7 mmol/L則表示糖尿病大鼠建模成功[14]。繼續高脂喂養大鼠6周誘導其腎功能損傷，取其尿液標本采用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：E038-1-1）測定大鼠尿微量白蛋白（microalbuminuria， mALB）含量，若mALB ＞30 mg/L則DN模型建模成功。將大鼠編號后采用抽簽的方式隨機均分為SG組、RYGB組、SG+TB組和假手術組，每組8只。本研究通過了徐州醫科大學實驗動物倫理道德委員會的批準（審批號：202101W001）。
1.2 手術方法
所有大鼠術前均禁食（不禁飲）12 h。麻醉前電子秤稱量大鼠體質量，按照體質量0.5 mL/100 g腹腔內注射水合氯醛進行麻醉，術前預防性使用頭孢曲松（75 mg/kg）肌肉注射以減少術后感染。大鼠麻醉后進行消毒鋪巾，取上腹正中切口約3 cm長。
1.2.1 SG組
開腹后，游離胃大彎側，逐步離斷肝胃韌帶和胃脾韌帶并用6-0絲線結扎，用止血鉗從幽門上0.6 cm直至胃底夾閉，沿著血管鉗切除胃大彎側后縫合，術中切除的胃體積約占全胃體積的80%，完成SG后用美藍溶液檢查胃切緣，無出血則關腹術畢。
1.2.2 RYGB組
開腹后，離斷肝胃韌帶及脾胃韌帶并用6-0絲線結扎，在賁門周圍創建1個約20%的胃小囊，測量大鼠小腸總長度（從Treitz韌帶到回盲部）約為80 cm，辨別屈氏韌帶，在距屈氏韌帶以遠約30 cm處離斷空腸，將遠端空腸與胃行胃腸吻合，吻合口約0.3 cm，隨后在距離吻合口下方10 cm處將近端空腸與該處腸管行端側吻合。用美藍溶液檢查胃腸及腸腸吻合口，無出血則關腹術畢。
1.2.3 SG+TB組
在完成SG后，測量大鼠小腸總長度（從Treitz韌帶到回盲部）約為80 cm，于距回盲部約40 cm處離斷回腸，在距回盲部約10 cm處行回腸-回腸近端吻合，形成共同通道；遠端回腸與胃竇部吻合，所有吻合口寬度均為0.3 cm。用美藍溶液檢查胃切緣及吻合口，無出血則關腹術畢。
1.2.4 假手術組
在胃及距回腸40 cm處小腸上做1個小切口，約0.5 cm長并原位縫合，控制手術時長與其他手術組大致相同。
上述4組大鼠均在術后24 h給予250 mL含5%葡萄糖的水溶液自由飲用，于術后72 h給予口服腸內營養液，腸內營養喂養48 h后逐步添加普通飼料3 g喂養，觀察若無不良反應1周后過渡到自由飲食。手術示意圖見圖1。
圖1
示SG手術（a）、RYGB手術（b）、SG+TB手術（c）及假手術（d）示意圖
1.3 觀察指標及標本采集
1.3.1 體質量和進食量
所有大鼠分別于術前3 d和術后1～6個月時每個月稱量體質量和進食量，均連續測量3 d，取平均值。
1.3.2 血糖相關指標測定
所有大鼠分別于術前1 d和術后1～6個月時每個月測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；于術前1 d及術后第1和第 6個月時測定口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）和胰島素（Solarbio，貨號：I8040）耐受試驗（insulin tolerance test，ITT）。禁食不進水12 h后，于清晨8時取血檢測大鼠FBG，連續測3 d取平均值；給予50%葡萄糖溶液（3 mg/kg）灌胃后分別于0、30、60、90和120 min取血進行OGTT；腹腔內注射人胰島素注射液（0.5 U/L）后分別于0、30、60、90和120 min取血進行ITT。進行ITT試驗需與OGTT試驗間隔3 d。
1.3.3 腎功能相關指標測定
所有大鼠分別于術前1 d和術后第1和第 6個月時用試劑盒檢測尿微白蛋白肌酐比值（urinary microalbumin creatinine ratio，UACR）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和尿肌酐（urine creatinine，Ucr）。 標本采集方法： 分別在術前1 d和術后第1和第 6個月時經大鼠內眥靜脈取血，用20 μL微量紅細胞壓積管每次取血0.5 mL，經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min后收集血清樣本，存放于–80°冰箱中保存備檢。 Scr和BUN水平采用試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C011-2-1，C013-2-1）進行檢測。將大鼠分別放在代謝籠中收集尿液樣本并經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min后收集尿液上層樣本，存放于–80°冰箱中保存備檢。Ucr 采用肌氨酸氧化酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C011-2-1）測定。尿微量白蛋白采用ELISA試劑盒（武漢華美生物有限公司，貨號：CSB-E12991r）測定，然后計算UACR。
1.4 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行作圖。 采用Shapiro-Wilk檢驗對計量數據進行正態分布檢驗，對符合正態分布者采用均數±標準差（
）表示。OGTT和ITT血糖水平以梯形積分法計算其受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under curve，AUC）表示。重復測量數據采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析并采用Bonferroni檢驗進行多重比較。均為雙尾檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗大鼠存活情況
2.1.1 術前建模情況
有1只大鼠行STZ注射后1周死亡，分析原因可能由于STZ的毒性及高脂飲食導致個別大鼠出現更嚴重的生理損害。
2.1.2 術后存活情況
SG組大鼠術后死亡2只，1只手術當天死亡，解剖尸體考慮死因為胃切緣血管破裂出血；另1只大鼠于術后第7天死亡，解剖尸體考慮死因為腸梗阻。RYGB組大鼠術后死亡3只，1只術后麻醉未蘇醒立即死亡，尸體解剖發現不明原因的部分腸管極度擴張積氣，1只術后第5天死亡，1只術后7天死亡，均未找到死亡原因。SG+TB組大鼠術后死亡2只，1只術后第3天死亡，原因考慮腹腔感染；1只術后第7天死亡，原因不明。假手術組未出現大鼠死亡。
2.2 各組大鼠體質量、進食量和FBG水平檢測結果
各組大鼠體質量、進食量和FBG水平檢測結果見圖2，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果以及體質量、進食量和FBG水平在SG組、RYGB組和SG+TB組間總體比較結果見表1，體質量、進食量和FBG水平在同一組內不同時間點間總體比較結果見表2。
圖2
示各組大鼠不同時間點體質量、進食量和FBG水平檢測結果
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
表1
體質量、進食量和FBG水平的球形檢驗、時間與組別間交互效應以及組間總體比較結果
表2
體質量、進食量和FBG水平在同一組內不同時間點間總體比較結果
2.2.1 組間比較結果
由圖2和表1可見（NC組為陰性對照組，表現平穩，后續未納入統計差異對比）：術前，3個指標在4個手術組間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后，除進食量在術后第5和第6個月（P＞0.05）外，其余時間點3個指標4個手術組組間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對此進一步進行兩兩比較，體質量和FBG水平在術后各時間點SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（P＜0.05）；但體質量RYGB組和SG+TB組間在術后1、2和3個月時的差異無統計學意義（P＞0.05），在術后4～6個月RYGB組和SG+TB組體質量的差異有統計學意義（P＜0.05）。而進食量僅在術后第1～4個月時SG組、RYGB和SG+TB組在相應時間點低于假手術組（P＜0.05），但SG組、RYGB組和SG+TB組組間相應時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。FBG水平在術后1～3個月時，SG組、RYGB組和SG+TB組3組間的差異無統計學意義（P＞0.05），但在術后4～6個月時RYGB組和SG+TB組的FBG水平低于SG組，其差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.2 組內比較結果
由圖2和表2可見： 除假手術組的進食量和FBG水平各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，3個指標在SG組、RYGB組和SG+TB組的組內不同時間點總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；對此進一步分析發現，3個指標在SG組，RYGB組和SG+TB組均在術后第1個月時降低且均明顯低于術前（P＜0.05），而后體質量指標和進食量指標略呈平穩上升趨勢。
2.3 各組大鼠OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標檢測結果
2.3.1 各組大鼠OGTT及ITT檢測的血糖結果
檢測結果見圖3，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果見表3，OGTT和ITT檢測結果在同一組內不同時間點間總體比較結果見表4。① 組間比較： 由圖3和表3可見：術前，2個指標在4個手術組組間總體比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后，4個手術組間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對此進一步進行兩兩比較，SG組、RYGB組和SG+TB組的OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于假手術組（P＜0.05）；在術后第1個月時，RYGB組OGTT檢測的血糖水平低于SG+TB組（P＜0.05），但在術后第6個月時RYGB組OGTT檢測的血糖水平和SG+TB組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在術后第1和第6個月時，RYGB組和SG+TB組OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于SG組（P＜0.05）；術后ITT檢測的血糖水平SG組、RYGB組和SG+TB組3組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。② 組內比較： 由圖3及表4可見：假手術 組3個時間點間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 SG組、RYGB組和SG+TB組3個時間點間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；SG組、RYGB組和SG+TB組在術后第1和第6個月時OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于術前（P＜0.05）。
圖3
示各組大鼠不同時間點OGTT和ITT檢測的血糖水平
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
表3
OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標UACR、Scr和BUN水平的球形檢驗、時間與組別間交互效應及組間總體比較結果
表4
OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標UACR、Scr和BUN水平在同一組內不同時間點間總體比較結果
2.3.2 各組大鼠的腎功能指標UACR、Scr和BUN檢測結果
結果見圖4，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果見表3，UACR、Scr和BUN檢測結果在同一組內不同時間點間總體比較結果見表4。① 組間比較： 由圖4和表3可見：術前3個指標在4個手術組間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）；術后4個手術組間總體比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步行兩兩比較，SG組、RYGB組和SG+TB組的UACR、Scr和BUN水平均低于SHAM組（P＜0.05）；術后UACR和Scr水平RYGB組和SG+TB組均低于SG組（P＜0.05），但RYGB組和SG+TB組間的差異無統計學意義（P＞0.05）；術后BUN水平SG組、RYGB組和SG+TB組間比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。② 組內比較：由圖4及表4可見：SG組、RYGB組、SG+TB組和SHAM組（除SHAM組的Scr水平差異無統計學意義外）3個時間點間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；SG組、RYGB組和SG+TB組在術后第1和第6個月時均低于術前（P＜0.05）；而SHAM組UACR和BUN水平術后呈上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖4
示各組大鼠不同時間點UACR、Scr和BUN水平檢測結果
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
2.4 腎臟病理學改變 HE病理染色
如圖5所示，HE染色下見假手術組大鼠腎臟組織出現了典型的DN的病理學改變，如腎小球水腫、系膜基質增多、足突細胞消失等。SG組、RYGB組和SG+TB組大鼠腎臟的系膜基質和毛細血管腔病變情況較假手術組有了明顯的改善。
圖5
示各組大鼠腎小球的病理學改變（HE ×100）
3 討論
在臨床上，DN是T2DM患者早期死亡的重要原因[15]。其白蛋白尿是DN的主要臨床生物標志物，當代藥物治療的進步確實減少了糖尿病患者的白蛋白尿，其治療以控制血糖異常和血壓為主[16]（后者優選通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮軸），但仍然無法有效阻止DN的進展。因此，需要可延緩和阻礙DN進展的替代方法。近年來，越來越多的研究表明減重手術可改善DN，減重手術后的蛋白尿和尿白蛋白水平下降[17]，同時Scr和BUN在術后降低。 白蛋白尿的增加[18]與慢性腎臟病的發生、心肌梗死的風險等密切相關，而UACR[19]是診斷早期腎損傷的敏感指標。本研究結果表明，3個減重手術組均有效改善了DN大鼠的UACR、Scr、BUN等腎功能指標，而且在術后6個月也并未惡化，這提示減重手術可以逆轉腎功能的損傷，并有著較持久的作用。本研究假設在嚙齒動物研究中6個月作為長期結果報告，是依據文獻[14, 20]報道的大鼠1 d的壽命相當于人類的30～35 d，術后6個月的大鼠接近于人類術后15～17年。這證實了減重手術治療DN的長效性。
然而，對于減重手術治療DN的體內機制尚不明確。一般認為，減重手術可能通過減輕體質量和降低血糖來改善腎病。由于肥胖被認為與糖尿病的發展密切相關[21]，長期的高血糖會引起腎臟的損害從而導致腎病，因此通過減重來逆轉肥胖在理論上可能是一種有效的方法，不僅可以減緩疾病進展，甚至可能完全治愈疾病。在本研究中，3個手術組均有效降低了DN大鼠的體質量。有趣的是， 盡管SG+TB組在術后一直表現出優異的減重效果，在術后4～6個月降重均優于另外2個手術組，但其術后第1和第6個月的腎功能指標與RYGB組比較并無明顯差異，這提示降低體質量改善血糖似乎并不是改善腎病的獨立原因。減重手術還可以通過改善一些與腎臟疾病有關的危險因素，如高血壓、高胰島素血癥和胰島素抵抗、血脂異常和腎小球高濾過等來緩解腎病[22]。此外，減重手術還可以改善身體的代謝狀態，包括降低血糖水平和減輕胰島素抵抗。近年來，報道該領域研究的文獻存在一些局限性如樣本量小、隨訪期相對較短、缺乏對照組等。對于減重手術有研究[23]曾提出 “后腸假說”和“前腸排除（近端腸排除）”兩種假說來解釋術后血糖水平的降低。在“后腸假說”中認為，食物更快地到達遠端小腸，刺激胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[24]等激素水平顯著升高，從而降低血糖。 GLP-1是一種腸促胰島素素，具有增強胰島素分泌的能力。 有研究[25]顯示，GLP-1能夠減少腎小球濾過膜的損傷和腎小管上皮細胞的凋亡，同時也能夠減輕腎臟炎癥和纖維化。此外，GLP-1還能夠改善腎臟的代謝狀態，例如降低尿酸、減輕脂肪肝等[26]。然而，減重手術是否通過調控GLP-1介導著改善腎臟的功能和延緩DN進展尚不清楚。對于“前腸假說”而言，曠置了近端小腸（十二指腸和近端空腸），可以防止促進胰島素抵抗和T2DM的因子的分泌[27]。“前腸假說”自存在至今似乎一直存在爭議，甚至有研究提出曠置近端小腸可能會導致更多的營養不良[28]，可能會增加一些腎臟疾病的風險，如腎結石和尿酸性腎病。本研究中，雖然證實了3種減重手術均對緩解DN有效，而且對于吸收不良型的減重術式（RYGB和SG+TB）比SG的療效要更為顯著，但是在曠置了近端小腸的RYGB組中發現，其大鼠術后1個月的OGTT要優于SG和SGTB組，而在術后6個月時，RYGB組和SG+TB組的OGTT和ITT檢測的血糖水平未見明顯差異，對于治療腎病效果二者也未見明顯統計學差異。總體看來，曠置了近端小腸的RYGB組和雙通路轉流的SG+TB組在腎病改善方面并未有明顯差異。
臨床上，SG和RYGB均是開展較多的手術，但其仍有不足之處。SG操作簡單，術后并發癥少，但是其復胖和胃食管反流病是 SG 術后的主要問題。 SG 術后短期減重效果不錯，但遠期效果并不理想。2020年胃食管反流和腹腔鏡袖狀胃切除術國際專家共識[29]指出，SG是胃食管反流病患者的手術禁忌證。在本研究中，SG對DN大鼠的治療效果也劣于后兩種減重術式。RYGB是目前國內開展第二多的減重手術，較SG有著更優的糖尿病緩解及術后反流緩解。然而，其特殊的腸道操作曠置了殘胃，是否因此會增加胃癌發生的概率尚不清楚，并且術后無法通過胃鏡檢查來預測術后殘胃的改變。此外，額外的腸道操作使 RYGB 的并發癥以及營養不良發生率比SG高[30]。目前，國內外公認的膽胰分流-十二指腸轉位術（biliopancreatic diversion with duodenal switch，BPD-DS） [31]是解決病態肥胖及其相關并發癥最為有效的手段。但由于其手術操作復雜，術后并發癥及營養不良發生率較高[32]，國內較少開展。雙通路（SG+TB）手術的開展是希望在保留良好減重效果的同時減少十二指腸轉位術后營養不良并發癥發生的不足。有相關研究[33]也顯示，SG+TB對比RYGB其術后減重效果更好，雖然降糖、改善腎功能等療效無明顯差異，但手術并發癥發生率較RYGB更低。本研究結果也表明，雙通路手術大鼠在術后遠期的體質量降低要優于RYGB和SG，其腎功能緩解也不差于RYGB，優于SG。
總的來說，本研究結果表明3種減重手術均能緩解大鼠DN的進展，且RYGB和SG+TB要更優于SG術式。但仍存在著一定局限性：樣本量少，每組納入8只大鼠，結果可能存在一些偏倚。其次，大鼠的DN造模模型目前主要以自發性糖尿病腎病模型和轉基因動物模型為最優，其優點在于發病原因清楚，更接近臨床患者的癥狀，但由于造價昂貴，來源極度有限，本研究未采用。本研究采用了化學藥物誘導即高脂飲食聯合STZ構造模型，其模型雖然造模緩慢，但模型穩定，成本較低。因此，對于臨床中DN可能存在著不同級別的分期，而本研究中的動物模型可能并不能完全明確分類腎病的嚴重程度。最后，由于臨床減重手術治療DN病例較少，且改善蛋白尿、腎功能指標等可能需要2年甚至幾年的長期隨訪，所以本研究后續仍需要結合臨床的數據予以支持。
4 結論
減重手術確實給治療肥胖合并DN提供了一種新手段，對于減重手術不斷更新的今天，SG+TB可能是一種潛在的行之有效的手術方式，以后在臨床上可能會逐漸取代RYGB。 我們希望，在后續的研究中，通過探究DN信號機制，來深入探索減重手術改善腎病的機制，并在臨床上增加長期隨訪。
重要聲明
利益沖突聲明: 本研究內容無相關利益沖突。
作者貢獻聲明：本研究在朱孝成的指導下由舒暢完成相關實驗內容并撰寫了該論文，同時得到了姚立彬和洪健的實驗支持與幫助。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學實驗動物倫理道德委員會的審批（批文編號：202101W001）。
糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一個嚴重的健康問題，會導致腎功能逐漸下降，直至腎功能衰竭，同時增加心血管疾病的風險[1]。目前，臨床上可以通過使用胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）受體激動劑或鈉/葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑等藥物以減少高血糖和白蛋白尿，并延緩腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）的下降。然而，應用藥物治療如控制血壓、調控血糖和降低血脂有可能不能有效阻止DN的進展[2]。因此，需要探索更多有效阻止DN進展的治療策略[3]。
減重手術在過去10年中已成為肥胖和相關2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）治療范例的有效手段[4-5]。與非手術藥物治療相比，減重手術可顯著減輕體質量，降低糖化血紅蛋白水平，并降低 T2DM 和肥胖患者的微血管及大血管并發癥發生率[6]。減重手術還與較低的微血管疾病總發病率有關，與常規治療相比，神經病變、腎病和視網膜病變的風險較低[7-9]。在一項隨訪研究中， Christou等[10]發現減肥手術后1年，尿白蛋白肌酐比值從16.5 mg/g降低到6 mg/g。目前，在我國開展最多的減重手術是袖狀胃切除術（sleeve gastrectomy，SG）和胃旁路術（Roux-en-Y gastric bypass，RYGB） [11]，隨著手術量日益增多，SG的復胖[12]問題逐漸增加，而RYGB雖較SG有更顯著的減重降糖效果，但術后殘胃的問題也使得在胃癌高發地區無法得到廣發開展。Santoro等[13]創建了袖狀胃切除加雙通路（sleeve gastrectomy with transit bipartition，SG+TB）的手術方式，作為一種較新的減重術式，其減重和治療肥胖相關合并癥的遠期效果較理想。然而，臨床上減重手術對于治療肥胖合并DN的臨床病例較少，對于不同手術方式改善DN的效果也并不清楚。因此，本實驗動物研究觀察了SG、RYGB和SG+TB 這3種減重手術治療DN的療效以及三者之間的差異，旨在為新型減重手術SG+TB治療DN提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、分組及處理
選取60只8～10周齡SD雄性大鼠（體質量345～400 g），均購自徐州醫科大學實驗動物中心（生產批號：20220323，許可證號：201901008），清潔級別為三級。所有大鼠均為單籠飼養，調整適宜的溫度及濕度，隨機選取12只大鼠作為正常對照組（NC組）以標準飲食（脂肪熱量12%）喂養，其余48只大鼠連續1個月采用高脂飲食（脂肪熱量40%）喂養并聯合低劑量1%鏈脲佐菌素 ［（streptozotocin（STZ），Solarbio，貨號：S8050］ 進行腹腔注射（35 mg/kg），以誘導建立肥胖合并糖尿病大鼠模型。在STZ注射后（1次/d，連續2 d）經大鼠尾部采血測量大鼠隨機血糖，如果連續2次測量的隨機血糖水平均 >16.7 mmol/L則表示糖尿病大鼠建模成功[14]。繼續高脂喂養大鼠6周誘導其腎功能損傷，取其尿液標本采用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：E038-1-1）測定大鼠尿微量白蛋白（microalbuminuria， mALB）含量，若mALB ＞30 mg/L則DN模型建模成功。將大鼠編號后采用抽簽的方式隨機均分為SG組、RYGB組、SG+TB組和假手術組，每組8只。本研究通過了徐州醫科大學實驗動物倫理道德委員會的批準（審批號：202101W001）。
1.2 手術方法
所有大鼠術前均禁食（不禁飲）12 h。麻醉前電子秤稱量大鼠體質量，按照體質量0.5 mL/100 g腹腔內注射水合氯醛進行麻醉，術前預防性使用頭孢曲松（75 mg/kg）肌肉注射以減少術后感染。大鼠麻醉后進行消毒鋪巾，取上腹正中切口約3 cm長。
1.2.1 SG組
開腹后，游離胃大彎側，逐步離斷肝胃韌帶和胃脾韌帶并用6-0絲線結扎，用止血鉗從幽門上0.6 cm直至胃底夾閉，沿著血管鉗切除胃大彎側后縫合，術中切除的胃體積約占全胃體積的80%，完成SG后用美藍溶液檢查胃切緣，無出血則關腹術畢。
1.2.2 RYGB組
開腹后，離斷肝胃韌帶及脾胃韌帶并用6-0絲線結扎，在賁門周圍創建1個約20%的胃小囊，測量大鼠小腸總長度（從Treitz韌帶到回盲部）約為80 cm，辨別屈氏韌帶，在距屈氏韌帶以遠約30 cm處離斷空腸，將遠端空腸與胃行胃腸吻合，吻合口約0.3 cm，隨后在距離吻合口下方10 cm處將近端空腸與該處腸管行端側吻合。用美藍溶液檢查胃腸及腸腸吻合口，無出血則關腹術畢。
1.2.3 SG+TB組
在完成SG后，測量大鼠小腸總長度（從Treitz韌帶到回盲部）約為80 cm，于距回盲部約40 cm處離斷回腸，在距回盲部約10 cm處行回腸-回腸近端吻合，形成共同通道；遠端回腸與胃竇部吻合，所有吻合口寬度均為0.3 cm。用美藍溶液檢查胃切緣及吻合口，無出血則關腹術畢。
1.2.4 假手術組
在胃及距回腸40 cm處小腸上做1個小切口，約0.5 cm長并原位縫合，控制手術時長與其他手術組大致相同。
上述4組大鼠均在術后24 h給予250 mL含5%葡萄糖的水溶液自由飲用，于術后72 h給予口服腸內營養液，腸內營養喂養48 h后逐步添加普通飼料3 g喂養，觀察若無不良反應1周后過渡到自由飲食。手術示意圖見圖1。
圖1
示SG手術（a）、RYGB手術（b）、SG+TB手術（c）及假手術（d）示意圖
1.3 觀察指標及標本采集
1.3.1 體質量和進食量
所有大鼠分別于術前3 d和術后1～6個月時每個月稱量體質量和進食量，均連續測量3 d，取平均值。
1.3.2 血糖相關指標測定
所有大鼠分別于術前1 d和術后1～6個月時每個月測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；于術前1 d及術后第1和第 6個月時測定口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）和胰島素（Solarbio，貨號：I8040）耐受試驗（insulin tolerance test，ITT）。禁食不進水12 h后，于清晨8時取血檢測大鼠FBG，連續測3 d取平均值；給予50%葡萄糖溶液（3 mg/kg）灌胃后分別于0、30、60、90和120 min取血進行OGTT；腹腔內注射人胰島素注射液（0.5 U/L）后分別于0、30、60、90和120 min取血進行ITT。進行ITT試驗需與OGTT試驗間隔3 d。
1.3.3 腎功能相關指標測定
所有大鼠分別于術前1 d和術后第1和第 6個月時用試劑盒檢測尿微白蛋白肌酐比值（urinary microalbumin creatinine ratio，UACR）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和尿肌酐（urine creatinine，Ucr）。 標本采集方法： 分別在術前1 d和術后第1和第 6個月時經大鼠內眥靜脈取血，用20 μL微量紅細胞壓積管每次取血0.5 mL，經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min后收集血清樣本，存放于–80°冰箱中保存備檢。 Scr和BUN水平采用試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C011-2-1，C013-2-1）進行檢測。將大鼠分別放在代謝籠中收集尿液樣本并經3 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min后收集尿液上層樣本，存放于–80°冰箱中保存備檢。Ucr 采用肌氨酸氧化酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C011-2-1）測定。尿微量白蛋白采用ELISA試劑盒（武漢華美生物有限公司，貨號：CSB-E12991r）測定，然后計算UACR。
1.4 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行作圖。 采用Shapiro-Wilk檢驗對計量數據進行正態分布檢驗，對符合正態分布者采用均數±標準差（）表示。OGTT和ITT血糖水平以梯形積分法計算其受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under curve，AUC）表示。重復測量數據采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析并采用Bonferroni檢驗進行多重比較。均為雙尾檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗大鼠存活情況
2.1.1 術前建模情況
有1只大鼠行STZ注射后1周死亡，分析原因可能由于STZ的毒性及高脂飲食導致個別大鼠出現更嚴重的生理損害。
2.1.2 術后存活情況
SG組大鼠術后死亡2只，1只手術當天死亡，解剖尸體考慮死因為胃切緣血管破裂出血；另1只大鼠于術后第7天死亡，解剖尸體考慮死因為腸梗阻。RYGB組大鼠術后死亡3只，1只術后麻醉未蘇醒立即死亡，尸體解剖發現不明原因的部分腸管極度擴張積氣，1只術后第5天死亡，1只術后7天死亡，均未找到死亡原因。SG+TB組大鼠術后死亡2只，1只術后第3天死亡，原因考慮腹腔感染；1只術后第7天死亡，原因不明。假手術組未出現大鼠死亡。
2.2 各組大鼠體質量、進食量和FBG水平檢測結果
各組大鼠體質量、進食量和FBG水平檢測結果見圖2，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果以及體質量、進食量和FBG水平在SG組、RYGB組和SG+TB組間總體比較結果見表1，體質量、進食量和FBG水平在同一組內不同時間點間總體比較結果見表2。
圖2
示各組大鼠不同時間點體質量、進食量和FBG水平檢測結果
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
表1
體質量、進食量和FBG水平的球形檢驗、時間與組別間交互效應以及組間總體比較結果
表2
體質量、進食量和FBG水平在同一組內不同時間點間總體比較結果
2.2.1 組間比較結果
由圖2和表1可見（NC組為陰性對照組，表現平穩，后續未納入統計差異對比）：術前，3個指標在4個手術組間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后，除進食量在術后第5和第6個月（P＞0.05）外，其余時間點3個指標4個手術組組間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對此進一步進行兩兩比較，體質量和FBG水平在術后各時間點SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（P＜0.05）；但體質量RYGB組和SG+TB組間在術后1、2和3個月時的差異無統計學意義（P＞0.05），在術后4～6個月RYGB組和SG+TB組體質量的差異有統計學意義（P＜0.05）。而進食量僅在術后第1～4個月時SG組、RYGB和SG+TB組在相應時間點低于假手術組（P＜0.05），但SG組、RYGB組和SG+TB組組間相應時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。FBG水平在術后1～3個月時，SG組、RYGB組和SG+TB組3組間的差異無統計學意義（P＞0.05），但在術后4～6個月時RYGB組和SG+TB組的FBG水平低于SG組，其差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.2 組內比較結果
由圖2和表2可見： 除假手術組的進食量和FBG水平各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，3個指標在SG組、RYGB組和SG+TB組的組內不同時間點總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；對此進一步分析發現，3個指標在SG組，RYGB組和SG+TB組均在術后第1個月時降低且均明顯低于術前（P＜0.05），而后體質量指標和進食量指標略呈平穩上升趨勢。
2.3 各組大鼠OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標檢測結果
2.3.1 各組大鼠OGTT及ITT檢測的血糖結果
檢測結果見圖3，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果見表3，OGTT和ITT檢測結果在同一組內不同時間點間總體比較結果見表4。① 組間比較： 由圖3和表3可見：術前，2個指標在4個手術組組間總體比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后，4個手術組間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對此進一步進行兩兩比較，SG組、RYGB組和SG+TB組的OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于假手術組（P＜0.05）；在術后第1個月時，RYGB組OGTT檢測的血糖水平低于SG+TB組（P＜0.05），但在術后第6個月時RYGB組OGTT檢測的血糖水平和SG+TB組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在術后第1和第6個月時，RYGB組和SG+TB組OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于SG組（P＜0.05）；術后ITT檢測的血糖水平SG組、RYGB組和SG+TB組3組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。② 組內比較： 由圖3及表4可見：假手術 組3個時間點間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 SG組、RYGB組和SG+TB組3個時間點間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；SG組、RYGB組和SG+TB組在術后第1和第6個月時OGTT和ITT檢測的血糖水平均低于術前（P＜0.05）。
圖3
示各組大鼠不同時間點OGTT和ITT檢測的血糖水平
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
表3
OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標UACR、Scr和BUN水平的球形檢驗、時間與組別間交互效應及組間總體比較結果
表4
OGTT和ITT檢測的血糖水平以及腎功能指標UACR、Scr和BUN水平在同一組內不同時間點間總體比較結果
2.3.2 各組大鼠的腎功能指標UACR、Scr和BUN檢測結果
結果見圖4，其球形檢驗、時間與組別間的交互效應結果見表3，UACR、Scr和BUN檢測結果在同一組內不同時間點間總體比較結果見表4。① 組間比較： 由圖4和表3可見：術前3個指標在4個手術組間總體比較差異無統計學意義（P＞0.05）；術后4個手術組間總體比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步行兩兩比較，SG組、RYGB組和SG+TB組的UACR、Scr和BUN水平均低于SHAM組（P＜0.05）；術后UACR和Scr水平RYGB組和SG+TB組均低于SG組（P＜0.05），但RYGB組和SG+TB組間的差異無統計學意義（P＞0.05）；術后BUN水平SG組、RYGB組和SG+TB組間比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。② 組內比較：由圖4及表4可見：SG組、RYGB組、SG+TB組和SHAM組（除SHAM組的Scr水平差異無統計學意義外）3個時間點間總體比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；SG組、RYGB組和SG+TB組在術后第1和第6個月時均低于術前（P＜0.05）；而SHAM組UACR和BUN水平術后呈上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖4
示各組大鼠不同時間點UACR、Scr和BUN水平檢測結果
*：示SG組、RYGB組和SG+TB組均低于假手術組（
2.4 腎臟病理學改變 HE病理染色
如圖5所示，HE染色下見假手術組大鼠腎臟組織出現了典型的DN的病理學改變，如腎小球水腫、系膜基質增多、足突細胞消失等。SG組、RYGB組和SG+TB組大鼠腎臟的系膜基質和毛細血管腔病變情況較假手術組有了明顯的改善。
圖5
示各組大鼠腎小球的病理學改變（HE ×100）
3 討論
在臨床上，DN是T2DM患者早期死亡的重要原因[15]。其白蛋白尿是DN的主要臨床生物標志物，當代藥物治療的進步確實減少了糖尿病患者的白蛋白尿，其治療以控制血糖異常和血壓為主[16]（后者優選通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮軸），但仍然無法有效阻止DN的進展。因此，需要可延緩和阻礙DN進展的替代方法。近年來，越來越多的研究表明減重手術可改善DN，減重手術后的蛋白尿和尿白蛋白水平下降[17]，同時Scr和BUN在術后降低。 白蛋白尿的增加[18]與慢性腎臟病的發生、心肌梗死的風險等密切相關，而UACR[19]是診斷早期腎損傷的敏感指標。本研究結果表明，3個減重手術組均有效改善了DN大鼠的UACR、Scr、BUN等腎功能指標，而且在術后6個月也并未惡化，這提示減重手術可以逆轉腎功能的損傷，并有著較持久的作用。本研究假設在嚙齒動物研究中6個月作為長期結果報告，是依據文獻[14, 20]報道的大鼠1 d的壽命相當于人類的30～35 d，術后6個月的大鼠接近于人類術后15～17年。這證實了減重手術治療DN的長效性。
然而，對于減重手術治療DN的體內機制尚不明確。一般認為，減重手術可能通過減輕體質量和降低血糖來改善腎病。由于肥胖被認為與糖尿病的發展密切相關[21]，長期的高血糖會引起腎臟的損害從而導致腎病，因此通過減重來逆轉肥胖在理論上可能是一種有效的方法，不僅可以減緩疾病進展，甚至可能完全治愈疾病。在本研究中，3個手術組均有效降低了DN大鼠的體質量。有趣的是， 盡管SG+TB組在術后一直表現出優異的減重效果，在術后4～6個月降重均優于另外2個手術組，但其術后第1和第6個月的腎功能指標與RYGB組比較并無明顯差異，這提示降低體質量改善血糖似乎并不是改善腎病的獨立原因。減重手術還可以通過改善一些與腎臟疾病有關的危險因素，如高血壓、高胰島素血癥和胰島素抵抗、血脂異常和腎小球高濾過等來緩解腎病[22]。此外，減重手術還可以改善身體的代謝狀態，包括降低血糖水平和減輕胰島素抵抗。近年來，報道該領域研究的文獻存在一些局限性如樣本量小、隨訪期相對較短、缺乏對照組等。對于減重手術有研究[23]曾提出 “后腸假說”和“前腸排除（近端腸排除）”兩種假說來解釋術后血糖水平的降低。在“后腸假說”中認為，食物更快地到達遠端小腸，刺激胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[24]等激素水平顯著升高，從而降低血糖。 GLP-1是一種腸促胰島素素，具有增強胰島素分泌的能力。 有研究[25]顯示，GLP-1能夠減少腎小球濾過膜的損傷和腎小管上皮細胞的凋亡，同時也能夠減輕腎臟炎癥和纖維化。此外，GLP-1還能夠改善腎臟的代謝狀態，例如降低尿酸、減輕脂肪肝等[26]。然而，減重手術是否通過調控GLP-1介導著改善腎臟的功能和延緩DN進展尚不清楚。對于“前腸假說”而言，曠置了近端小腸（十二指腸和近端空腸），可以防止促進胰島素抵抗和T2DM的因子的分泌[27]。“前腸假說”自存在至今似乎一直存在爭議，甚至有研究提出曠置近端小腸可能會導致更多的營養不良[28]，可能會增加一些腎臟疾病的風險，如腎結石和尿酸性腎病。本研究中，雖然證實了3種減重手術均對緩解DN有效，而且對于吸收不良型的減重術式（RYGB和SG+TB）比SG的療效要更為顯著，但是在曠置了近端小腸的RYGB組中發現，其大鼠術后1個月的OGTT要優于SG和SGTB組，而在術后6個月時，RYGB組和SG+TB組的OGTT和ITT檢測的血糖水平未見明顯差異，對于治療腎病效果二者也未見明顯統計學差異。總體看來，曠置了近端小腸的RYGB組和雙通路轉流的SG+TB組在腎病改善方面并未有明顯差異。
臨床上，SG和RYGB均是開展較多的手術，但其仍有不足之處。SG操作簡單，術后并發癥少，但是其復胖和胃食管反流病是 SG 術后的主要問題。 SG 術后短期減重效果不錯，但遠期效果并不理想。2020年胃食管反流和腹腔鏡袖狀胃切除術國際專家共識[29]指出，SG是胃食管反流病患者的手術禁忌證。在本研究中，SG對DN大鼠的治療效果也劣于后兩種減重術式。RYGB是目前國內開展第二多的減重手術，較SG有著更優的糖尿病緩解及術后反流緩解。然而，其特殊的腸道操作曠置了殘胃，是否因此會增加胃癌發生的概率尚不清楚，并且術后無法通過胃鏡檢查來預測術后殘胃的改變。此外，額外的腸道操作使 RYGB 的并發癥以及營養不良發生率比SG高[30]。目前，國內外公認的膽胰分流-十二指腸轉位術（biliopancreatic diversion with duodenal switch，BPD-DS） [31]是解決病態肥胖及其相關并發癥最為有效的手段。但由于其手術操作復雜，術后并發癥及營養不良發生率較高[32]，國內較少開展。雙通路（SG+TB）手術的開展是希望在保留良好減重效果的同時減少十二指腸轉位術后營養不良并發癥發生的不足。有相關研究[33]也顯示，SG+TB對比RYGB其術后減重效果更好，雖然降糖、改善腎功能等療效無明顯差異，但手術并發癥發生率較RYGB更低。本研究結果也表明，雙通路手術大鼠在術后遠期的體質量降低要優于RYGB和SG，其腎功能緩解也不差于RYGB，優于SG。
總的來說，本研究結果表明3種減重手術均能緩解大鼠DN的進展，且RYGB和SG+TB要更優于SG術式。但仍存在著一定局限性：樣本量少，每組納入8只大鼠，結果可能存在一些偏倚。其次，大鼠的DN造模模型目前主要以自發性糖尿病腎病模型和轉基因動物模型為最優，其優點在于發病原因清楚，更接近臨床患者的癥狀，但由于造價昂貴，來源極度有限，本研究未采用。本研究采用了化學藥物誘導即高脂飲食聯合STZ構造模型，其模型雖然造模緩慢，但模型穩定，成本較低。因此，對于臨床中DN可能存在著不同級別的分期，而本研究中的動物模型可能并不能完全明確分類腎病的嚴重程度。最后，由于臨床減重手術治療DN病例較少，且改善蛋白尿、腎功能指標等可能需要2年甚至幾年的長期隨訪，所以本研究后續仍需要結合臨床的數據予以支持。
4 結論
減重手術確實給治療肥胖合并DN提供了一種新手段，對于減重手術不斷更新的今天，SG+TB可能是一種潛在的行之有效的手術方式，以后在臨床上可能會逐漸取代RYGB。 我們希望，在后續的研究中，通過探究DN信號機制，來深入探索減重手術改善腎病的機制，并在臨床上增加長期隨訪。
重要聲明
利益沖突聲明: 本研究內容無相關利益沖突。
作者貢獻聲明：本研究在朱孝成的指導下由舒暢完成相關實驗內容并撰寫了該論文，同時得到了姚立彬和洪健的實驗支持與幫助。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學實驗動物倫理道德委員會的審批（批文編號：202101W001）。
