引用本文： 尹艷梅, 李俊峰, 彭磊, 阮萬百, 朱克祥. 減毒沙門菌在腫瘤治療中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(8): 988-994. doi: 10.7507/1007-9424.202304004 復制
0 引言
腫瘤是一種可在人體各個器官和組織發生的異常的、無法受到正常調控的細胞增生，并且如果不加以控制，腫瘤細胞會不斷向周圍正常組織蔓延，甚至通過血液或淋巴系統轉移至身體其他部位形成新的腫瘤。近年來，由于人口老齡化、環境污染、不健康的生活方式和飲食習慣，全球惡性腫瘤的發病率和死亡率呈現出快速增長的趨勢，研究[1]表明，惡性腫瘤已經成為當前全球70歲前死亡的首要原因，所以尋找更好的治療方案迫在眉睫。越來越多的研究者開始探尋細菌介導的腫瘤治療能否成為一種新的抗腫瘤治療方案。
沙門菌（Salmonella typhimurium，ST）是一種兼性胞內細菌，可在無氧條件下生長并能依賴腫瘤壞死區域增殖[2]。減毒ST在野生ST的基礎上進行基因修飾—刪除或削弱有毒性基因、增強免疫原性和抗腫瘤作用的基因，減弱對正常組織的毒性，并加強原有的抗腫瘤作用。筆者現主要從抑制原發腫瘤生長和減少繼發腫瘤發生兩方面具體闡述減毒ST發揮抗腫瘤作用的可能機制，并探討減毒ST臨床應用所面臨的問題及解決方案。
1 抑制原發腫瘤生長
1.1 靶向和定植作用
當腫瘤內富集的減毒ST量超過109/g時，可使其在腫瘤組織與正常組織的比值位于250∶1和9 000∶1之間，抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期[3]。Pawelek等[4]和Rabea等[5]研究發現，減毒ST尾靜脈注入攜帶黑色素瘤的小鼠體內后，可被絲氨酸、天冬氨酸和半乳糖/核糖等腫瘤表面受體吸引到腫瘤組織。同時刺激腫瘤細胞產生腫瘤壞死因子α、γ干擾素、白介素12等增強腫瘤血管通透性的細胞因子，協助其進入腫瘤[3, 6-8]。 Saltzman等[9]和Jawalagatti等[10]的研究結果也證明尾靜脈注射減毒ST時，減毒ST能夠靶向定植于小鼠乳腺癌組織。Ebelt等[11]和Tan等[12]的研究證明，在靜脈注射減毒ST時，減毒ST能夠優先定植于小鼠原位人胰腺導管腺癌腫瘤組織。以上研究表明，靜脈注射減毒ST后，減毒ST都能夠定植于腫瘤組織，能最大限度地減少腫瘤外毒性，實現精準治療。
1.2 免疫作用
減毒ST進入小鼠體內后通過細胞吞噬、免疫細胞浸潤和補體途徑激活，發揮免疫攻擊和抗腫瘤作用。Liang等[13]通過對多種重組減毒株的抗腫瘤作用進行評估證明了宿主在感染ST后，ST主要分布在腫瘤細胞胞質中，根據Ⅲ型分泌系統調節細胞功能，使其在一定程度上抵抗單核-巨噬系統對外來物質的清除作用，使ST能夠在巨噬細胞中存活。并且通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4信號通路向腫瘤組織中招募如中性粒細胞、巨噬細胞等固有免疫細胞吞噬腫瘤細胞[14-15]。Chen等[16]認為，招募到的免疫細胞被減毒ST原位分泌的鞭毛蛋白/TLR5/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路激活，進而產生活性氧、一氧化氮（nitric oxide，NO）、蛋白酶、膜穿孔劑、細胞因子等細胞毒性介質以殺死腫瘤細胞[17]。Yang等[18]制作的時間蛋白質組圖譜進一步提出減毒ST可以激活固有免疫和特異免疫的功能橋梁—補體途徑，誘導小鼠發生先天性、適應性免疫綜合防御。
除傳統的免疫作用外，減毒ST還可以引發腫瘤細胞發生焦亡、自噬作用，抑制腫瘤進展。既往研究[8]證實減毒ST進入腫瘤細胞后，被吞噬小體中的核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptor，NLR）識別后觸發形成炎性小體。大量富集在一起的炎性小體激活細胞焦亡的主要效應蛋白酶—含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1），進而誘導腫瘤細胞焦亡；除此之外，活化的caspase-1可以將巨噬細胞產生的前體IL-1β水解為IL-1β，進一步促進細胞免疫應答。與細胞焦亡作用類似，減毒ST進入宿主體內后，可通過Toll樣受體信號促進自噬小體的標記分子LC3募集到自噬小體，通過TLR/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路誘導腫瘤細胞自噬，抑制結直腸癌小鼠腫瘤進展。
1.3 營養競爭作用
Miyake等[19]的研究結果表明，減毒ST首先可以誘導內皮細胞凋亡和壞死，降低腫瘤中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和CD31陽性細胞百分比，從而抑制腫瘤內新血管生成，減少腫瘤營養供給通道；其次，刺激產生的固有免疫相關細胞可以和血小板協同誘導，激活凝血途徑，在腫瘤組織內部新生血管內形成血栓，阻斷腫瘤營養供給通道；最后，能在腫瘤厭氧區增殖旺盛，與腫瘤細胞競爭營養，抑制腫瘤生長[20]。除此之外，另外兩項與減毒ST抗血管生成相關的研究[21-22]中提出，減毒ST抑制腫瘤內新生血管形成還可以導致腫瘤微環境更加缺氧，進而形成低氧腫瘤微環境和減毒ST定植之間的正反饋循環，增強減毒ST的抗腫瘤效果。
1.4 質粒攜帶作用
因為減毒ST既能靶向實體腫瘤的缺氧壞死區，又易于重組操作[23]，所以它可以攜帶和共表達一些外源性免疫佐劑和抗原、治療基因和溶瘤病毒，如腫瘤相關抗原、細胞毒性分子、免疫調節分子、促凋亡蛋白、核酸、納米顆粒等進入腫瘤微環境[24-25]，可有效地誘導免疫細胞活化、細胞因子分泌、細胞毒性淋巴細胞產生和特異性抗體形成，激發有效的免疫反應[26-30]，抑制腫瘤生長。近幾年間與質粒攜帶作用相關的減毒ST抗腫瘤作用的研究見表1。
表1
減毒ST質粒攜帶作用相關研究
1.5 聯合傳統療法
1.5.1 改善化療藥物耐藥問題
腫瘤耐藥的發生主要有以下3點原因：① 腫瘤細胞的細胞周期易于停滯在耐藥的G0/G1期[42]；② 腫瘤細胞周圍過度生產的膠原、透明質酸等細胞外基質成分在腫瘤細胞周圍形成致密的基質屏障限制藥物進入[43]；③ 腫瘤細胞的細胞膜上的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）會將化療藥物泵出細胞[44]。減毒ST可以針對以上3點改善腫瘤耐藥。首先，減毒ST與重組甲硫氨酸酶聯合應用時，減毒ST可以誘導腫瘤細胞從耐藥的G0/G1期進入藥物敏感的S/G2/M期[19, 45-46]，隨后重組甲硫氨酸酶特異地將腫瘤細胞捕獲在S/G2期，使腫瘤細胞對藥物保持敏感性[47-48]。而且，甲硫氨酸是腫瘤細胞的“營養劑”，腫瘤細胞具有甲硫氨酸依賴性，腫瘤甲硫氨酸水平與腫瘤大小密切相關，甲硫氨酸酶可降解甲硫氨酸，進而影響腫瘤的營養供應。其次，減毒ST可以清除胰腺癌小鼠腫瘤細胞周圍的細胞外基質屏障，增加化療藥物的滲透濃度，改善耐藥[11]。最后，減毒ST可以通過轉錄后調節或者抑制Akt/mTOR途徑降低P-gp的表達，進而減少化療藥物的外排，改善耐藥[44]。
1.5.2 增強傳統療法的療效
減毒ST可以與傳統療法發生互補、協同、增效作用，增強傳統療法的療效。① 互補作用：實體瘤的腫瘤組織處于乏氧狀態（正常組織中氧含量為 3%～15%，腫瘤組織氧含量為1%） [49]。Zhao等[50]的研究表明，缺血缺氧可促使晚期肝癌發生三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）的抵抗，此時，減毒ST能靶向定植于缺血缺氧區并大量增殖，發揮抗腫瘤作用，彌補ATO在缺血缺氧區抗腫瘤效力的不足。兩者作用互補，共同抑制晚期肝癌大鼠的腫瘤生長，減少肺轉移，延長總生存期。② 協同作用：Gao等[51]的研究表明，輻射能夠協助減少減毒ST對正常細胞的毒性，增強其在腫瘤細胞內的有效積聚，且兩者都可以刺激細胞因子的分泌，招募腫瘤組織中的免疫細胞，繼而協同抑制腫瘤生長，延長結腸癌小鼠生存期。Ahmed等[26]研究結果表明，鞘內注射減毒ST和抗PD-1抗體均可導致腫瘤細胞凋亡，減少腫瘤血管生成，共同抑制小鼠神經鞘瘤生長。Kung等[52]研究證實減毒ST和白蛋白-IL-2協同驅動特異性細胞免疫，延長特異性細胞免疫作用時間，增強特異性細胞免疫反應效果，抑制小鼠結直腸癌的生長。③ 增效作用：化療增強細菌靶向和細菌靶向增強化療是癌癥治療中非常強大的相互增效作用。減毒ST免疫療法在CHOP方案治療的動物中增強了NK細胞的細胞毒活性，并誘導了系統性淋巴瘤特異性的體液和細胞反應，從而顯著降低腫瘤活性[53]。
1.6 聯合新興技術
納米革蘭陰性菌外膜囊泡結構特殊，可通過刺激宿主免疫系統和逆轉抑制的腫瘤微環境抑制腫瘤生長。Aly等[54]通過減毒ST ATCC14028的外膜囊泡對人結直腸癌（HTC116）、乳腺癌（MCF-7）和肝細胞癌（HepG2）細胞株抗腫瘤活性影響的相關研究表明，納米減毒ST外膜囊泡易于通過毛細血管，能在腫瘤血管中快速分布；納米減毒ST外膜囊泡可引起VEGF基因表達下降，發揮抗血管生成作用；納米減毒ST外膜囊泡可上調腫瘤組織中Bax基因的表達，進而刺激細胞凋亡的內在途徑，誘導腫瘤細胞凋亡；納米減毒ST外膜囊泡體內的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）含量相對較高，PAMPs與模式識別受體相互作用，激活腫瘤細胞自噬，發揮抗腫瘤作用。
2 抑制繼發腫瘤轉移
減毒ST可通過Akt相關通路，抑制腫瘤轉移相關蛋白的產生進而抑制腫瘤轉移。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）參與了細胞外基質的降解、血管生成，在腫瘤的轉移中發揮重要作用，ST通過Akt/mTOR途徑降低MMP-9的表達，繼而抑制原發腫瘤中MMP-9的分泌和功能，減少了體外腫瘤的遷移和體內腫瘤結節的形成[55]。Chiu等[56]研究表明，減毒ST可以通過Akt/細胞外調節蛋白（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路降低黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠腫瘤細胞中參與腫瘤轉移的乙酰肝素酶的功能和表達，使小鼠肺內轉移結節數量減少。Lee等[57]的研究表明，減毒ST可以通過Akt/mTOR/P70S6K信號途徑抑制C-X-C趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白的表達，進而通過抑制配體受體反應，抑制黑色素瘤小鼠和肺癌小鼠體內腫瘤細胞從原發位點轉移到C-X-C家族趨化因子配體12（C-X-C family chemokine ligand 12，CXCL12）高表達位點的繼發定植，阻止腫瘤轉移。Pangilinan等[58]研究闡明減毒ST可以通過Akt/mTOR信號通路抑制對細胞遷移至關重要的上皮-間充質轉變誘導劑—SNAIL家族轉錄抑制因子1（snail family transcriptional repressor 1，SNAI1）的表達，繼而抑制黑色素瘤在小鼠體外和體內的轉移。
3 臨床試驗失敗的可能原因與改進方案
雖然減毒ST的細胞和動物實驗的抗腫瘤效果均十分明確，但是臨床試驗表明其未能完全在人腫瘤組織中建群，這兩者結果相矛盾，也大大影響了減毒ST在臨床細菌治療上的推廣[59]。這可能與人免疫系統的高度復雜性和ST的過度減毒有關，現有研究基于這兩方面提出了一些改進方案。
3.1 ST的過度減毒
減毒ST在降低對正常細胞的毒性作用的同時，也影響了它的抗腫瘤效用。為避免這一現象，可以通過以下幾種方法增強減毒ST的腫瘤靶向作用，繼而降低對ST的減毒需要。其一，創建一種營養缺陷型突變體，該突變體所需的特定營養物僅存在于腫瘤組織中，受營養物質趨化靶向腫瘤組織[60]。其二，將減毒ST必需基因置于缺氧條件啟動子下，使減毒ST只在乏氧的腫瘤組織中表達，同時迅速從正常組織中消除，以實現從正常組織中快速清除細菌，不會像減毒方法那樣損害細菌的其他功能或腫瘤適應性，減少正常組織中的細菌負荷并增加腫瘤靶向特異性[31]。其三，通過腫瘤內感染途徑，使大劑量ST繞過全身感染遇到的先天免疫殺傷，直接靶向腫瘤細胞[61]。其四，利用納米銀顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）提高ST的有效性和生物安全性，靶向腫瘤的AgNPs可以在完全根除腫瘤后清除殘留減毒ST以減少副作用[62]。
3.2 中性粒細胞和細胞自噬的肅清作用
中性粒細胞的免疫作用和細胞自噬不僅能針對腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用，還能肅清進入腫瘤組織的減毒ST。Tian等[63]認為減毒菌進入人體后，腫瘤細胞和固有免疫產生的巨噬細胞可通過TLR信號傳導產生趨化因子，促進中性粒細胞向腫瘤募集，中性粒細胞發揮的免疫作用雖然能在一定程度上殺死腫瘤細胞，但是腫瘤浸潤性中性粒細胞也會抑制壞死區的細菌，并抑制細菌遷移到存活的癌細胞區，減弱細菌的抗癌活性[64]，所以，減毒ST的ΔppGpp菌株介導的基因治療具有穩健的短期抗癌效果，但不能預防后續腫瘤復發和轉移，在最初細菌誘導的腫瘤縮小后開始重新生長[65]。中性粒細胞的募集降低了減毒ST的療效和壽命，特異性削弱細菌介導的免疫治療誘導的局部腫瘤浸潤中性粒細胞募集的替代策略可能是一種更可行的治療方法。減毒ST在臨床前模型中抑制腫瘤生長，但其在人體中的作用有限，可能是因為細胞產生了自噬反應，從而破壞了治療細菌。為了中和機體的這種保護性反應，可以將減毒ST與含有自噬抑制劑羥氯喹的長循環脂質體結合，以阻止減毒ST被細胞自噬作用破壞。堿化溶酶體等酸性囊泡，從而阻止被困在其中的減毒ST降解[66]。
3.3 蛋白酶滅活功能蛋白
蛋白酶可以干擾蛋白質加工、降解由減毒ST作為載體攜帶進入腫瘤組織的效應蛋白和分泌蛋白。解決該問題的最常用方法是使用一種或多種蛋白酶缺陷的細胞，但是在這一過程中，減毒ST在靶向腫瘤組織中定居的能力可能受到蛋白酶突變缺失影響而降低。其次是改造蛋白質以消除特異性蛋白酶切割位點，但是由于蛋白質結構-功能關系的限制，在其應用中可能具有局限性。最后，減毒ST可以作為細菌載體，通過攜帶蛋白酶抑制劑來有效克服蛋白酶，而且部分減毒ST菌株在將某些蛋白酶抑制劑遞送到腫瘤組織過程中可能會產生誘導腫瘤細胞凋亡的附加作用[66]。
4 總結與展望
綜上所述，減毒ST可在抑制原發腫瘤生長和繼發腫瘤轉移中發揮重要作用。然而，要想應用于臨床，如何在保證減毒ST安全性的同時保障其抗腫瘤活性，是亟需解決的一大難題，除增強減毒ST的靶向性以降低菌株的減毒必要性、逃避中性粒細胞和細胞自噬對ST的肅清作用和避免蛋白酶對起抗腫瘤作用的功能蛋白的降解外，尚需大量的臨床試驗和臨床前試驗去探索。這一問題的解決將為腫瘤患者精準治療提供一個新的治療選擇。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：尹艷梅負責查閱文獻、起草和撰寫文章；李俊峰和阮萬百負責修訂文章結構及文章重要論點；彭磊負責修訂論文格式；朱克祥給予指導性意見并對最終文稿的內容進行審閱。
0 引言
腫瘤是一種可在人體各個器官和組織發生的異常的、無法受到正常調控的細胞增生，并且如果不加以控制，腫瘤細胞會不斷向周圍正常組織蔓延，甚至通過血液或淋巴系統轉移至身體其他部位形成新的腫瘤。近年來，由于人口老齡化、環境污染、不健康的生活方式和飲食習慣，全球惡性腫瘤的發病率和死亡率呈現出快速增長的趨勢，研究[1]表明，惡性腫瘤已經成為當前全球70歲前死亡的首要原因，所以尋找更好的治療方案迫在眉睫。越來越多的研究者開始探尋細菌介導的腫瘤治療能否成為一種新的抗腫瘤治療方案。
沙門菌（Salmonella typhimurium，ST）是一種兼性胞內細菌，可在無氧條件下生長并能依賴腫瘤壞死區域增殖[2]。減毒ST在野生ST的基礎上進行基因修飾—刪除或削弱有毒性基因、增強免疫原性和抗腫瘤作用的基因，減弱對正常組織的毒性，并加強原有的抗腫瘤作用。筆者現主要從抑制原發腫瘤生長和減少繼發腫瘤發生兩方面具體闡述減毒ST發揮抗腫瘤作用的可能機制，并探討減毒ST臨床應用所面臨的問題及解決方案。
1 抑制原發腫瘤生長
1.1 靶向和定植作用
當腫瘤內富集的減毒ST量超過109/g時，可使其在腫瘤組織與正常組織的比值位于250∶1和9 000∶1之間，抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期[3]。Pawelek等[4]和Rabea等[5]研究發現，減毒ST尾靜脈注入攜帶黑色素瘤的小鼠體內后，可被絲氨酸、天冬氨酸和半乳糖/核糖等腫瘤表面受體吸引到腫瘤組織。同時刺激腫瘤細胞產生腫瘤壞死因子α、γ干擾素、白介素12等增強腫瘤血管通透性的細胞因子，協助其進入腫瘤[3, 6-8]。 Saltzman等[9]和Jawalagatti等[10]的研究結果也證明尾靜脈注射減毒ST時，減毒ST能夠靶向定植于小鼠乳腺癌組織。Ebelt等[11]和Tan等[12]的研究證明，在靜脈注射減毒ST時，減毒ST能夠優先定植于小鼠原位人胰腺導管腺癌腫瘤組織。以上研究表明，靜脈注射減毒ST后，減毒ST都能夠定植于腫瘤組織，能最大限度地減少腫瘤外毒性，實現精準治療。
1.2 免疫作用
減毒ST進入小鼠體內后通過細胞吞噬、免疫細胞浸潤和補體途徑激活，發揮免疫攻擊和抗腫瘤作用。Liang等[13]通過對多種重組減毒株的抗腫瘤作用進行評估證明了宿主在感染ST后，ST主要分布在腫瘤細胞胞質中，根據Ⅲ型分泌系統調節細胞功能，使其在一定程度上抵抗單核-巨噬系統對外來物質的清除作用，使ST能夠在巨噬細胞中存活。并且通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4信號通路向腫瘤組織中招募如中性粒細胞、巨噬細胞等固有免疫細胞吞噬腫瘤細胞[14-15]。Chen等[16]認為，招募到的免疫細胞被減毒ST原位分泌的鞭毛蛋白/TLR5/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路激活，進而產生活性氧、一氧化氮（nitric oxide，NO）、蛋白酶、膜穿孔劑、細胞因子等細胞毒性介質以殺死腫瘤細胞[17]。Yang等[18]制作的時間蛋白質組圖譜進一步提出減毒ST可以激活固有免疫和特異免疫的功能橋梁—補體途徑，誘導小鼠發生先天性、適應性免疫綜合防御。
除傳統的免疫作用外，減毒ST還可以引發腫瘤細胞發生焦亡、自噬作用，抑制腫瘤進展。既往研究[8]證實減毒ST進入腫瘤細胞后，被吞噬小體中的核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptor，NLR）識別后觸發形成炎性小體。大量富集在一起的炎性小體激活細胞焦亡的主要效應蛋白酶—含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1），進而誘導腫瘤細胞焦亡；除此之外，活化的caspase-1可以將巨噬細胞產生的前體IL-1β水解為IL-1β，進一步促進細胞免疫應答。與細胞焦亡作用類似，減毒ST進入宿主體內后，可通過Toll樣受體信號促進自噬小體的標記分子LC3募集到自噬小體，通過TLR/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路誘導腫瘤細胞自噬，抑制結直腸癌小鼠腫瘤進展。
1.3 營養競爭作用
Miyake等[19]的研究結果表明，減毒ST首先可以誘導內皮細胞凋亡和壞死，降低腫瘤中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和CD31陽性細胞百分比，從而抑制腫瘤內新血管生成，減少腫瘤營養供給通道；其次，刺激產生的固有免疫相關細胞可以和血小板協同誘導，激活凝血途徑，在腫瘤組織內部新生血管內形成血栓，阻斷腫瘤營養供給通道；最后，能在腫瘤厭氧區增殖旺盛，與腫瘤細胞競爭營養，抑制腫瘤生長[20]。除此之外，另外兩項與減毒ST抗血管生成相關的研究[21-22]中提出，減毒ST抑制腫瘤內新生血管形成還可以導致腫瘤微環境更加缺氧，進而形成低氧腫瘤微環境和減毒ST定植之間的正反饋循環，增強減毒ST的抗腫瘤效果。
1.4 質粒攜帶作用
因為減毒ST既能靶向實體腫瘤的缺氧壞死區，又易于重組操作[23]，所以它可以攜帶和共表達一些外源性免疫佐劑和抗原、治療基因和溶瘤病毒，如腫瘤相關抗原、細胞毒性分子、免疫調節分子、促凋亡蛋白、核酸、納米顆粒等進入腫瘤微環境[24-25]，可有效地誘導免疫細胞活化、細胞因子分泌、細胞毒性淋巴細胞產生和特異性抗體形成，激發有效的免疫反應[26-30]，抑制腫瘤生長。近幾年間與質粒攜帶作用相關的減毒ST抗腫瘤作用的研究見表1。
表1
減毒ST質粒攜帶作用相關研究
1.5 聯合傳統療法
1.5.1 改善化療藥物耐藥問題
腫瘤耐藥的發生主要有以下3點原因：① 腫瘤細胞的細胞周期易于停滯在耐藥的G0/G1期[42]；② 腫瘤細胞周圍過度生產的膠原、透明質酸等細胞外基質成分在腫瘤細胞周圍形成致密的基質屏障限制藥物進入[43]；③ 腫瘤細胞的細胞膜上的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）會將化療藥物泵出細胞[44]。減毒ST可以針對以上3點改善腫瘤耐藥。首先，減毒ST與重組甲硫氨酸酶聯合應用時，減毒ST可以誘導腫瘤細胞從耐藥的G0/G1期進入藥物敏感的S/G2/M期[19, 45-46]，隨后重組甲硫氨酸酶特異地將腫瘤細胞捕獲在S/G2期，使腫瘤細胞對藥物保持敏感性[47-48]。而且，甲硫氨酸是腫瘤細胞的“營養劑”，腫瘤細胞具有甲硫氨酸依賴性，腫瘤甲硫氨酸水平與腫瘤大小密切相關，甲硫氨酸酶可降解甲硫氨酸，進而影響腫瘤的營養供應。其次，減毒ST可以清除胰腺癌小鼠腫瘤細胞周圍的細胞外基質屏障，增加化療藥物的滲透濃度，改善耐藥[11]。最后，減毒ST可以通過轉錄后調節或者抑制Akt/mTOR途徑降低P-gp的表達，進而減少化療藥物的外排，改善耐藥[44]。
1.5.2 增強傳統療法的療效
減毒ST可以與傳統療法發生互補、協同、增效作用，增強傳統療法的療效。① 互補作用：實體瘤的腫瘤組織處于乏氧狀態（正常組織中氧含量為 3%～15%，腫瘤組織氧含量為1%） [49]。Zhao等[50]的研究表明，缺血缺氧可促使晚期肝癌發生三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）的抵抗，此時，減毒ST能靶向定植于缺血缺氧區并大量增殖，發揮抗腫瘤作用，彌補ATO在缺血缺氧區抗腫瘤效力的不足。兩者作用互補，共同抑制晚期肝癌大鼠的腫瘤生長，減少肺轉移，延長總生存期。② 協同作用：Gao等[51]的研究表明，輻射能夠協助減少減毒ST對正常細胞的毒性，增強其在腫瘤細胞內的有效積聚，且兩者都可以刺激細胞因子的分泌，招募腫瘤組織中的免疫細胞，繼而協同抑制腫瘤生長，延長結腸癌小鼠生存期。Ahmed等[26]研究結果表明，鞘內注射減毒ST和抗PD-1抗體均可導致腫瘤細胞凋亡，減少腫瘤血管生成，共同抑制小鼠神經鞘瘤生長。Kung等[52]研究證實減毒ST和白蛋白-IL-2協同驅動特異性細胞免疫，延長特異性細胞免疫作用時間，增強特異性細胞免疫反應效果，抑制小鼠結直腸癌的生長。③ 增效作用：化療增強細菌靶向和細菌靶向增強化療是癌癥治療中非常強大的相互增效作用。減毒ST免疫療法在CHOP方案治療的動物中增強了NK細胞的細胞毒活性，并誘導了系統性淋巴瘤特異性的體液和細胞反應，從而顯著降低腫瘤活性[53]。
1.6 聯合新興技術
納米革蘭陰性菌外膜囊泡結構特殊，可通過刺激宿主免疫系統和逆轉抑制的腫瘤微環境抑制腫瘤生長。Aly等[54]通過減毒ST ATCC14028的外膜囊泡對人結直腸癌（HTC116）、乳腺癌（MCF-7）和肝細胞癌（HepG2）細胞株抗腫瘤活性影響的相關研究表明，納米減毒ST外膜囊泡易于通過毛細血管，能在腫瘤血管中快速分布；納米減毒ST外膜囊泡可引起VEGF基因表達下降，發揮抗血管生成作用；納米減毒ST外膜囊泡可上調腫瘤組織中Bax基因的表達，進而刺激細胞凋亡的內在途徑，誘導腫瘤細胞凋亡；納米減毒ST外膜囊泡體內的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）含量相對較高，PAMPs與模式識別受體相互作用，激活腫瘤細胞自噬，發揮抗腫瘤作用。
2 抑制繼發腫瘤轉移
減毒ST可通過Akt相關通路，抑制腫瘤轉移相關蛋白的產生進而抑制腫瘤轉移。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）參與了細胞外基質的降解、血管生成，在腫瘤的轉移中發揮重要作用，ST通過Akt/mTOR途徑降低MMP-9的表達，繼而抑制原發腫瘤中MMP-9的分泌和功能，減少了體外腫瘤的遷移和體內腫瘤結節的形成[55]。Chiu等[56]研究表明，減毒ST可以通過Akt/細胞外調節蛋白（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路降低黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠腫瘤細胞中參與腫瘤轉移的乙酰肝素酶的功能和表達，使小鼠肺內轉移結節數量減少。Lee等[57]的研究表明，減毒ST可以通過Akt/mTOR/P70S6K信號途徑抑制C-X-C趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白的表達，進而通過抑制配體受體反應，抑制黑色素瘤小鼠和肺癌小鼠體內腫瘤細胞從原發位點轉移到C-X-C家族趨化因子配體12（C-X-C family chemokine ligand 12，CXCL12）高表達位點的繼發定植，阻止腫瘤轉移。Pangilinan等[58]研究闡明減毒ST可以通過Akt/mTOR信號通路抑制對細胞遷移至關重要的上皮-間充質轉變誘導劑—SNAIL家族轉錄抑制因子1（snail family transcriptional repressor 1，SNAI1）的表達，繼而抑制黑色素瘤在小鼠體外和體內的轉移。
3 臨床試驗失敗的可能原因與改進方案
雖然減毒ST的細胞和動物實驗的抗腫瘤效果均十分明確，但是臨床試驗表明其未能完全在人腫瘤組織中建群，這兩者結果相矛盾，也大大影響了減毒ST在臨床細菌治療上的推廣[59]。這可能與人免疫系統的高度復雜性和ST的過度減毒有關，現有研究基于這兩方面提出了一些改進方案。
3.1 ST的過度減毒
減毒ST在降低對正常細胞的毒性作用的同時，也影響了它的抗腫瘤效用。為避免這一現象，可以通過以下幾種方法增強減毒ST的腫瘤靶向作用，繼而降低對ST的減毒需要。其一，創建一種營養缺陷型突變體，該突變體所需的特定營養物僅存在于腫瘤組織中，受營養物質趨化靶向腫瘤組織[60]。其二，將減毒ST必需基因置于缺氧條件啟動子下，使減毒ST只在乏氧的腫瘤組織中表達，同時迅速從正常組織中消除，以實現從正常組織中快速清除細菌，不會像減毒方法那樣損害細菌的其他功能或腫瘤適應性，減少正常組織中的細菌負荷并增加腫瘤靶向特異性[31]。其三，通過腫瘤內感染途徑，使大劑量ST繞過全身感染遇到的先天免疫殺傷，直接靶向腫瘤細胞[61]。其四，利用納米銀顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）提高ST的有效性和生物安全性，靶向腫瘤的AgNPs可以在完全根除腫瘤后清除殘留減毒ST以減少副作用[62]。
3.2 中性粒細胞和細胞自噬的肅清作用
中性粒細胞的免疫作用和細胞自噬不僅能針對腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用，還能肅清進入腫瘤組織的減毒ST。Tian等[63]認為減毒菌進入人體后，腫瘤細胞和固有免疫產生的巨噬細胞可通過TLR信號傳導產生趨化因子，促進中性粒細胞向腫瘤募集，中性粒細胞發揮的免疫作用雖然能在一定程度上殺死腫瘤細胞，但是腫瘤浸潤性中性粒細胞也會抑制壞死區的細菌，并抑制細菌遷移到存活的癌細胞區，減弱細菌的抗癌活性[64]，所以，減毒ST的ΔppGpp菌株介導的基因治療具有穩健的短期抗癌效果，但不能預防后續腫瘤復發和轉移，在最初細菌誘導的腫瘤縮小后開始重新生長[65]。中性粒細胞的募集降低了減毒ST的療效和壽命，特異性削弱細菌介導的免疫治療誘導的局部腫瘤浸潤中性粒細胞募集的替代策略可能是一種更可行的治療方法。減毒ST在臨床前模型中抑制腫瘤生長，但其在人體中的作用有限，可能是因為細胞產生了自噬反應，從而破壞了治療細菌。為了中和機體的這種保護性反應，可以將減毒ST與含有自噬抑制劑羥氯喹的長循環脂質體結合，以阻止減毒ST被細胞自噬作用破壞。堿化溶酶體等酸性囊泡，從而阻止被困在其中的減毒ST降解[66]。
3.3 蛋白酶滅活功能蛋白
蛋白酶可以干擾蛋白質加工、降解由減毒ST作為載體攜帶進入腫瘤組織的效應蛋白和分泌蛋白。解決該問題的最常用方法是使用一種或多種蛋白酶缺陷的細胞，但是在這一過程中，減毒ST在靶向腫瘤組織中定居的能力可能受到蛋白酶突變缺失影響而降低。其次是改造蛋白質以消除特異性蛋白酶切割位點，但是由于蛋白質結構-功能關系的限制，在其應用中可能具有局限性。最后，減毒ST可以作為細菌載體，通過攜帶蛋白酶抑制劑來有效克服蛋白酶，而且部分減毒ST菌株在將某些蛋白酶抑制劑遞送到腫瘤組織過程中可能會產生誘導腫瘤細胞凋亡的附加作用[66]。
4 總結與展望
綜上所述，減毒ST可在抑制原發腫瘤生長和繼發腫瘤轉移中發揮重要作用。然而，要想應用于臨床，如何在保證減毒ST安全性的同時保障其抗腫瘤活性，是亟需解決的一大難題，除增強減毒ST的靶向性以降低菌株的減毒必要性、逃避中性粒細胞和細胞自噬對ST的肅清作用和避免蛋白酶對起抗腫瘤作用的功能蛋白的降解外，尚需大量的臨床試驗和臨床前試驗去探索。這一問題的解決將為腫瘤患者精準治療提供一個新的治療選擇。
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