引用本文： 李志剛, 賀祺琛, 周輝年, 焦作義. 基于生物信息學分析胃癌中RUNX1表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(7): 833-841. doi: 10.7507/1007-9424.202303040 復制
胃癌是全世界范圍內一種常見的消化道腫瘤，根據2020年國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IAIC）發布的統計數據顯示，胃癌已是全球第5大常見惡性腫瘤和第4大癌癥相關死亡原因，而我國胃癌發病數和死亡數分別占全球的44.0%和48.6%，胃癌防治形勢嚴峻[1]。由于早期癥狀不典型及缺乏特異性生物標志物，導致多數胃癌患者（70%）確診時已處于中晚期，即使接受手術，5年生存率仍低于30%，而對于一些早期患者經過及時治療后5年生存率可達90%[2-3]。因此，尋找高敏感性和特異性生物標志物對于胃癌患者的早期診斷和預后評估尤為重要。
Runt相關轉錄因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是RUNX轉錄因子家族（RUNX1、RUNX2、RUNX3）的成員，定位于染色體21q22。RUNX1于1991年首次被發現，因其參與急性髓系白血病患者的t（8;21）易位而被命名為急性髓系白血病基因1（acute myeloid leukemia，AML1）[4]。近期有研究證明，RUNX1在調節實體腫瘤進展所涉及的過程中發揮著重要作用，包括血管生成、癌細胞轉移、增殖、腫瘤細胞干性以及對抗癌藥物的化療耐藥性[5]。例如，Li等[6]在結直腸癌中發現RUNX1可以通過激活結直腸癌中Wnt/β-catenin通路以及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進腫瘤細胞轉移，同時RUNX1還通過上調藥物外排三磷酸腺苷結合框蛋白家族G2蛋白的表達以降低腫瘤細胞的化療敏感性[7]。但關于RUNX1在胃癌中的報道較少，且表達及作用機制尚無明確結論。本研究基于TCGA、GEO等公共數據庫分析RUNX1在胃癌中的表達水平及與預后的關系，并用臨床組織標本進行驗證，再通過細胞實驗分析其潛在功能，以期為胃癌患者的診斷、治療及預后評估提供幫助。
1 資料與方法
1.1 數據庫分析部分
從 TCGA 數據庫（
GO、KEGG富集分析：從TCGA數據庫下載胃癌RNA-seq數據，將基因表達數據進行歸一化處理，使用GSEA4.3.2軟件并利用MsigDB數據庫中的c5.go.v2023.1.Hs.symbols.gmt和c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt數據集進行RUNX1的GO、KEGG富集分析，定義P<0.05及矯正后的 P 值（false discovery rate，FDR）<0.05為顯著富集。
1.2 臨床病例驗證部分
1.2.1 病例收集
本研究回顧性收集蘭州大學第二醫院在2018年6月至2019年12月期間收治的胃癌患者的臨床病理資料。納入標準：① 經組織病理學檢查確診的原發性胃癌；② 術前未行放療、化療、靶向治療和免疫治療；③ 手術標本組織保存完整，有完整的隨訪記錄。排除標準：① 失訪患者；② 術前已行其他治療；③ 合并其他系統腫瘤。最終，本研究納入62例符合上述標準的胃癌患者。其中男48例，女14例；年齡25～73歲，病程5～37個月；臨床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期6例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例。最終收集62例患者手術切除的胃癌組織及其癌旁組織標本。所用組織均經石蠟包埋固定，用于病理切片染色。所有患者隨訪記錄完整，術前均無放、化療史。病例隨訪時間截至2022年6月30日。
1.2.2 染色方法
① 將收集的胃癌與癌旁組織的石蠟切片進行RUNX1免疫組織化學染色。染色過程參考Deng等[8]的研究。由2名病理科醫師獨立進行盲審評分。標本的評分通過染色強度評分（陰性染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分）和陽性細胞占比評分（<5%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分）來評估。最終免疫組織化學評分是染色強度和陽性細胞占比評分的乘積。評分標準參考于萍等[9]的研究：0～5分為RUNX1低表達，≥6分為RUNX1高表達。② 蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）：對收集的胃癌與癌旁組織進行HE染色，染色過程參考劉微[10]的研究。③ 天狼星紅染色：由于構成ECM的主要成分為其中的膠原分子，因此可通過天狼星紅對膠原進行著色，從而間接反映細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的改變。經天狼星紅染色后膠原纖維呈紅色，可通過統計區域內紅色占比面積作為衡量胃癌組織中膠原纖維含量的評價指標，并以此反映胃癌ECM中基質的沉積量。染色過程參考Rittié[11]的研究。
1.3 Transwell實驗（侵襲實驗）
胃癌細胞系AGS和HGC27購自上海中國科學院細胞庫（二者為經典胃癌細胞系，在胃癌生物學功能研究中使用范圍最廣），使用達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）培養，培養基中添有10%胎牛血清。所使用siRNA（si-001-RUNX1、si-002-RUNX1）購自銳博生物科技有限公司，其中si-001-RUNX1靶序列為5′-GCACTCTGGTCACTGTGAT-3′，si-002-RUNX1靶序列為5′-CCAGGTTGCAAGATTT-AAT-3′。實驗方法：于Transwell小室中加入無血清培養基稀釋后的基質膠（培養基與基質膠比為30∶1），放入培養箱中溫育4 h；取對數期生長的胃癌細胞系AGS和HGC27，利用Lipofectamine2000進行目標siRNA的轉染，轉染48 h后收集細胞，用無血清培養基重懸細胞；向上室中加入200 μL細胞懸液（20 000個細胞/小室），下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基；培養48 h后使用4%多聚甲醛固定，然后利用0.25%結晶紫染色30 min，PBS溶液洗滌3次。干燥后，使用生物顯微鏡拍照，利用Image J軟件計算進入下室的細胞量。具體步驟參考潘浩磊等[12]的研究進行，每組設立3個復孔。
1.4 統計學方法
利用SPSS 27.0對病理結果及實驗數據進行統計分析，使用Graph-Pad Prism 9軟件繪圖。計量資料符合正態分布時以均數±標準差（
±s）表示，采用兩獨立樣本比較的t檢驗進行組間比較，配對樣本采用配對t檢驗進行統計分析；計數資料以百分比表示，統計分析采用χ2檢驗或秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風險回歸模型進行生存分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RUNX1在胃癌與癌旁組織中的差異表達
TCGA數據庫數據顯示，RUNX1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織（P<0.001），在27例配對樣本中同樣如此（P<0.001），見圖1a和1b。此外，從GEO數據庫中獲取胃癌數據集GSE65801、GSE66229和GSE63089 進行表達比較分析，結果同樣證實RUNX1在胃癌組織中的高表達（圖1c～1e）。
圖1
示RUNX1在胃癌與癌旁組織中的差異表達及它與OS的關系
a、b：TCGA數據庫中RUNX1 mRNA在非配對（a）和配對（b）胃癌組織中的表達；c～e：GEO數據集中 ［GSE66229（c）、GSE63089（d）和GSE65801（e）］ RUNX1 mRNA在胃癌組織中的表達高于癌旁組織；f：不同RUNX1 mRNA表達水平胃癌患者的OS曲線
2.2 RUNX1表達水平與胃癌患者生存預后的關系
從Kaplan-Meier Plotter數據庫選取875例胃癌患者的信息，根據該網頁數據庫在線計算的RUNX1在胃癌中表達量的最佳截斷值（977），將患者分為高（≥977）、低（＜977）表達2組。生存分析結果顯示，RUNX1的差異表達影響胃癌患者的生存預后，與RUNX1低表達組的胃癌患者相比，RUNX1高表達患者的總生存期（overall survival，OS）較差（P<0.001），見圖1f。
2.3 RUNX1在胃癌中的GO和KEGG分析結果
GO分析和KEGG通路富集分析結果顯示，RUNX1不僅參與了包含膠原的ECM的構建，而且在ECM-受體相互作用通路上顯著富集（圖2a、2b）。此外，利用GEPIA數據庫進行基因相關性分析，結果顯示胃癌中RUNX1的表達與ECM-受體相互作用通路所涉及的基因，如COL1A2、COL3A1、COL5A1等表現出明顯的正相關性（圖2c～2e）。
圖2
示 RUNX1 在胃癌中的GO和KEGG分析結果
a：RUNX1在胃癌中參與的細胞組分（選中區域表示富集于ECM中的膠原形成）；b：RUNX1在胃癌中涉及的相關通路（選中區域表示富集于ECM-受體相互作用通路）；c～e：GEPIA數據庫中RUNX1的表達與COL1A2（c）、COL3A1（d）及COL5A1（e）表達存在正相關性
2.4 臨床胃癌樣本的HE、免疫組織化學及天狼星紅染色結果
臨床胃癌組織標本的免疫組織化學染色結果顯示，RUNX1在胃癌組織中的染色強度及染色陽性面積均強于或大于癌旁組織（圖3a），胃癌組織中免疫組織化學染色評分高于癌旁組織（P＜0.001，圖3b）；并且發現，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的胃癌組織中免疫組織化學染色評分高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織（P＜0.001，圖3c）。根據免疫組織化學染色評分結果（0～5分為RUNX1低表達，≥6分為RUNX1 高表達）將胃癌患者分為高、低表達2組（低表達22例，高表達40例），以分析RUNX1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征及術后OS之間的關系，結果顯示，RUNX1蛋白高表達胃癌患者的預后差于RUNX1蛋白低表達胃癌患者（P=0.003，圖3d）。RUNX1蛋白高表達和低表達在腫瘤大小（P=0.023）、神經/脈管浸潤（P=0.001）、T分期（P<0.001）、N分期（P<0.001）和pTNM分期（P<0.001）方面差異均有統計學意義（表1）。
圖3
示臨床胃癌樣本的免疫組織化學及天狼星紅染色結果
a：胃癌與癌旁組織的HE、免疫組織化學染色及天狼星紅染色結果；b：RUNX1蛋白表達在胃癌與癌旁組織中的免疫組織化學染色評分；c：RUNX1蛋白表達在胃癌Ⅲ+Ⅳ期和Ⅰ+Ⅱ期組織中的免疫組織化學染色評分；d：RUNX1蛋白高和低表達胃癌患者的總生存曲線；e：62例胃癌組織中RUNX1蛋白表達評分與天狼星紅紅色染色面積占比的相關性
表1
胃癌組織中RUNX1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 ［例（%）］
天狼星紅染色結果顯示，相較于RUNX1低表達的癌旁組織，RUNX1高表達的胃癌組織其ECM中基質的沉積量更多（圖3a）。同時將62例胃癌組織的RUNX1免疫組織化學染色評分和天狼星紅染色評分繪制散點圖（圖3e），發現二者呈正相關性（r=0.46，P＜0.001），結果進一步提示了RUNX1與ECM-受體相互作用通路間存在內在聯系。
2.5 胃癌患者OS影響因素的單因素與多因素Cox比例風險回歸分析結果
通過Cox比例風險回歸模型對62例胃癌患者的臨床病理特征進行分析，結果顯示，術前神經/脈管浸潤（P=0.030）、腫瘤T分期（P=0.011）、N分期（P=0.018）、M分期（P<0.001）、pTNM分期（P=0.011）和RUNX1表達水平（P=0.007）是影響胃癌患者術后OS的影響因素（表2）。進一步利用多因素Cox比例風險回歸模型進行分析，結果顯示M1期（P<0.001）和RUNX1高表達水平（P=0.034）是影響胃癌患者術后OS的危險因素（表3）。
表2
62例胃癌患者的單因素Cox比例風險回歸分析結果
表3
62例胃癌患者的多因素Cox比例風險回歸分析結果
2.6 RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響
通過Transwell（侵襲）實驗分析RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響，結果表明，使用小干擾RNA進行RUNX1的敲減后，實驗所用兩種胃癌細胞（HGC27、AGS）的平均侵襲能力相較于對照組均降低（HGC27：對照組767個，si-001組440個，si-002組187個；AGS：對照組430個，si-001組293個，si-002組281個），見圖4a和4b。
圖4
示RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響
a：敲減RUNX1后對HGC27細胞侵襲能力的影響；b：敲減RUNX1后對AGS細胞侵襲能力的影響；si-ctr指未轉入小干擾 RNA 的空白對照
3 討論
胃癌是一種起源于胃壁淺表上皮細胞的惡性腫瘤。胃癌的發生是一個漸進的過程，涉及環境、飲食、遺傳等多種因素。胃癌的早期診斷主要依靠內鏡篩查，但由于早期癥狀不典型，使得進展期胃癌患者的比率達70%以上[13]。因此，迫切需要一種有效的生物標志物來協助胃癌的診斷。
RUNX1是RUNX轉錄因子家族的成員，現已發現RUNX1在多種腫瘤的惡性演變過程中發揮著重要作用。在結直腸癌中，RUNX1可通過激活結直腸癌中的Wnt/β-catenin信號通路以及EMT來促進腫瘤細胞發生轉移[6]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，RUNX1表達水平的升高可有效預測腫瘤患者的復發和預后水平[14]。在胰腺癌中，敲低RUNX1可通過影響C-FOS基因的表達而抑制胰腺癌細胞系PANC-1的遷移和侵襲[15]。本研究基于TCGA和GEO數據庫，發現RUNX1在胃癌中相對高表達，且RUNX1高表達的胃癌患者其臨床預后明顯較差；分析62對胃癌和癌旁組織的免疫組織化學染色結果，進一步證實RUNX1在胃癌組織中高表達，且與臨床預后呈負相關。此外，有文獻[16-17]報道，作為一種轉錄因子，RUNX1的表達還受到類似炎癥、非編碼RNA等因素的調控，例如腫瘤壞死因子-β、核仁小RNA SNORA71C可不同程度刺激，導致RUNX1表達水平升高。這或許可以為研究胃癌中RUNX1上游調控因子提供方向。
ECM是細胞分泌的非細胞成分，可以為細胞提供基本的結構和生化支持。作為腫瘤組織的重要組成部分，ECM的重塑是腫瘤細胞發生發展的重要原因。另外，ECM-受體相互作用信號通路作為細胞內非常重要的信號通路之一，在腫瘤細胞的脫落、黏附、降解、運動、增殖等過程中起著重要作用[18]，并參與了胃癌的侵襲和轉移過程[18-19]。本研究通過對TCGA數據庫中胃癌患者的RNA-seq數據進行GO、KEGG富集分析，結果發現RUNX1不僅參與了包含膠原的ECM的構建，而且在ECM-受體相互作用通路顯著富集。結合免疫組織化學和天狼星紅染色結果，進一步證實RUNX1與胃癌ECM中基質的沉積呈正相關。此外，有研究發現RUNX1表達水平的升高會促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，由此促進ECM中基質的過度積累[20]，而在腫瘤發生侵襲和轉移的過程中，伴隨基質沉積的增加，堅硬的ECM會通過增強細胞骨架張力來促進局部ECM的組裝和黏附，使腫瘤細胞更容易突破基底膜向周圍組織發生擴散[21]。基于此，本研究利用siRNA將RUNX1進行敲減，發現2種胃癌細胞（AGS和HGC27）的侵襲能力顯著下降。由此推測，RUNX1可能是通過調控胃癌組織中ECM的改變來促進胃癌細胞的發生發展。
總之，本研究發現RUNX1是影響胃癌患者生存的預后因素，其高表達提示預后不良；且RUNX1參與胃癌ECM-受體相互作用通路的調節，影響胃癌細胞的侵襲，使得RUNX1有望成為診斷胃癌和評估患者預后的一個潛在靶點和生物標志物。
但本研究仍存在一定的局限性。首先，臨床樣本量的不足使得研究結果不可避免存在一定的誤差。其次，本研究相關基礎實驗只停留在細胞層次，還需體內試驗進一步驗證。另外，對于RUNX1在胃癌中的其他生物學功能還有待進一步研究和探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李志剛完成論文撰寫和實驗操作；李志剛、賀祺琛完成了隨訪和臨床信息收集；周輝年和焦作義審校論文。
倫理聲明：本研究已通過蘭州大學第二醫院的倫理審核批準［批文編號：2023A-412］。
胃癌是全世界范圍內一種常見的消化道腫瘤，根據2020年國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IAIC）發布的統計數據顯示，胃癌已是全球第5大常見惡性腫瘤和第4大癌癥相關死亡原因，而我國胃癌發病數和死亡數分別占全球的44.0%和48.6%，胃癌防治形勢嚴峻[1]。由于早期癥狀不典型及缺乏特異性生物標志物，導致多數胃癌患者（70%）確診時已處于中晚期，即使接受手術，5年生存率仍低于30%，而對于一些早期患者經過及時治療后5年生存率可達90%[2-3]。因此，尋找高敏感性和特異性生物標志物對于胃癌患者的早期診斷和預后評估尤為重要。
Runt相關轉錄因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是RUNX轉錄因子家族（RUNX1、RUNX2、RUNX3）的成員，定位于染色體21q22。RUNX1于1991年首次被發現，因其參與急性髓系白血病患者的t（8;21）易位而被命名為急性髓系白血病基因1（acute myeloid leukemia，AML1）[4]。近期有研究證明，RUNX1在調節實體腫瘤進展所涉及的過程中發揮著重要作用，包括血管生成、癌細胞轉移、增殖、腫瘤細胞干性以及對抗癌藥物的化療耐藥性[5]。例如，Li等[6]在結直腸癌中發現RUNX1可以通過激活結直腸癌中Wnt/β-catenin通路以及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進腫瘤細胞轉移，同時RUNX1還通過上調藥物外排三磷酸腺苷結合框蛋白家族G2蛋白的表達以降低腫瘤細胞的化療敏感性[7]。但關于RUNX1在胃癌中的報道較少，且表達及作用機制尚無明確結論。本研究基于TCGA、GEO等公共數據庫分析RUNX1在胃癌中的表達水平及與預后的關系，并用臨床組織標本進行驗證，再通過細胞實驗分析其潛在功能，以期為胃癌患者的診斷、治療及預后評估提供幫助。
1 資料與方法
1.1 數據庫分析部分
從 TCGA 數據庫（
GO、KEGG富集分析：從TCGA數據庫下載胃癌RNA-seq數據，將基因表達數據進行歸一化處理，使用GSEA4.3.2軟件并利用MsigDB數據庫中的c5.go.v2023.1.Hs.symbols.gmt和c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt數據集進行RUNX1的GO、KEGG富集分析，定義P<0.05及矯正后的 P 值（false discovery rate，FDR）<0.05為顯著富集。
1.2 臨床病例驗證部分
1.2.1 病例收集
本研究回顧性收集蘭州大學第二醫院在2018年6月至2019年12月期間收治的胃癌患者的臨床病理資料。納入標準：① 經組織病理學檢查確診的原發性胃癌；② 術前未行放療、化療、靶向治療和免疫治療；③ 手術標本組織保存完整，有完整的隨訪記錄。排除標準：① 失訪患者；② 術前已行其他治療；③ 合并其他系統腫瘤。最終，本研究納入62例符合上述標準的胃癌患者。其中男48例，女14例；年齡25～73歲，病程5～37個月；臨床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期6例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例。最終收集62例患者手術切除的胃癌組織及其癌旁組織標本。所用組織均經石蠟包埋固定，用于病理切片染色。所有患者隨訪記錄完整，術前均無放、化療史。病例隨訪時間截至2022年6月30日。
1.2.2 染色方法
① 將收集的胃癌與癌旁組織的石蠟切片進行RUNX1免疫組織化學染色。染色過程參考Deng等[8]的研究。由2名病理科醫師獨立進行盲審評分。標本的評分通過染色強度評分（陰性染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分）和陽性細胞占比評分（<5%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分）來評估。最終免疫組織化學評分是染色強度和陽性細胞占比評分的乘積。評分標準參考于萍等[9]的研究：0～5分為RUNX1低表達，≥6分為RUNX1高表達。② 蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）：對收集的胃癌與癌旁組織進行HE染色，染色過程參考劉微[10]的研究。③ 天狼星紅染色：由于構成ECM的主要成分為其中的膠原分子，因此可通過天狼星紅對膠原進行著色，從而間接反映細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的改變。經天狼星紅染色后膠原纖維呈紅色，可通過統計區域內紅色占比面積作為衡量胃癌組織中膠原纖維含量的評價指標，并以此反映胃癌ECM中基質的沉積量。染色過程參考Rittié[11]的研究。
1.3 Transwell實驗（侵襲實驗）
胃癌細胞系AGS和HGC27購自上海中國科學院細胞庫（二者為經典胃癌細胞系，在胃癌生物學功能研究中使用范圍最廣），使用達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）培養，培養基中添有10%胎牛血清。所使用siRNA（si-001-RUNX1、si-002-RUNX1）購自銳博生物科技有限公司，其中si-001-RUNX1靶序列為5′-GCACTCTGGTCACTGTGAT-3′，si-002-RUNX1靶序列為5′-CCAGGTTGCAAGATTT-AAT-3′。實驗方法：于Transwell小室中加入無血清培養基稀釋后的基質膠（培養基與基質膠比為30∶1），放入培養箱中溫育4 h；取對數期生長的胃癌細胞系AGS和HGC27，利用Lipofectamine2000進行目標siRNA的轉染，轉染48 h后收集細胞，用無血清培養基重懸細胞；向上室中加入200 μL細胞懸液（20 000個細胞/小室），下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基；培養48 h后使用4%多聚甲醛固定，然后利用0.25%結晶紫染色30 min，PBS溶液洗滌3次。干燥后，使用生物顯微鏡拍照，利用Image J軟件計算進入下室的細胞量。具體步驟參考潘浩磊等[12]的研究進行，每組設立3個復孔。
1.4 統計學方法
利用SPSS 27.0對病理結果及實驗數據進行統計分析，使用Graph-Pad Prism 9軟件繪圖。計量資料符合正態分布時以均數±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本比較的t檢驗進行組間比較，配對樣本采用配對t檢驗進行統計分析；計數資料以百分比表示，統計分析采用χ2檢驗或秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風險回歸模型進行生存分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RUNX1在胃癌與癌旁組織中的差異表達
TCGA數據庫數據顯示，RUNX1在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織（P<0.001），在27例配對樣本中同樣如此（P<0.001），見圖1a和1b。此外，從GEO數據庫中獲取胃癌數據集GSE65801、GSE66229和GSE63089 進行表達比較分析，結果同樣證實RUNX1在胃癌組織中的高表達（圖1c～1e）。
圖1
示RUNX1在胃癌與癌旁組織中的差異表達及它與OS的關系
a、b：TCGA數據庫中RUNX1 mRNA在非配對（a）和配對（b）胃癌組織中的表達；c～e：GEO數據集中 ［GSE66229（c）、GSE63089（d）和GSE65801（e）］ RUNX1 mRNA在胃癌組織中的表達高于癌旁組織；f：不同RUNX1 mRNA表達水平胃癌患者的OS曲線
2.2 RUNX1表達水平與胃癌患者生存預后的關系
從Kaplan-Meier Plotter數據庫選取875例胃癌患者的信息，根據該網頁數據庫在線計算的RUNX1在胃癌中表達量的最佳截斷值（977），將患者分為高（≥977）、低（＜977）表達2組。生存分析結果顯示，RUNX1的差異表達影響胃癌患者的生存預后，與RUNX1低表達組的胃癌患者相比，RUNX1高表達患者的總生存期（overall survival，OS）較差（P<0.001），見圖1f。
2.3 RUNX1在胃癌中的GO和KEGG分析結果
GO分析和KEGG通路富集分析結果顯示，RUNX1不僅參與了包含膠原的ECM的構建，而且在ECM-受體相互作用通路上顯著富集（圖2a、2b）。此外，利用GEPIA數據庫進行基因相關性分析，結果顯示胃癌中RUNX1的表達與ECM-受體相互作用通路所涉及的基因，如COL1A2、COL3A1、COL5A1等表現出明顯的正相關性（圖2c～2e）。
圖2
示 RUNX1 在胃癌中的GO和KEGG分析結果
a：RUNX1在胃癌中參與的細胞組分（選中區域表示富集于ECM中的膠原形成）；b：RUNX1在胃癌中涉及的相關通路（選中區域表示富集于ECM-受體相互作用通路）；c～e：GEPIA數據庫中RUNX1的表達與COL1A2（c）、COL3A1（d）及COL5A1（e）表達存在正相關性
2.4 臨床胃癌樣本的HE、免疫組織化學及天狼星紅染色結果
臨床胃癌組織標本的免疫組織化學染色結果顯示，RUNX1在胃癌組織中的染色強度及染色陽性面積均強于或大于癌旁組織（圖3a），胃癌組織中免疫組織化學染色評分高于癌旁組織（P＜0.001，圖3b）；并且發現，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的胃癌組織中免疫組織化學染色評分高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織（P＜0.001，圖3c）。根據免疫組織化學染色評分結果（0～5分為RUNX1低表達，≥6分為RUNX1 高表達）將胃癌患者分為高、低表達2組（低表達22例，高表達40例），以分析RUNX1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征及術后OS之間的關系，結果顯示，RUNX1蛋白高表達胃癌患者的預后差于RUNX1蛋白低表達胃癌患者（P=0.003，圖3d）。RUNX1蛋白高表達和低表達在腫瘤大小（P=0.023）、神經/脈管浸潤（P=0.001）、T分期（P<0.001）、N分期（P<0.001）和pTNM分期（P<0.001）方面差異均有統計學意義（表1）。
圖3
示臨床胃癌樣本的免疫組織化學及天狼星紅染色結果
a：胃癌與癌旁組織的HE、免疫組織化學染色及天狼星紅染色結果；b：RUNX1蛋白表達在胃癌與癌旁組織中的免疫組織化學染色評分；c：RUNX1蛋白表達在胃癌Ⅲ+Ⅳ期和Ⅰ+Ⅱ期組織中的免疫組織化學染色評分；d：RUNX1蛋白高和低表達胃癌患者的總生存曲線；e：62例胃癌組織中RUNX1蛋白表達評分與天狼星紅紅色染色面積占比的相關性
表1
胃癌組織中RUNX1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 ［例（%）］
天狼星紅染色結果顯示，相較于RUNX1低表達的癌旁組織，RUNX1高表達的胃癌組織其ECM中基質的沉積量更多（圖3a）。同時將62例胃癌組織的RUNX1免疫組織化學染色評分和天狼星紅染色評分繪制散點圖（圖3e），發現二者呈正相關性（r=0.46，P＜0.001），結果進一步提示了RUNX1與ECM-受體相互作用通路間存在內在聯系。
2.5 胃癌患者OS影響因素的單因素與多因素Cox比例風險回歸分析結果
通過Cox比例風險回歸模型對62例胃癌患者的臨床病理特征進行分析，結果顯示，術前神經/脈管浸潤（P=0.030）、腫瘤T分期（P=0.011）、N分期（P=0.018）、M分期（P<0.001）、pTNM分期（P=0.011）和RUNX1表達水平（P=0.007）是影響胃癌患者術后OS的影響因素（表2）。進一步利用多因素Cox比例風險回歸模型進行分析，結果顯示M1期（P<0.001）和RUNX1高表達水平（P=0.034）是影響胃癌患者術后OS的危險因素（表3）。
表2
62例胃癌患者的單因素Cox比例風險回歸分析結果
表3
62例胃癌患者的多因素Cox比例風險回歸分析結果
2.6 RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響
通過Transwell（侵襲）實驗分析RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響，結果表明，使用小干擾RNA進行RUNX1的敲減后，實驗所用兩種胃癌細胞（HGC27、AGS）的平均侵襲能力相較于對照組均降低（HGC27：對照組767個，si-001組440個，si-002組187個；AGS：對照組430個，si-001組293個，si-002組281個），見圖4a和4b。
圖4
示RUNX1對胃癌細胞侵襲能力的影響
a：敲減RUNX1后對HGC27細胞侵襲能力的影響；b：敲減RUNX1后對AGS細胞侵襲能力的影響；si-ctr指未轉入小干擾 RNA 的空白對照
3 討論
胃癌是一種起源于胃壁淺表上皮細胞的惡性腫瘤。胃癌的發生是一個漸進的過程，涉及環境、飲食、遺傳等多種因素。胃癌的早期診斷主要依靠內鏡篩查，但由于早期癥狀不典型，使得進展期胃癌患者的比率達70%以上[13]。因此，迫切需要一種有效的生物標志物來協助胃癌的診斷。
RUNX1是RUNX轉錄因子家族的成員，現已發現RUNX1在多種腫瘤的惡性演變過程中發揮著重要作用。在結直腸癌中，RUNX1可通過激活結直腸癌中的Wnt/β-catenin信號通路以及EMT來促進腫瘤細胞發生轉移[6]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，RUNX1表達水平的升高可有效預測腫瘤患者的復發和預后水平[14]。在胰腺癌中，敲低RUNX1可通過影響C-FOS基因的表達而抑制胰腺癌細胞系PANC-1的遷移和侵襲[15]。本研究基于TCGA和GEO數據庫，發現RUNX1在胃癌中相對高表達，且RUNX1高表達的胃癌患者其臨床預后明顯較差；分析62對胃癌和癌旁組織的免疫組織化學染色結果，進一步證實RUNX1在胃癌組織中高表達，且與臨床預后呈負相關。此外，有文獻[16-17]報道，作為一種轉錄因子，RUNX1的表達還受到類似炎癥、非編碼RNA等因素的調控，例如腫瘤壞死因子-β、核仁小RNA SNORA71C可不同程度刺激，導致RUNX1表達水平升高。這或許可以為研究胃癌中RUNX1上游調控因子提供方向。
ECM是細胞分泌的非細胞成分，可以為細胞提供基本的結構和生化支持。作為腫瘤組織的重要組成部分，ECM的重塑是腫瘤細胞發生發展的重要原因。另外，ECM-受體相互作用信號通路作為細胞內非常重要的信號通路之一，在腫瘤細胞的脫落、黏附、降解、運動、增殖等過程中起著重要作用[18]，并參與了胃癌的侵襲和轉移過程[18-19]。本研究通過對TCGA數據庫中胃癌患者的RNA-seq數據進行GO、KEGG富集分析，結果發現RUNX1不僅參與了包含膠原的ECM的構建，而且在ECM-受體相互作用通路顯著富集。結合免疫組織化學和天狼星紅染色結果，進一步證實RUNX1與胃癌ECM中基質的沉積呈正相關。此外，有研究發現RUNX1表達水平的升高會促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，由此促進ECM中基質的過度積累[20]，而在腫瘤發生侵襲和轉移的過程中，伴隨基質沉積的增加，堅硬的ECM會通過增強細胞骨架張力來促進局部ECM的組裝和黏附，使腫瘤細胞更容易突破基底膜向周圍組織發生擴散[21]。基于此，本研究利用siRNA將RUNX1進行敲減，發現2種胃癌細胞（AGS和HGC27）的侵襲能力顯著下降。由此推測，RUNX1可能是通過調控胃癌組織中ECM的改變來促進胃癌細胞的發生發展。
總之，本研究發現RUNX1是影響胃癌患者生存的預后因素，其高表達提示預后不良；且RUNX1參與胃癌ECM-受體相互作用通路的調節，影響胃癌細胞的侵襲，使得RUNX1有望成為診斷胃癌和評估患者預后的一個潛在靶點和生物標志物。
但本研究仍存在一定的局限性。首先，臨床樣本量的不足使得研究結果不可避免存在一定的誤差。其次，本研究相關基礎實驗只停留在細胞層次，還需體內試驗進一步驗證。另外，對于RUNX1在胃癌中的其他生物學功能還有待進一步研究和探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李志剛完成論文撰寫和實驗操作；李志剛、賀祺琛完成了隨訪和臨床信息收集；周輝年和焦作義審校論文。
倫理聲明：本研究已通過蘭州大學第二醫院的倫理審核批準［批文編號：2023A-412］。
