引用本文： 趙姣姣, 張升寧, 莽源祎, 高楊, 李立. 致敏大鼠肝移植后抗體介導的排斥反應的模型研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(6): 674-680. doi: 10.7507/1007-9424.202303007 復制
肝移植受者在術后會發生抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR） [1-2]。發生AMR的肝移植受者會出現急性膽管損傷、肝臟快速纖維化等情況，預后較差甚至會導致死亡。一些不明原因的移植物失功能考慮可能與AMR有關[3]。研究顯示，供者特異性抗體（donor-specific antibodies，DSA）是肝臟發生AMR的危險因素[4]，新生DSA與慢性排斥、移植物纖維化和功能障礙相關[4]。特別是當肝移植受者體含內有高水平的DSA時，治療效果不良[2, 4]。目前，AMR的機制尚不清楚，微血管炎癥[5]、基因表達譜[6]和治療性試驗[7]在AMR相關的肝移植中的作用仍有待探索。根據現有共識對肝移植受者給予合適的治療方案是一個難題[8-10]。為了更深入探索AMR的相關機制，筆者團隊建立了以Lewis大鼠為受者、Brown Norway（BN）大鼠為供者的致敏大鼠肝移植模型，通過動物模型初步研究致敏大鼠肝移植發生DSA相關AMR的病理學特點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及器械材料
Lewis大鼠，雄性，250～290 g，12只，10～12周齡；BN大鼠，雄性，250～280 g，6只，10～12周齡；均從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買 ［生產許可證號：SCXK（京）2016-0006］。在昆明醫科大學實驗動物學部完成飼養與手術，實驗動物都為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別。所有實驗動物均通過昆明醫科大學動物倫理學部審批（審批號：kmmu20211208）。
器械材料：剪刀、血管鉗、血管夾等（蘇州市朗米尼康醫療器械有限公司），細胞過濾器（40 μm，美國FALCON公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS；合肥蘭杰柯有限公司），流式細胞儀（德國貝克曼庫爾特公司），5%牛血清白蛋白（美國Sigma公司），RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），細胞形態學（HE、Masson）染色試劑盒、紅細胞裂解液等實驗耗材（北京索萊寶科技有限公司），C4d、CD20、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM等抗體（美國GeneTex公司）。
1.2 實驗分組
本實驗以Lewis大鼠為受者、BN大鼠為供者，采用隨機數字表法將Lewis大鼠進行分組，每組受者存活數量為3只（n=3）：Lewis對照組（LC組）、直接移植組（T組）、致敏組（S組）和致敏后移植組（TS組）。LC組大鼠不做任何處理；T組大鼠直接進行移植；S組只進行致敏過程，不實施肝移植；TS組于致敏2周后進行肝移植。LC組和S組的大鼠沒有實施肝移植手術，其實驗相關指標取材時間與T組和TS組移植后的大鼠一致。在實驗過程中，保證未移植組的大鼠均是正常健康大鼠。
1.3 模型建立
1.3.1 大鼠原位肝移植模型的建立
大鼠肝移植模型采用Kamada等[11]提出的“二袖套法”進行模型的建立，受者和供者術前8 h禁食，均采用乙醚進行麻醉。供者游離左膈下靜脈、食管后靜脈叢、門靜脈、肝下下腔靜脈，右腎上腺靜脈游離并結扎。隨后對供肝進行灌注，當肝臟完全變為土黃色后，取出供肝并保存于4 ℃生理鹽水中。將自制的聚乙烯套管套于門靜脈和肝下下腔靜脈中，等待移植于受者體內。受者肝臟的游離與結扎方法同供者，游離完畢后，取出受者肝臟并將供肝置入肝窩內，按照團隊改良的方法[12]進行肝上下腔靜脈（vena cava superior inferior hepatis，SHVC）的吻合，隨后完成肝下下腔靜脈和膽管的套管，無肝期結束以門靜脈和SHVC開放后肝臟變成紅色為標志。清理腹腔后進行關腹，大鼠蘇醒后可在籠中自由活動。
1.3.2 致敏模型的建立
先將BN大鼠的脾臟取出，剪成片狀，在40 μm的細胞過濾器中用研磨器研磨，研磨后的細胞與組織經過細胞過濾器后，得到細胞懸液，再用紅細胞裂解液按照說明書先裂解過濾后得到的細胞，然后使用RPMI 1640培養基將細胞連續沖洗2次，顯微鏡下使用血細胞計數器進行計數，計數后將5×107的細胞吸入到1 mL的PBS中，進行吹打重懸，再將細胞從Lewis大鼠的尾靜脈進行注射。
1.4 實驗相關指標檢測
1.4.1 T組與TS組大鼠的肝功能檢測
取T組和TS組Lewis大鼠移植術后第14 天的血液，離心（4 ℃，2 800 r/min，5 min）獲得血清，檢測天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ谷酰基轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）和肌酐（creatinine，CRE）水平。
1.4.2 DSA（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM）和C4d表達情況檢測
① DSA檢測：取正常BN大鼠1×106個脾細胞溶于50 μL的PBS中，并與200 μL 5%牛血清白蛋白在4 ℃環境中孵育30 min，隨后將T組和TS組Lewis大鼠的血清與脾細胞在室溫條件下孵育1 h，以Mouse anti-Rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgM作為二抗與洗滌后的細胞在4 ℃環境中孵育30 min，PBS洗滌后采用流式細胞儀對其DSA的水平進行檢測，流式數據采用Flowjo軟件進行分析。② C4d檢測：LC組和S組直接取Lewis大鼠的脾臟，T組和TS組因實施了肝移植手術，取移植后的Lewis大鼠的脾臟進行脾細胞的分離，以C4d抗體為一抗，與脾細胞進行孵育，PBS洗滌后，選用自帶熒光的IgG抗體為二抗，再與脾細胞進行孵育，PBS再次洗滌后采用流式細胞儀檢測C4d的表達情況。
1.4.3 肝組織的病理學分析
T組和TS組Lewis大鼠接受肝移植手術后第14 天（LS和S組為對應時點），給予吸入過量乙醚、安樂死處理，取肝臟組織用4%的多聚甲醛進行固定，肝臟組織再經脫水處理后制成蠟塊，采用病理切片機將組織切為4 μm厚于載玻片上，二甲苯進行脫蠟后，按照HE染色試劑盒及改良Masson三色染色試劑盒說明書對2組Lewis大鼠的肝臟組織進行染色，顯微鏡下分析病理學特點。
1.4.4 排斥反應活性指數（rejection activity index，RAI）評分
根據2016年提出的Banff評分標準[13]中的RAI評分準則對T組和TS組肝移植術后第14 天的Lewis大鼠的肝臟分別從門管區炎癥（僅少數門管區可見淋巴細胞1分，多數門管區出現混合炎癥細胞、門管區擴大2分，多數門管區出現混合炎癥細胞、周圍肝組織出現炎癥細胞3分）、膽管炎癥（少數小葉間膽管上皮出現炎癥細胞1分，多數膽管上皮出現炎癥細胞浸潤2分，出現膽管退化3分）和血管炎癥（少數小葉間血管出現血管炎癥改變1分，多數小葉間膽管出現血管炎癥改變2分，中重度中央靜脈炎及周圍肝細胞壞死3分）進行3個方面的評分。1～2分：無急性排斥反應；3分：臨界性排斥反應；4～5分：輕度急性排斥反應；6～7分：中度急性排斥反應；8～9分：重度急性排斥反應。對鏡下 ≥3個視野進行評分，并取均值得到最后的分值。根據均值確定其發生排斥反應的程度。
1.4.5 肝臟組織的免疫組織化學分析
對LC組、T組、S組和TS組Lewis大鼠的肝臟組織切片通過烤片、檸檬酸修復抗原后分別進行C4d、CK-19和CD20抗體染色。操作方法按照抗體說明書進行。C4d系體液免疫反應的指標，對C4d的評分可以驗證移植后Lewis大鼠是否發生AMR。C4d著色強度（無著色為0分，≤10% 為1分，≤50%但 ＞10% 為2分，＞50%為3分）。C4d陽性診斷標準：陽性著色強度為3分并且滿足以下3項中的任意2項：① ≥4個門管區內有毛細血管內皮著色；② 肝竇內皮淺性著色；③ ≥2個中央靜脈血管內皮著色。
2 結果
2.1 致敏后Lewis大鼠體內DSA和C4d表達陽性率升高
用流式細胞儀檢測T組和TS組移植后Lewis大鼠血清中DSA的表達，同時檢測LC組、T組、S組和TS組大鼠血清中C4d的表達。結果顯示（圖1a～1e）：TS組大鼠體內會誘導DSA的產生，TS組大鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c表達陽性率較T組高，表明致敏后可上調受者大鼠的DSA表達。因DSA是受者在移植供者的組織或器官后，其體內產生的針對供者組織抗原的一些特異性抗體，而LC組和S組未行移植手術，大鼠體內不會產生DSA，故無對應的DSA數據。
圖1
示各組Lewis大鼠的DSA和C4d表達、肝功能以及RAI評分和C4d評分結果
a～e：T組和TS組Lewis大鼠的DSA表達結果，IgG1（a）、IgG2a（b）、IgG2b（c）、IgG2c（d）和IgM（e）；f：4 組Lewis大鼠的C4d表達結果；g、h：4 組Lewis大鼠的肝功能指標（g）、RAI評分及C4d評分（h）結果；因本研究
C4d的出現代表經典途徑的補體激活，LC組、S組、T組和TS組Lewis大鼠體內都有可能出現，因此，對4組大鼠血清中C4d的表達均進行了檢測。結果顯示（圖1f）：與LC組相比，S組和TS組Lewis大鼠的C4d表達陽性率升高，表明致敏處理對大鼠C4d的表達有明顯影響；T組數據表明移植術對大鼠體內C4d的表達會有影響；與T組相比，TS組Lewis大鼠的C4d表達陽性率升高，表明致敏處理可以影響C4d的表達。
2.2 致敏后Lewis大鼠發生排斥反應
本實驗中針對大鼠發生排斥反應的肝功能，主要觀察的指標為TB。肝功能檢測結果顯示，與T組對比，TS組Lewis大鼠的TB、AST和ALP水平升高，ALT、GGT和CRE差距不大（圖1g）。根據2016年Banff工作組提出的RAI評分，TS組Lewis大鼠的RAI評分，以及門管區炎癥、膽管損傷和血管炎癥評分更高，組織學評分以及C4d評分也高于T組，提示致敏后受者Lewis大鼠發生了排斥反應，見圖1h。
2.3 致敏后Lewis大鼠發生的排斥反應符合AMR的病理學特點
LC組、S組、T組和TS組Lewis大鼠的肝臟組織在光學顯微鏡下觀察，HE染色結果顯示（圖2a～2d）：① 與LC組相比，S組Lewis大鼠肝臟組織中的肝細胞、門靜脈、膽管和中央靜脈均沒有出現明顯損傷（圖2a和2c）。② T組和TS組Lewis大鼠的肝細胞、毛細血管和膽管出現較為嚴重的損傷。③ 與S組相比，TS組Lewis大鼠的門靜脈出現大量炎癥細胞，毛細血管出現破損等較為嚴重的情況。與T組相比，TS組Lewis大鼠出現門靜脈炎癥，表現為炎癥細胞增多；出現毛細血管炎癥，表現為炎癥細胞的浸潤和內皮損傷脫落；膽管損傷程度更為嚴重，表現為膽管形態改變，膽管周圍不完整，膽管壁受損（圖2b和2d）。
圖2
示各組Lewis大鼠的肝臟組織的HE染色和免疫組織化學染色結果
a～d：4組Lewis大鼠的肝臟形態學改變（HE ×200），LC組（a）和S組（c）幾乎無炎癥表現，T組（b）出現肝細胞損傷、肝血竇間有多數淋巴細胞浸潤、膽管上皮腫脹，TS組（d）出現大量炎癥細胞浸潤、中央靜脈出現重度損傷、膽管接近消失，黑箭所指為淋巴細胞的浸潤；e～h：4組Lewis大鼠的C4d免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（e）和S組（g）肝臟血管內皮幾乎沒有C4d沉積，T組（f）少部分毛細血管內皮有C4d的沉積，TS組（h）的血管內皮細胞有 ＞50%的管腔C4d沉積，黑箭所指為C4d陽性；i～l：4組Lewis大鼠的肝臟纖維化改變結果（Masson染色 ×200），LC組（i）和S組（k）肝臟組織幾乎沒有發生纖維化，T組（j）僅有極少部分組織出現纖維化，TS組（l）肝臟組織出現大部分纖維化，紅箭所指為肝臟纖維化改變；m～p：4組Lewis大鼠的CK-19免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（m）和S組（o）的膽管保持完整、膽管上皮細胞排列整齊、呈圓形，T組（n）少部分膽管遭到破壞、膽管上皮細胞破損，TS組（p）出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解，黑箭所指為未被破壞的膽管，紅箭所指為膽管損傷后的狀態；q～t：4組Lewis大鼠的CD20免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（q）和S組（s）無CD20細胞浸潤，T組（r）少部分組織有CD20細胞，TS組（t）出現大量CD20細胞浸潤，黑箭所指為CD20細胞浸潤
在C4d染色（圖2e～2h）方面，由于LC組與S組的Lewis大鼠均沒有進行肝移植手術，肝臟中央靜脈和其他毛細血管內皮無C4d的沉積（圖2e和2g），而T組和TS組的Lewis大鼠在移植后均出現了C4d的沉積。與LC組相比，T組少部分毛細血管內皮著色；與T組相比，TS組的血管內皮細胞 ＞50%的細胞陽性著色，C4d呈彌漫性沉積，范圍更廣（圖2f和2h）。在Masson染色（圖2i～2l）方面，LC組與S組的Lewis大鼠幾乎沒有發生肝臟纖維化（圖2i和2k）；與LC組對比，T組在移植后第14 天，肝臟發生輕度纖維化，TS組肝臟發生中度纖維化；與T組相比，TS組大鼠肝臟發生更明顯的纖維化（圖2j和2l）。膽管CK-19染色顯示，LC組與S組的膽管上皮幾乎沒有發生炎癥等情況（圖2m和2o）；與S組對比，TS組出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解；與T組相比，TS組出現膽管嚴重的損傷（圖2n和2p）。LC組和S組Lewis大鼠肝臟組織經CD20染色后，沒有發現CD20細胞浸潤（圖2q和2s）；與LC組相比，T組肝臟存在部分CD20細胞浸潤；與T組相比，TS組門靜脈區存在大量CD20細胞浸潤（圖2r和2t）。
3 討論
肝移植后發生的排斥反應多數被認為是細胞介導的排斥反應。近年來研究逐漸深入，在ABO血型相符或不符的供者與受者進行的肝移植，或者受者在體內含有預存致敏淋巴細胞的抗體行肝移植等情況下，移植肝發生功能喪失被認為是發生了AMR[14-15]。AMR分為急性AMR和慢性AMR。急性AMR易發生在患者移植后2周，預后效果不良[16]。急性AMR在臨床上表現為轉氨酶峰值延遲、難治性血小板減少癥和類固醇治療抵抗，可導致移植物功能障礙，或者轉為慢性排斥反應，如果不及時治療，可發展為移植物功能衰竭。2016年Banff工作組提出的肝臟發生AMR的診斷標準如下：① 內皮細胞肥大、門靜脈毛細血管擴張、微血管炎癥和門靜脈周圍水腫；② DSA水平升高；③ C4d彌漫性沉積于微血管中；④ 排除其他肝臟疾病的診斷。因為肝臟的雙重血供和Kuppfer細胞的強大吞噬力[2, 17]，使得C4d在肝移植受者活檢時不容易被發現，這就導致在診斷肝移植受者發生AMR時具有一定的困難性。
DSA是指受者在移植供者的組織或器官后，體內產生的針對供者組織抗原的特異性抗體。DSA分為預存型DSA和新生DSA。有報道顯示，DSA的存在與肝移植受者術后發生AMR的風險有關[2, 4]，肝移植患者體內預存DSA陽性比例較高、DSA水平越高，AMR風險越大。在臨床上，對于DSA引起肝臟發生AMR的機制和治療還在探索研究中，肝臟微血管炎癥特征、移植物基因損傷特征等方面的研究均不完善[7]；同時，分子錯配也需要考慮在內。有研究[18]顯示，分子錯配可預測肝移植后細胞介導的排斥反應和新生DSA的形成。這些因素導致了在為移植受者制定合適治療方案時存在困難。
大鼠AMR相關的肝移植模型已有研究報道[19]。近年來，Ueda等[20]發現更嚴重的急性排斥反應會發生在接受皮膚移植再進行心臟移植后；Stadlbauer等[21]同樣發現，Lewis大鼠在接受Wistar大鼠皮膚移植7 d后，再接受Wistar大鼠心臟移植會在術后24 h發生加速的排斥反應，而非致敏大鼠則在10 d后發生排斥反應。本研究推測致敏后行肝移植同樣會發生排斥反應加速的情況，因此，通過建立致敏后AMR的動物肝移植模型來進行探索，這也有助于闡明移植物對DSA不耐受的情況。
本研究通過檢測T組和TS組Lewis大鼠的肝功能指標，發現TS組的AST和TB水平比T組升高，說明TS組移植后的大鼠其膽管受到嚴重破壞；流式細胞術檢測結果提示，與T組相比，TS組的DSA（IgG1、IgG2a、IgG2b 、IgG2c） 和C4d表達陽性率升高，從血清學方面表明了TS組Lewis大鼠的移植肝臟功能喪失。在組織病理學結果中，與LC組相比，T組Lewis大鼠出現部分膽管水腫及淋巴細胞浸潤，但未見明顯毛細血管結構的破壞；而與T組相比，TS組Lewis大鼠的膽管前毛細血管出現大量的淋巴細胞或單核細胞浸潤及毛細血管存在嚴重破壞。根據RAI評分標準，分別從門管區炎癥、膽管炎癥和血管炎癥3個方面對Lewis大鼠是否發生排斥反應進行評分，因LC組與S組Lewis大鼠沒有實施肝移植手術，因此其無排斥反應的發生，不對其進行RAI評分，而TS組的RAI評分高于T組。此外，T組Lewis大鼠肝臟組織的HE染色和膽管CK-19染色結果表明，肝竇出現炎癥細胞浸潤，部分膽管上皮細胞受損，膽管不完整；而在TS組中，門靜脈或門靜脈突出區有大量炎癥細胞的浸潤和微血管的破壞，且出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解。這兩點表明TS組Lewis大鼠在移植后會發生更嚴重的排斥反應，說明致敏處理會加重大鼠發生排斥反應的程度。移植肝發生AMR的診斷標準中包括活檢肝組織C4d免疫組織化學染色呈陽性，因此，本研究對4組Lewis大鼠的肝臟組織進行C4d染色，據C4d陽性診斷標準，T組的C4d評分低于TS組，并且在實驗過程中，排除了其他可能導致肝損傷的因素。這表明致敏移植后的大鼠發生排斥反應的特點符合AMR。但是由于本研究樣本量較小，對大鼠肝移植術后發生AMR的模型只是初步探索，在后續研究中，將對其進行深入了解。
綜上所述，本研究建立的致敏大鼠原位肝移植模型出現了具有內皮損傷、毛細血管炎癥、C4d沉積、高水平的DSA和更嚴重的排斥反應，并且排斥反應特點符合AMR。這也為臨床上深入了解AMR的機制和治療提供了模型基礎，但對于探索AMR機制及治療還需要進行更深入的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。
作者貢獻聲明：趙姣姣負責實驗操作、數據整理和論文撰寫；張升寧負責實驗設計、研究指導和經費支持；莽源祎負責研究指導和數據整理；高楊負責研究指導；李立負責研究指導和經費支持。
倫理聲明：本研究已通過昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會的審核批準（審批號：kmmu20211208）。
肝移植受者在術后會發生抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR） [1-2]。發生AMR的肝移植受者會出現急性膽管損傷、肝臟快速纖維化等情況，預后較差甚至會導致死亡。一些不明原因的移植物失功能考慮可能與AMR有關[3]。研究顯示，供者特異性抗體（donor-specific antibodies，DSA）是肝臟發生AMR的危險因素[4]，新生DSA與慢性排斥、移植物纖維化和功能障礙相關[4]。特別是當肝移植受者體含內有高水平的DSA時，治療效果不良[2, 4]。目前，AMR的機制尚不清楚，微血管炎癥[5]、基因表達譜[6]和治療性試驗[7]在AMR相關的肝移植中的作用仍有待探索。根據現有共識對肝移植受者給予合適的治療方案是一個難題[8-10]。為了更深入探索AMR的相關機制，筆者團隊建立了以Lewis大鼠為受者、Brown Norway（BN）大鼠為供者的致敏大鼠肝移植模型，通過動物模型初步研究致敏大鼠肝移植發生DSA相關AMR的病理學特點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及器械材料
Lewis大鼠，雄性，250～290 g，12只，10～12周齡；BN大鼠，雄性，250～280 g，6只，10～12周齡；均從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買 ［生產許可證號：SCXK（京）2016-0006］。在昆明醫科大學實驗動物學部完成飼養與手術，實驗動物都為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別。所有實驗動物均通過昆明醫科大學動物倫理學部審批（審批號：kmmu20211208）。
器械材料：剪刀、血管鉗、血管夾等（蘇州市朗米尼康醫療器械有限公司），細胞過濾器（40 μm，美國FALCON公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS；合肥蘭杰柯有限公司），流式細胞儀（德國貝克曼庫爾特公司），5%牛血清白蛋白（美國Sigma公司），RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），細胞形態學（HE、Masson）染色試劑盒、紅細胞裂解液等實驗耗材（北京索萊寶科技有限公司），C4d、CD20、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM等抗體（美國GeneTex公司）。
1.2 實驗分組
本實驗以Lewis大鼠為受者、BN大鼠為供者，采用隨機數字表法將Lewis大鼠進行分組，每組受者存活數量為3只（n=3）：Lewis對照組（LC組）、直接移植組（T組）、致敏組（S組）和致敏后移植組（TS組）。LC組大鼠不做任何處理；T組大鼠直接進行移植；S組只進行致敏過程，不實施肝移植；TS組于致敏2周后進行肝移植。LC組和S組的大鼠沒有實施肝移植手術，其實驗相關指標取材時間與T組和TS組移植后的大鼠一致。在實驗過程中，保證未移植組的大鼠均是正常健康大鼠。
1.3 模型建立
1.3.1 大鼠原位肝移植模型的建立
大鼠肝移植模型采用Kamada等[11]提出的“二袖套法”進行模型的建立，受者和供者術前8 h禁食，均采用乙醚進行麻醉。供者游離左膈下靜脈、食管后靜脈叢、門靜脈、肝下下腔靜脈，右腎上腺靜脈游離并結扎。隨后對供肝進行灌注，當肝臟完全變為土黃色后，取出供肝并保存于4 ℃生理鹽水中。將自制的聚乙烯套管套于門靜脈和肝下下腔靜脈中，等待移植于受者體內。受者肝臟的游離與結扎方法同供者，游離完畢后，取出受者肝臟并將供肝置入肝窩內，按照團隊改良的方法[12]進行肝上下腔靜脈（vena cava superior inferior hepatis，SHVC）的吻合，隨后完成肝下下腔靜脈和膽管的套管，無肝期結束以門靜脈和SHVC開放后肝臟變成紅色為標志。清理腹腔后進行關腹，大鼠蘇醒后可在籠中自由活動。
1.3.2 致敏模型的建立
先將BN大鼠的脾臟取出，剪成片狀，在40 μm的細胞過濾器中用研磨器研磨，研磨后的細胞與組織經過細胞過濾器后，得到細胞懸液，再用紅細胞裂解液按照說明書先裂解過濾后得到的細胞，然后使用RPMI 1640培養基將細胞連續沖洗2次，顯微鏡下使用血細胞計數器進行計數，計數后將5×107的細胞吸入到1 mL的PBS中，進行吹打重懸，再將細胞從Lewis大鼠的尾靜脈進行注射。
1.4 實驗相關指標檢測
1.4.1 T組與TS組大鼠的肝功能檢測
取T組和TS組Lewis大鼠移植術后第14 天的血液，離心（4 ℃，2 800 r/min，5 min）獲得血清，檢測天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ谷酰基轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）和肌酐（creatinine，CRE）水平。
1.4.2 DSA（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM）和C4d表達情況檢測
① DSA檢測：取正常BN大鼠1×106個脾細胞溶于50 μL的PBS中，并與200 μL 5%牛血清白蛋白在4 ℃環境中孵育30 min，隨后將T組和TS組Lewis大鼠的血清與脾細胞在室溫條件下孵育1 h，以Mouse anti-Rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgM作為二抗與洗滌后的細胞在4 ℃環境中孵育30 min，PBS洗滌后采用流式細胞儀對其DSA的水平進行檢測，流式數據采用Flowjo軟件進行分析。② C4d檢測：LC組和S組直接取Lewis大鼠的脾臟，T組和TS組因實施了肝移植手術，取移植后的Lewis大鼠的脾臟進行脾細胞的分離，以C4d抗體為一抗，與脾細胞進行孵育，PBS洗滌后，選用自帶熒光的IgG抗體為二抗，再與脾細胞進行孵育，PBS再次洗滌后采用流式細胞儀檢測C4d的表達情況。
1.4.3 肝組織的病理學分析
T組和TS組Lewis大鼠接受肝移植手術后第14 天（LS和S組為對應時點），給予吸入過量乙醚、安樂死處理，取肝臟組織用4%的多聚甲醛進行固定，肝臟組織再經脫水處理后制成蠟塊，采用病理切片機將組織切為4 μm厚于載玻片上，二甲苯進行脫蠟后，按照HE染色試劑盒及改良Masson三色染色試劑盒說明書對2組Lewis大鼠的肝臟組織進行染色，顯微鏡下分析病理學特點。
1.4.4 排斥反應活性指數（rejection activity index，RAI）評分
根據2016年提出的Banff評分標準[13]中的RAI評分準則對T組和TS組肝移植術后第14 天的Lewis大鼠的肝臟分別從門管區炎癥（僅少數門管區可見淋巴細胞1分，多數門管區出現混合炎癥細胞、門管區擴大2分，多數門管區出現混合炎癥細胞、周圍肝組織出現炎癥細胞3分）、膽管炎癥（少數小葉間膽管上皮出現炎癥細胞1分，多數膽管上皮出現炎癥細胞浸潤2分，出現膽管退化3分）和血管炎癥（少數小葉間血管出現血管炎癥改變1分，多數小葉間膽管出現血管炎癥改變2分，中重度中央靜脈炎及周圍肝細胞壞死3分）進行3個方面的評分。1～2分：無急性排斥反應；3分：臨界性排斥反應；4～5分：輕度急性排斥反應；6～7分：中度急性排斥反應；8～9分：重度急性排斥反應。對鏡下 ≥3個視野進行評分，并取均值得到最后的分值。根據均值確定其發生排斥反應的程度。
1.4.5 肝臟組織的免疫組織化學分析
對LC組、T組、S組和TS組Lewis大鼠的肝臟組織切片通過烤片、檸檬酸修復抗原后分別進行C4d、CK-19和CD20抗體染色。操作方法按照抗體說明書進行。C4d系體液免疫反應的指標，對C4d的評分可以驗證移植后Lewis大鼠是否發生AMR。C4d著色強度（無著色為0分，≤10% 為1分，≤50%但 ＞10% 為2分，＞50%為3分）。C4d陽性診斷標準：陽性著色強度為3分并且滿足以下3項中的任意2項：① ≥4個門管區內有毛細血管內皮著色；② 肝竇內皮淺性著色；③ ≥2個中央靜脈血管內皮著色。
2 結果
2.1 致敏后Lewis大鼠體內DSA和C4d表達陽性率升高
用流式細胞儀檢測T組和TS組移植后Lewis大鼠血清中DSA的表達，同時檢測LC組、T組、S組和TS組大鼠血清中C4d的表達。結果顯示（圖1a～1e）：TS組大鼠體內會誘導DSA的產生，TS組大鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c表達陽性率較T組高，表明致敏后可上調受者大鼠的DSA表達。因DSA是受者在移植供者的組織或器官后，其體內產生的針對供者組織抗原的一些特異性抗體，而LC組和S組未行移植手術，大鼠體內不會產生DSA，故無對應的DSA數據。
圖1
示各組Lewis大鼠的DSA和C4d表達、肝功能以及RAI評分和C4d評分結果
a～e：T組和TS組Lewis大鼠的DSA表達結果，IgG1（a）、IgG2a（b）、IgG2b（c）、IgG2c（d）和IgM（e）；f：4 組Lewis大鼠的C4d表達結果；g、h：4 組Lewis大鼠的肝功能指標（g）、RAI評分及C4d評分（h）結果；因本研究
C4d的出現代表經典途徑的補體激活，LC組、S組、T組和TS組Lewis大鼠體內都有可能出現，因此，對4組大鼠血清中C4d的表達均進行了檢測。結果顯示（圖1f）：與LC組相比，S組和TS組Lewis大鼠的C4d表達陽性率升高，表明致敏處理對大鼠C4d的表達有明顯影響；T組數據表明移植術對大鼠體內C4d的表達會有影響；與T組相比，TS組Lewis大鼠的C4d表達陽性率升高，表明致敏處理可以影響C4d的表達。
2.2 致敏后Lewis大鼠發生排斥反應
本實驗中針對大鼠發生排斥反應的肝功能，主要觀察的指標為TB。肝功能檢測結果顯示，與T組對比，TS組Lewis大鼠的TB、AST和ALP水平升高，ALT、GGT和CRE差距不大（圖1g）。根據2016年Banff工作組提出的RAI評分，TS組Lewis大鼠的RAI評分，以及門管區炎癥、膽管損傷和血管炎癥評分更高，組織學評分以及C4d評分也高于T組，提示致敏后受者Lewis大鼠發生了排斥反應，見圖1h。
2.3 致敏后Lewis大鼠發生的排斥反應符合AMR的病理學特點
LC組、S組、T組和TS組Lewis大鼠的肝臟組織在光學顯微鏡下觀察，HE染色結果顯示（圖2a～2d）：① 與LC組相比，S組Lewis大鼠肝臟組織中的肝細胞、門靜脈、膽管和中央靜脈均沒有出現明顯損傷（圖2a和2c）。② T組和TS組Lewis大鼠的肝細胞、毛細血管和膽管出現較為嚴重的損傷。③ 與S組相比，TS組Lewis大鼠的門靜脈出現大量炎癥細胞，毛細血管出現破損等較為嚴重的情況。與T組相比，TS組Lewis大鼠出現門靜脈炎癥，表現為炎癥細胞增多；出現毛細血管炎癥，表現為炎癥細胞的浸潤和內皮損傷脫落；膽管損傷程度更為嚴重，表現為膽管形態改變，膽管周圍不完整，膽管壁受損（圖2b和2d）。
圖2
示各組Lewis大鼠的肝臟組織的HE染色和免疫組織化學染色結果
a～d：4組Lewis大鼠的肝臟形態學改變（HE ×200），LC組（a）和S組（c）幾乎無炎癥表現，T組（b）出現肝細胞損傷、肝血竇間有多數淋巴細胞浸潤、膽管上皮腫脹，TS組（d）出現大量炎癥細胞浸潤、中央靜脈出現重度損傷、膽管接近消失，黑箭所指為淋巴細胞的浸潤；e～h：4組Lewis大鼠的C4d免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（e）和S組（g）肝臟血管內皮幾乎沒有C4d沉積，T組（f）少部分毛細血管內皮有C4d的沉積，TS組（h）的血管內皮細胞有 ＞50%的管腔C4d沉積，黑箭所指為C4d陽性；i～l：4組Lewis大鼠的肝臟纖維化改變結果（Masson染色 ×200），LC組（i）和S組（k）肝臟組織幾乎沒有發生纖維化，T組（j）僅有極少部分組織出現纖維化，TS組（l）肝臟組織出現大部分纖維化，紅箭所指為肝臟纖維化改變；m～p：4組Lewis大鼠的CK-19免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（m）和S組（o）的膽管保持完整、膽管上皮細胞排列整齊、呈圓形，T組（n）少部分膽管遭到破壞、膽管上皮細胞破損，TS組（p）出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解，黑箭所指為未被破壞的膽管，紅箭所指為膽管損傷后的狀態；q～t：4組Lewis大鼠的CD20免疫組織化學染色結果（ ×200），LC組（q）和S組（s）無CD20細胞浸潤，T組（r）少部分組織有CD20細胞，TS組（t）出現大量CD20細胞浸潤，黑箭所指為CD20細胞浸潤
在C4d染色（圖2e～2h）方面，由于LC組與S組的Lewis大鼠均沒有進行肝移植手術，肝臟中央靜脈和其他毛細血管內皮無C4d的沉積（圖2e和2g），而T組和TS組的Lewis大鼠在移植后均出現了C4d的沉積。與LC組相比，T組少部分毛細血管內皮著色；與T組相比，TS組的血管內皮細胞 ＞50%的細胞陽性著色，C4d呈彌漫性沉積，范圍更廣（圖2f和2h）。在Masson染色（圖2i～2l）方面，LC組與S組的Lewis大鼠幾乎沒有發生肝臟纖維化（圖2i和2k）；與LC組對比，T組在移植后第14 天，肝臟發生輕度纖維化，TS組肝臟發生中度纖維化；與T組相比，TS組大鼠肝臟發生更明顯的纖維化（圖2j和2l）。膽管CK-19染色顯示，LC組與S組的膽管上皮幾乎沒有發生炎癥等情況（圖2m和2o）；與S組對比，TS組出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解；與T組相比，TS組出現膽管嚴重的損傷（圖2n和2p）。LC組和S組Lewis大鼠肝臟組織經CD20染色后，沒有發現CD20細胞浸潤（圖2q和2s）；與LC組相比，T組肝臟存在部分CD20細胞浸潤；與T組相比，TS組門靜脈區存在大量CD20細胞浸潤（圖2r和2t）。
3 討論
肝移植后發生的排斥反應多數被認為是細胞介導的排斥反應。近年來研究逐漸深入，在ABO血型相符或不符的供者與受者進行的肝移植，或者受者在體內含有預存致敏淋巴細胞的抗體行肝移植等情況下，移植肝發生功能喪失被認為是發生了AMR[14-15]。AMR分為急性AMR和慢性AMR。急性AMR易發生在患者移植后2周，預后效果不良[16]。急性AMR在臨床上表現為轉氨酶峰值延遲、難治性血小板減少癥和類固醇治療抵抗，可導致移植物功能障礙，或者轉為慢性排斥反應，如果不及時治療，可發展為移植物功能衰竭。2016年Banff工作組提出的肝臟發生AMR的診斷標準如下：① 內皮細胞肥大、門靜脈毛細血管擴張、微血管炎癥和門靜脈周圍水腫；② DSA水平升高；③ C4d彌漫性沉積于微血管中；④ 排除其他肝臟疾病的診斷。因為肝臟的雙重血供和Kuppfer細胞的強大吞噬力[2, 17]，使得C4d在肝移植受者活檢時不容易被發現，這就導致在診斷肝移植受者發生AMR時具有一定的困難性。
DSA是指受者在移植供者的組織或器官后，體內產生的針對供者組織抗原的特異性抗體。DSA分為預存型DSA和新生DSA。有報道顯示，DSA的存在與肝移植受者術后發生AMR的風險有關[2, 4]，肝移植患者體內預存DSA陽性比例較高、DSA水平越高，AMR風險越大。在臨床上，對于DSA引起肝臟發生AMR的機制和治療還在探索研究中，肝臟微血管炎癥特征、移植物基因損傷特征等方面的研究均不完善[7]；同時，分子錯配也需要考慮在內。有研究[18]顯示，分子錯配可預測肝移植后細胞介導的排斥反應和新生DSA的形成。這些因素導致了在為移植受者制定合適治療方案時存在困難。
大鼠AMR相關的肝移植模型已有研究報道[19]。近年來，Ueda等[20]發現更嚴重的急性排斥反應會發生在接受皮膚移植再進行心臟移植后；Stadlbauer等[21]同樣發現，Lewis大鼠在接受Wistar大鼠皮膚移植7 d后，再接受Wistar大鼠心臟移植會在術后24 h發生加速的排斥反應，而非致敏大鼠則在10 d后發生排斥反應。本研究推測致敏后行肝移植同樣會發生排斥反應加速的情況，因此，通過建立致敏后AMR的動物肝移植模型來進行探索，這也有助于闡明移植物對DSA不耐受的情況。
本研究通過檢測T組和TS組Lewis大鼠的肝功能指標，發現TS組的AST和TB水平比T組升高，說明TS組移植后的大鼠其膽管受到嚴重破壞；流式細胞術檢測結果提示，與T組相比，TS組的DSA（IgG1、IgG2a、IgG2b 、IgG2c） 和C4d表達陽性率升高，從血清學方面表明了TS組Lewis大鼠的移植肝臟功能喪失。在組織病理學結果中，與LC組相比，T組Lewis大鼠出現部分膽管水腫及淋巴細胞浸潤，但未見明顯毛細血管結構的破壞；而與T組相比，TS組Lewis大鼠的膽管前毛細血管出現大量的淋巴細胞或單核細胞浸潤及毛細血管存在嚴重破壞。根據RAI評分標準，分別從門管區炎癥、膽管炎癥和血管炎癥3個方面對Lewis大鼠是否發生排斥反應進行評分，因LC組與S組Lewis大鼠沒有實施肝移植手術，因此其無排斥反應的發生，不對其進行RAI評分，而TS組的RAI評分高于T組。此外，T組Lewis大鼠肝臟組織的HE染色和膽管CK-19染色結果表明，肝竇出現炎癥細胞浸潤，部分膽管上皮細胞受損，膽管不完整；而在TS組中，門靜脈或門靜脈突出區有大量炎癥細胞的浸潤和微血管的破壞，且出現多數或全部膽管退化或灶性膽管腔破壞崩解。這兩點表明TS組Lewis大鼠在移植后會發生更嚴重的排斥反應，說明致敏處理會加重大鼠發生排斥反應的程度。移植肝發生AMR的診斷標準中包括活檢肝組織C4d免疫組織化學染色呈陽性，因此，本研究對4組Lewis大鼠的肝臟組織進行C4d染色，據C4d陽性診斷標準，T組的C4d評分低于TS組，并且在實驗過程中，排除了其他可能導致肝損傷的因素。這表明致敏移植后的大鼠發生排斥反應的特點符合AMR。但是由于本研究樣本量較小，對大鼠肝移植術后發生AMR的模型只是初步探索，在后續研究中，將對其進行深入了解。
綜上所述，本研究建立的致敏大鼠原位肝移植模型出現了具有內皮損傷、毛細血管炎癥、C4d沉積、高水平的DSA和更嚴重的排斥反應，并且排斥反應特點符合AMR。這也為臨床上深入了解AMR的機制和治療提供了模型基礎，但對于探索AMR機制及治療還需要進行更深入的研究。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。
作者貢獻聲明：趙姣姣負責實驗操作、數據整理和論文撰寫；張升寧負責實驗設計、研究指導和經費支持；莽源祎負責研究指導和數據整理；高楊負責研究指導；李立負責研究指導和經費支持。
倫理聲明：本研究已通過昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會的審核批準（審批號：kmmu20211208）。
