引用本文： 乜茹, 劉川川, 李文登, 龐明泉, 尹鳳嬌, 冶賡博, 王志鑫, 樊海寧. 小鼠肝多房棘球蚴感染模型中細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路的初步研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(6): 666-673. doi: 10.7507/1007-9424.202302007 復制
多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）是由多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis，Em）的幼蟲感染所致的人畜共患病，每年約有17 400人新發感染[1]。中國西部地區是世界上最嚴重的棘球蚴病流行地區，占有全球病例數的90%以上[2]。 AE的特征是病灶向鄰近器官和組織呈進行性浸潤性增殖，類似于惡性腫瘤的轉移，晚期可轉移至身體的其他部位，嚴重者危及生命[3]。
細胞焦亡是一種依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的細胞死亡方式，發生時伴有大量炎癥介質的釋放[4]。細胞焦亡與許多人體寄生蟲病的發生發展相關，有研究[5-6]認為，利什曼原蟲病患者隨著病情的緩解，其病變組織中的Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）、含有CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白（apoptosis-associated?speck-like?protein?containing?a?CARD，ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等的表達水平下降。國內盧亞奇[7]研究認為，小鼠感染日本血吸蟲可使肝星狀細胞內的 NLRP3 炎癥小體激活，抑制 NLRP3 炎癥小體可以減輕血吸蟲感染引起的纖維化。王濤[8]對AE患者肝臟組織通過免疫組化法檢測細胞焦亡的關鍵性蛋白，結果顯示Caspase-1、Caspase-4、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、IL-18和IL-1β在AE邊緣帶組織中的表達高于正常肝組織。目前關于AE與細胞焦亡的相關性研究多停留在臨床病理，那么細胞焦亡的炎癥級聯反應是否也會在小鼠AE過程中發揮同樣的作用呢？ 2021年12月至2022年9月期間，筆者所在團隊通過建立小鼠Em感染模型，旨在探索細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路與小鼠AE病程發展的相關性，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及倫理批準
6～8周齡SPF級健康 BALB/c 雄性小鼠25只購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司 ［生產許可證編號：SCXK（蘇）2020-0009；實驗小鼠質量合格證編號：NO.202142287］，體質量16～18 g。實驗小鼠符合動物倫理學標準，按隨機數字表將實驗小鼠分為對照組（n=5）和感染組（n=20），感染組再分為感染1、2、3和5個月4個亞組，各亞組n=5。用于Em保種的蒙古長爪沙鼠來自于青海省包蟲病研究重點實驗室。本研究方案通過了青海大學附屬醫院科研倫理委員會的審批（批文編號：P-SL-2019054），符合倫理原則。
1.2 實驗試劑與儀器
試劑：Caspase-1、NLRP3、GSDMD一抗和IL-1β ELISA試劑盒均購自美國Thermo公司。抗兔β-actin、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidas，HRP）抗兔IgG和HRP抗鼠IgG二抗均購自美國ProteinTech公司。儀器：生物倒置顯微鏡系統（DP27）購自日本OLYMPUS公司，透射電子顯微鏡（JEM-1400FLASH）購自日本電子JEOL公司，超凈臺購自蘇州凈化設備有限公司，超低溫冰箱購自美國Thermo公司。
1.3 原頭節混懸液的制備
將蒙古長爪沙鼠按實驗要求處死，浸泡于75%的乙醇中。生物安全柜操作：將處死的小鼠腹部常規備皮消毒，取腹部正中切口逐層進腹，解剖出腹腔AE病灶。用剪刀將泡球蚴組織剪碎后加入適量PBS后進行研磨，制備出細小均勻的組織漿液。用80目的濾網進行過濾，PBS洗滌并自然沉淀3次，最后用PBS進行重懸原頭節，計數后制備原頭節混懸液（含原頭節15 000個/mL）。
1.4 小鼠肝Em感染模型的建立
感染組：將BALB/c小鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉按照每只50 mg/kg 的劑量進行腹腔內注射，待麻醉滿意后將小鼠仰臥位固定于操作臺上。常規備皮及消毒，采用切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺法，取上腹部劍突下偏左0.3 cm處取長約0.8 cm縱行切口切開皮膚，經腹壁肌層透視確認肝左葉范圍后，用1 mL 注射器以30° 角斜行刺入肝臟約3 mm深，回抽無氣體、血液后，注入制備好的原頭節懸液0.2 mL（含原頭節3 000 個），退針后穿刺點用無菌紗布壓迫止血，間斷縫皮。麻醉蘇醒后常規飼養。對照組小鼠未予特殊處理，常規飼養。
1.5 檢測指標及方法
根據實驗要求分別處死對照組及各時相感染亞組小鼠，完整摘取肝臟，進行以下檢測。
1.5.1 組織病理學觀察
觀察肝臟的大體形態，然后對照組取肝組織，各時相感染亞組取肝臟棘球蚴病灶周圍肝組織，將所取組織樣品置于10%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋，5 mm厚度連續切片。蘇木精-伊紅染色后脫水封片，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。另外，將所取組織樣品經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑和Epon812包埋劑，最后Ep812包埋，制備60～90 nm超薄切片，先用醋酸鈾染色10～15 min，再用檸檬酸鉛染色1～2 min，室溫下染色。于透射電鏡下觀察并采集圖片，觀察超微結構病理改變。
1.5.2 細胞焦亡關鍵蛋白的檢測
① 采用免疫組織化學法檢測各組小鼠肝組織內Caspase-1和NLRP3 的表達情況：所取組織標本經固定、包埋、切片、脫水處理，先后加一抗、二抗孵育，DAB 顯色、復染細胞核、脫水封片； Image J作圖，GraphPad Prism 8.0.2分析結果。免疫組化結果判定標準如下：細胞漿內呈現出由淡黃色至棕褐色顆粒為表達陽性，每張切片隨機選取3處作為觀察點，計算每高倍鏡視野下陽性細胞比率，據此做統計學分析。② 采用免疫印跡法檢測細胞焦亡關鍵蛋白的相對表達水平：取對照組小鼠肝臟及各時相感染亞組小鼠病灶周圍肝臟組織，充分研磨。加入蛋白裂解液，采用 BCA 試劑盒測定蛋白濃度。制備 5% 分離膠、10% 濃縮膠進行電泳，電泳開始時設置電壓 80 V，進入分離膠后調整為 120 V。用濕轉法將凝膠上蛋白樣品轉印到PVDF膜上并分別加入GSDMD、NLRP3和Caspase-1一抗封閉過夜，次日二抗孵育，TBST洗脫，繼以曝光液反應后顯影并拍照。結果以待測蛋白與內參照蛋白β-actin灰度值的比值表示。
1.5.3 細胞焦亡下游指標IL-1β的檢測
將各組小鼠肝臟組織制備成勻漿液，3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心10 min，收集上清液于–80 ℃冰箱凍存備用。采用ELISA 法檢測，按試劑盒說明書操作，用酶標掃描儀測450 nm處吸光度值（A值），根據標準品的濃度和 A值做標準曲線，然后根據標準曲線方程計算出樣本濃度，分析數據。
1.6 統計學方法
使用 GraphPad Prism 8.0.2統計軟件分析數據，所有實驗至少重復3次。正態性檢驗采用K-S檢驗，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s ）表示；組間較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠一般情況
對照組小鼠一般情況良好，無死亡小鼠；感染組小鼠隨著造模時間延長，腹部逐漸膨隆，質量明顯增加，活動度降低，偶見小鼠精神萎靡現象，飲食減少，感染組各時相感染率 為100%，無死亡小鼠。
2.2 肝臟組織病理學變化
2.2.1 肝臟標本大體觀察及光鏡下觀察結果
各時相感染亞組小鼠肝臟組織均可見大小不等的白色病灶，形態不規則，病灶與周圍正常肝組織無明顯界限，且內部呈浸潤性生長。光鏡下見，各時相感染亞組小鼠隨著感染時間的延長，肝臟內病灶體積逐漸增大，肝臟纖維組織增生加重，且伴較多淋巴細胞和粒細胞浸潤，感染5個月組的小鼠肝臟組織已無正常肝臟結構。對照組肝組織結構正常，肝小葉結構完整，未見明顯的炎性細胞浸潤。具體見圖1a。
圖1
示各組小鼠肝臟形態和肝組織的病理學改變
a：各組小鼠肝臟組織大體標本及光鏡下所見的病理學改變（HE ×40、×200）：對照組肝組織結構正常，未見明顯的炎性細胞浸潤；感染組小鼠隨感染時間的延長，肝臟內病灶體積逐漸增大，肝臟纖維組織增生加重，且伴炎性細胞浸潤，感染5個月組的小鼠肝臟組織已無正常肝臟結構。b：各組小鼠肝臟組織透射電鏡下所見的病理學改變：對照組肝細胞形態結構正常（×8 000）；感染1個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度固縮（綠箭）的肝細胞，核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）； 感染2個月組肝細胞（×8 000），線粒體輕度腫脹（紅箭），核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、細胞膜不連續（綠箭）；感染3個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度腫脹（紅箭），核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）、溶酶體（綠箭）、脂滴（黃箭）；感染5個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度腫脹（紅箭）；核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）。N：細胞核；Mi：線粒體；RER：粗面內質網
2.2.2 透射電鏡觀察結果
對照組肝細胞呈多角形，細胞核呈圓形，染色質分布均勻，以常染色質為主，核仁明顯，核膜連續完整；胞漿內線粒體、粗面內質網、核糖體等細胞器豐富且結構完整清晰。各時相感染亞組肝細胞病變主要表現為核染色質丟失、線粒體腫脹（部分嵴變短消失，線粒體基質電子密度不均勻）、核糖體丟失，而粗面內質網普遍正常。尤其是感染2個月組的肝細胞，可見部分肝細胞的細胞膜斷裂、不連續。 具體見圖1b。
2.3 細胞焦亡下游指標IL-1β表達的檢測結果
ELISA檢測結果顯示，感染1、2、3和5個月組小鼠肝臟組織勻漿中IL-1β濃度分別為（557.4±113.9）、（1 950.0±95.3）、（1 249.0±105.1）和（714.2±108.8） pg/mL，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且各時相感染亞組的IL-1β濃度均高于對照組的濃度（276.0±82.1） pg/mL，差異有統計學意義（F=127.2，P<0.05）。具體見圖2。
圖2
示各組小鼠肝臟組織勻漿IL-1β濃度檢測結果
與對照組比較，
2.4 細胞焦亡關鍵蛋白免疫組化檢測結果
2.4.1 Caspase-1
感染1、2、3及5個月組小鼠肝臟組織標本中Caspase-1表達陽性細胞比率分別為（12.83±0.62）%、（15.11±0.37）%、（14.02±0.72）%和（12.12±0.59）%，均高于對照組小鼠肝臟組織標本中陽性細胞比率 ［（7.48±0.93）%］，差異有統計學意義（F=114.6，P＜0.05）。免疫組化染色結果見圖3a。
圖3
示各組小鼠肝臟組織中Caspase-1（a）和NLRP3（b）的表達（免疫組化染色 ×100、×400）
2.4.2 NLRP3
感染1、2、3及5個月組小鼠肝臟組織標本中NLRP3表達陽性細胞比率分別為 （13.17±0.32）%、（16.24±0.99）%、（13.40±0.98）%和（10.14±0.69）%，均高于對照組小鼠肝臟組織標本中陽性細胞比率 ［（8.04±0.99）%］，差異有統計學意義（F=85.89，P＜0.05）。免疫組化染色結果見圖3b。
2.5 細胞焦亡關鍵蛋白免疫印跡檢測結果
蛋白免疫印跡檢測結果顯示：Caspase-1、GSDMD 和NLRP3蛋白在各時相感染亞組小鼠肝臟中的表達呈現先升高（Caspase-1和GSDMD的表達于感染1月時升至最高，NLRP3的表達于感染2月時升至最高）后降低的趨勢，各時相感染亞組與對照組比較以及各時相感染亞組之間比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。具體見圖4。
圖4
示各組小鼠肝臟組織中Caspase-1 、NLRP3和GSDMD蛋白免疫印跡法檢測結果
a ：免疫印跡法檢測的電泳圖；b： Caspase-1蛋白的相對表達量；c： GSDMD蛋白的相對表達量；d：NLRP3蛋白的相對表達量；與對照組比較，*
3 討論
AE是一種廣泛分布于北半球的寄生蟲病，主要因人誤食被棘球蚴污染的食物、水而引發[9]。該疾病早期無明顯臨床癥狀，故大多數患者確診時已處于晚期階段，容易錯過最佳的治療時機[10]。國內最新回顧性研究[11]指出，全國2004–2020年，棘球蚴病的確診病例數從 2004 年的 991 例上升至 2020 年的 3 650例，累積報告6萬余例。AE的治療方式仍以手術和長期口服阿苯達唑治療為主，效果不理想，轉移率高[12]。探索新的治療方式就顯得尤為重要。免疫治療在改善AE疾病轉歸方面的作用越來越明顯[13]，因此AE發生發展過程中的免疫通路與機制的研究可為新的治療方式提供理論基礎。
細胞焦亡作為一種近年被十分關注的程序性細胞死亡形式，對細胞的正常生理及各類病理損傷的發生、發展及轉歸都起到了一定的作用。Chen等[14] 于1996年首次報道了Caspase-1依賴的細胞死亡方式，認為痢疾志賀菌通過誘導巨噬細胞的特殊凋亡來殺滅巨噬細胞。后來發現，Caspase家族的其他成員（如Caspase-/3/4/5/8/11等）也可誘發細胞焦亡[15-16]。細胞焦亡的形態學特征包括核固縮、染色質斷裂和最為典型的胞膜上孔隙形成，在細胞破裂的同時釋放大量炎性介質和細胞內容物，激活強烈的炎癥反應[17]。細胞焦亡可分為經典途徑、非經典途徑和其他途徑，其經典途徑是由炎性小體介導的、Caspase-1活化的死亡方式。炎性小體作為細胞焦亡的關鍵環節，是一組蛋白質復合物，NLRP3、NLRP1和NLRC4是最常見的炎癥小體[18]。其中，NLRP3炎癥小體作為細胞焦亡的基石，可被多種損傷相關分子模式和病原相關分子模式所識別[19]，當受到焦亡誘導因子的刺激后，無活性的 Caspase-1前體裂解成有活性的 Caspase-1，后者作用于 GSDMD，將其裂解成 N端結構和 C端結構，其中N端結構將細胞膜上的脂質體裂解，使細胞膜出現孔洞，細胞外的水通過滲透壓梯度進入細胞，最終導致細胞膨脹、破裂和死亡。與此同時，無活性的IL-1β前體和IL-18前體也被活化為IL-1β和IL-18，通過孔洞釋放至細胞外，造成炎性細胞的黏附和聚集，這就是細胞焦亡經典途徑發生的主要機制[20-22]。國內潘徐彪等[23]用免疫組化的方法觀察，與健康肝組織相比，在近病灶肝組織內NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-33陽性細胞數量增多且染色較強，表明人體肝AE病灶邊緣帶內NLRP3炎性小體被激活，且炎性小體相關蛋白及因子表達水平同步增高。因此，本研究擬從動物水平著手，進一步論證細胞焦亡作為一種新的細胞死亡方式是否參與了AE的發生與發展過程。
肝纖維化是一個多因素共同作用的病理生理過程，其發病機制非常復雜，是肝臟受到各種損傷因素刺激后的一種可逆的組織過度修復反應，其病理學特征是細胞外基質過度增生和沉積，是多種病因慢性肝損傷轉變成肝硬化、甚至癌變的共同階段[24-25]。有研究[26-27]表明，炎癥反應伴隨肝纖維化發生發展，肝細胞焦亡可使炎癥小體活化，造成炎癥介質釋放，引發肝臟炎癥，進而發展為肝纖維化。Em感染作為一種特殊類型的慢性肝損傷，所致肝纖維化是棘球蚴在肝臟生長發育形成包囊對周圍肝組織造成損傷后所發生的慢性修復反應，其病理基礎是機體對棘球蚴分泌的抗原產生免疫應答，進而激活肝星狀細胞轉化為成纖維細胞，釋放并積累大量細胞外基質，破壞正常肝組織結構，最終導致肝纖維化[28]。所以，為發掘宿主抗寄生蟲的固有免疫應答，細胞焦亡作為AE導致肝纖維化的中間環節之一，本研究將為AE的治療提供理論依據。
如何尋找合適的種植方法，在減少實驗動物造模并發癥的同時提高肝臟種植感染率呢？腹腔注射法[29]是最早使用且最常用的小鼠AE造模方法，具體方法是直接在小鼠右下腹腹腔內注射多房棘球蚴原頭節的混懸液，此方法操作簡單，術后感染少，動物一般狀況良好，存活率高，弊端是感染后形成的棘球蚴病灶往往分布在腹腔內各個器官，肝臟陽性率低，且腹腔粘連明顯。開腹肝穿刺法[29]是小鼠開腹后，將定量的多房棘球蚴原頭節混懸液直接注射于肝臟。該方法的優點是穿刺點定位明確，接種率高，不容易發生誤入胸腔、誤穿大血管等并發癥，弊端是手術步驟繁瑣，操作過程出血多，損傷大，且術后易并發感染、腸梗阻、甚至死亡。卞志遠等[30]發現經皮肝穿刺法操作簡易，存活率較高，缺點是肝葉定位不確切，穿刺過程易誤入胸腔，導致小鼠氣胸、呼吸衰竭甚至死亡，若誤穿進入大血管或膽道后可發生嚴重并發癥。若能憑借影像學輔助定位，可明顯降低誤穿引起的嚴重并發癥。切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺法[30-31]是經腹壁肌層，向肝臟注射多房棘球蚴原頭節混懸液的動物造模辦法，因小鼠腹壁肌層較薄呈半透明狀，可避開腹壁大血管且不易誤入胸腔，因此該方法操作簡單，造模成功率高，弊端是僅適用于小體型實驗動物的接種。門靜脈分支注射法同開腹肝穿刺法一樣，首先需要動物開腹，然后將定量的多房棘球蚴原頭節混懸液穿刺并注入暴露的門靜脈分支內，并用絲線結扎注射靜脈的遠端。吳亮亮等[32]認為該操作方法近似棘球蚴的自然感染途徑，但在小型實驗動物的接種過程中操作復雜，因門靜脈分支靜較細，故注射難度較大，且實驗動物術后易發生出血、腸梗阻、腸壞死甚至死亡。權衡利弊后，本研究最終采用通過切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺注射原頭蚴的方法構建BALB/c小鼠多房棘球蚴病模型，發現Em感染宿主后，均定植在肝組織，此造模方式操作簡單，創傷小，可用于推廣。在本次實驗中，受感染的小鼠肝臟表面出現了大小不一的白色病灶，隨著感染時間的延長，病變范圍明顯擴大，感染后期導致部分病灶發生實質性變化。
本研究通過免疫組化聯合免疫印跡法檢測，雙重證實了小鼠Em感染后，細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路關鍵蛋白的表達呈現先升高后逐漸降低的趨勢。本研究僅從細胞焦亡的經典途徑入手，證明了小鼠肝Em感染后存在細胞焦亡現象，可能通過細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路發揮炎癥放大作用。本研究只通過小鼠模型證明了存在細胞焦亡現象，若能通過AE患者手術標本去驗證是否有相同的現象，將更能證明細胞焦亡與AE之間的關系。流式細胞技術可將細胞焦亡現象進一步定位到細胞水平，明確具體發生焦亡的細胞。未來可進一步探索該疾病與細胞焦亡的其他途徑的相關性，論證有無其他更多的靶點引起病灶周圍組織中的炎癥反應。AE病程中伴隨眾多因子相互作用，且免疫逃逸機制尚不完全清楚，故探究細胞焦亡與其他免疫逃逸機制的相互作用這在AE的進一步研究方面意義深遠，同時相關因子的進一步亞型研究以及針對性的抑制劑研究，可為防治AE尋求新靶點，提供新思路。
重要聲明
利益沖突聲明:本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：乜茹、劉川川和李文登共同完成動物實驗；龐明泉、尹鳳嬌和冶賡博負責整理實驗數據和查閱文獻；乜茹負責完成論文撰寫；王志鑫和樊海寧負責論文審校和修改。
倫理聲明：本研究通過了青海大學附屬醫院科研倫理委員會的審批（批文編號：P-SL-2019054），符合倫理原則。
多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）是由多房棘球絳蟲（Echinococcus multilocularis，Em）的幼蟲感染所致的人畜共患病，每年約有17 400人新發感染[1]。中國西部地區是世界上最嚴重的棘球蚴病流行地區，占有全球病例數的90%以上[2]。 AE的特征是病灶向鄰近器官和組織呈進行性浸潤性增殖，類似于惡性腫瘤的轉移，晚期可轉移至身體的其他部位，嚴重者危及生命[3]。
細胞焦亡是一種依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的細胞死亡方式，發生時伴有大量炎癥介質的釋放[4]。細胞焦亡與許多人體寄生蟲病的發生發展相關，有研究[5-6]認為，利什曼原蟲病患者隨著病情的緩解，其病變組織中的Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）、含有CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白（apoptosis-associated?speck-like?protein?containing?a?CARD，ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等的表達水平下降。國內盧亞奇[7]研究認為，小鼠感染日本血吸蟲可使肝星狀細胞內的 NLRP3 炎癥小體激活，抑制 NLRP3 炎癥小體可以減輕血吸蟲感染引起的纖維化。王濤[8]對AE患者肝臟組織通過免疫組化法檢測細胞焦亡的關鍵性蛋白，結果顯示Caspase-1、Caspase-4、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、IL-18和IL-1β在AE邊緣帶組織中的表達高于正常肝組織。目前關于AE與細胞焦亡的相關性研究多停留在臨床病理，那么細胞焦亡的炎癥級聯反應是否也會在小鼠AE過程中發揮同樣的作用呢？ 2021年12月至2022年9月期間，筆者所在團隊通過建立小鼠Em感染模型，旨在探索細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路與小鼠AE病程發展的相關性，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及倫理批準
6～8周齡SPF級健康 BALB/c 雄性小鼠25只購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司 ［生產許可證編號：SCXK（蘇）2020-0009；實驗小鼠質量合格證編號：NO.202142287］，體質量16～18 g。實驗小鼠符合動物倫理學標準，按隨機數字表將實驗小鼠分為對照組（n=5）和感染組（n=20），感染組再分為感染1、2、3和5個月4個亞組，各亞組n=5。用于Em保種的蒙古長爪沙鼠來自于青海省包蟲病研究重點實驗室。本研究方案通過了青海大學附屬醫院科研倫理委員會的審批（批文編號：P-SL-2019054），符合倫理原則。
1.2 實驗試劑與儀器
試劑：Caspase-1、NLRP3、GSDMD一抗和IL-1β ELISA試劑盒均購自美國Thermo公司。抗兔β-actin、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidas，HRP）抗兔IgG和HRP抗鼠IgG二抗均購自美國ProteinTech公司。儀器：生物倒置顯微鏡系統（DP27）購自日本OLYMPUS公司，透射電子顯微鏡（JEM-1400FLASH）購自日本電子JEOL公司，超凈臺購自蘇州凈化設備有限公司，超低溫冰箱購自美國Thermo公司。
1.3 原頭節混懸液的制備
將蒙古長爪沙鼠按實驗要求處死，浸泡于75%的乙醇中。生物安全柜操作：將處死的小鼠腹部常規備皮消毒，取腹部正中切口逐層進腹，解剖出腹腔AE病灶。用剪刀將泡球蚴組織剪碎后加入適量PBS后進行研磨，制備出細小均勻的組織漿液。用80目的濾網進行過濾，PBS洗滌并自然沉淀3次，最后用PBS進行重懸原頭節，計數后制備原頭節混懸液（含原頭節15 000個/mL）。
1.4 小鼠肝Em感染模型的建立
感染組：將BALB/c小鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉按照每只50 mg/kg 的劑量進行腹腔內注射，待麻醉滿意后將小鼠仰臥位固定于操作臺上。常規備皮及消毒，采用切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺法，取上腹部劍突下偏左0.3 cm處取長約0.8 cm縱行切口切開皮膚，經腹壁肌層透視確認肝左葉范圍后，用1 mL 注射器以30° 角斜行刺入肝臟約3 mm深，回抽無氣體、血液后，注入制備好的原頭節懸液0.2 mL（含原頭節3 000 個），退針后穿刺點用無菌紗布壓迫止血，間斷縫皮。麻醉蘇醒后常規飼養。對照組小鼠未予特殊處理，常規飼養。
1.5 檢測指標及方法
根據實驗要求分別處死對照組及各時相感染亞組小鼠，完整摘取肝臟，進行以下檢測。
1.5.1 組織病理學觀察
觀察肝臟的大體形態，然后對照組取肝組織，各時相感染亞組取肝臟棘球蚴病灶周圍肝組織，將所取組織樣品置于10%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋，5 mm厚度連續切片。蘇木精-伊紅染色后脫水封片，在光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。另外，將所取組織樣品經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑和Epon812包埋劑，最后Ep812包埋，制備60～90 nm超薄切片，先用醋酸鈾染色10～15 min，再用檸檬酸鉛染色1～2 min，室溫下染色。于透射電鏡下觀察并采集圖片，觀察超微結構病理改變。
1.5.2 細胞焦亡關鍵蛋白的檢測
① 采用免疫組織化學法檢測各組小鼠肝組織內Caspase-1和NLRP3 的表達情況：所取組織標本經固定、包埋、切片、脫水處理，先后加一抗、二抗孵育，DAB 顯色、復染細胞核、脫水封片； Image J作圖，GraphPad Prism 8.0.2分析結果。免疫組化結果判定標準如下：細胞漿內呈現出由淡黃色至棕褐色顆粒為表達陽性，每張切片隨機選取3處作為觀察點，計算每高倍鏡視野下陽性細胞比率，據此做統計學分析。② 采用免疫印跡法檢測細胞焦亡關鍵蛋白的相對表達水平：取對照組小鼠肝臟及各時相感染亞組小鼠病灶周圍肝臟組織，充分研磨。加入蛋白裂解液，采用 BCA 試劑盒測定蛋白濃度。制備 5% 分離膠、10% 濃縮膠進行電泳，電泳開始時設置電壓 80 V，進入分離膠后調整為 120 V。用濕轉法將凝膠上蛋白樣品轉印到PVDF膜上并分別加入GSDMD、NLRP3和Caspase-1一抗封閉過夜，次日二抗孵育，TBST洗脫，繼以曝光液反應后顯影并拍照。結果以待測蛋白與內參照蛋白β-actin灰度值的比值表示。
1.5.3 細胞焦亡下游指標IL-1β的檢測
將各組小鼠肝臟組織制備成勻漿液，3 000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心10 min，收集上清液于–80 ℃冰箱凍存備用。采用ELISA 法檢測，按試劑盒說明書操作，用酶標掃描儀測450 nm處吸光度值（A值），根據標準品的濃度和 A值做標準曲線，然后根據標準曲線方程計算出樣本濃度，分析數據。
1.6 統計學方法
使用 GraphPad Prism 8.0.2統計軟件分析數據，所有實驗至少重復3次。正態性檢驗采用K-S檢驗，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s ）表示；組間較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠一般情況
對照組小鼠一般情況良好，無死亡小鼠；感染組小鼠隨著造模時間延長，腹部逐漸膨隆，質量明顯增加，活動度降低，偶見小鼠精神萎靡現象，飲食減少，感染組各時相感染率 為100%，無死亡小鼠。
2.2 肝臟組織病理學變化
2.2.1 肝臟標本大體觀察及光鏡下觀察結果
各時相感染亞組小鼠肝臟組織均可見大小不等的白色病灶，形態不規則，病灶與周圍正常肝組織無明顯界限，且內部呈浸潤性生長。光鏡下見，各時相感染亞組小鼠隨著感染時間的延長，肝臟內病灶體積逐漸增大，肝臟纖維組織增生加重，且伴較多淋巴細胞和粒細胞浸潤，感染5個月組的小鼠肝臟組織已無正常肝臟結構。對照組肝組織結構正常，肝小葉結構完整，未見明顯的炎性細胞浸潤。具體見圖1a。
圖1
示各組小鼠肝臟形態和肝組織的病理學改變
a：各組小鼠肝臟組織大體標本及光鏡下所見的病理學改變（HE ×40、×200）：對照組肝組織結構正常，未見明顯的炎性細胞浸潤；感染組小鼠隨感染時間的延長，肝臟內病灶體積逐漸增大，肝臟纖維組織增生加重，且伴炎性細胞浸潤，感染5個月組的小鼠肝臟組織已無正常肝臟結構。b：各組小鼠肝臟組織透射電鏡下所見的病理學改變：對照組肝細胞形態結構正常（×8 000）；感染1個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度固縮（綠箭）的肝細胞，核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）； 感染2個月組肝細胞（×8 000），線粒體輕度腫脹（紅箭），核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、細胞膜不連續（綠箭）；感染3個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度腫脹（紅箭），核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）、溶酶體（綠箭）、脂滴（黃箭）；感染5個月組肝細胞（×25 000），線粒體輕度腫脹（紅箭）；核染色質丟失（藍箭）、核糖體丟失（紫箭）、糖原顆粒（粉箭）。N：細胞核；Mi：線粒體；RER：粗面內質網
2.2.2 透射電鏡觀察結果
對照組肝細胞呈多角形，細胞核呈圓形，染色質分布均勻，以常染色質為主，核仁明顯，核膜連續完整；胞漿內線粒體、粗面內質網、核糖體等細胞器豐富且結構完整清晰。各時相感染亞組肝細胞病變主要表現為核染色質丟失、線粒體腫脹（部分嵴變短消失，線粒體基質電子密度不均勻）、核糖體丟失，而粗面內質網普遍正常。尤其是感染2個月組的肝細胞，可見部分肝細胞的細胞膜斷裂、不連續。 具體見圖1b。
2.3 細胞焦亡下游指標IL-1β表達的檢測結果
ELISA檢測結果顯示，感染1、2、3和5個月組小鼠肝臟組織勻漿中IL-1β濃度分別為（557.4±113.9）、（1 950.0±95.3）、（1 249.0±105.1）和（714.2±108.8） pg/mL，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且各時相感染亞組的IL-1β濃度均高于對照組的濃度（276.0±82.1） pg/mL，差異有統計學意義（F=127.2，P<0.05）。具體見圖2。
圖2
示各組小鼠肝臟組織勻漿IL-1β濃度檢測結果
與對照組比較，
2.4 細胞焦亡關鍵蛋白免疫組化檢測結果
2.4.1 Caspase-1
感染1、2、3及5個月組小鼠肝臟組織標本中Caspase-1表達陽性細胞比率分別為（12.83±0.62）%、（15.11±0.37）%、（14.02±0.72）%和（12.12±0.59）%，均高于對照組小鼠肝臟組織標本中陽性細胞比率 ［（7.48±0.93）%］，差異有統計學意義（F=114.6，P＜0.05）。免疫組化染色結果見圖3a。
圖3
示各組小鼠肝臟組織中Caspase-1（a）和NLRP3（b）的表達（免疫組化染色 ×100、×400）
2.4.2 NLRP3
感染1、2、3及5個月組小鼠肝臟組織標本中NLRP3表達陽性細胞比率分別為 （13.17±0.32）%、（16.24±0.99）%、（13.40±0.98）%和（10.14±0.69）%，均高于對照組小鼠肝臟組織標本中陽性細胞比率 ［（8.04±0.99）%］，差異有統計學意義（F=85.89，P＜0.05）。免疫組化染色結果見圖3b。
2.5 細胞焦亡關鍵蛋白免疫印跡檢測結果
蛋白免疫印跡檢測結果顯示：Caspase-1、GSDMD 和NLRP3蛋白在各時相感染亞組小鼠肝臟中的表達呈現先升高（Caspase-1和GSDMD的表達于感染1月時升至最高，NLRP3的表達于感染2月時升至最高）后降低的趨勢，各時相感染亞組與對照組比較以及各時相感染亞組之間比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。具體見圖4。
圖4
示各組小鼠肝臟組織中Caspase-1 、NLRP3和GSDMD蛋白免疫印跡法檢測結果
a ：免疫印跡法檢測的電泳圖；b： Caspase-1蛋白的相對表達量；c： GSDMD蛋白的相對表達量；d：NLRP3蛋白的相對表達量；與對照組比較，*
3 討論
AE是一種廣泛分布于北半球的寄生蟲病，主要因人誤食被棘球蚴污染的食物、水而引發[9]。該疾病早期無明顯臨床癥狀，故大多數患者確診時已處于晚期階段，容易錯過最佳的治療時機[10]。國內最新回顧性研究[11]指出，全國2004–2020年，棘球蚴病的確診病例數從 2004 年的 991 例上升至 2020 年的 3 650例，累積報告6萬余例。AE的治療方式仍以手術和長期口服阿苯達唑治療為主，效果不理想，轉移率高[12]。探索新的治療方式就顯得尤為重要。免疫治療在改善AE疾病轉歸方面的作用越來越明顯[13]，因此AE發生發展過程中的免疫通路與機制的研究可為新的治療方式提供理論基礎。
細胞焦亡作為一種近年被十分關注的程序性細胞死亡形式，對細胞的正常生理及各類病理損傷的發生、發展及轉歸都起到了一定的作用。Chen等[14] 于1996年首次報道了Caspase-1依賴的細胞死亡方式，認為痢疾志賀菌通過誘導巨噬細胞的特殊凋亡來殺滅巨噬細胞。后來發現，Caspase家族的其他成員（如Caspase-/3/4/5/8/11等）也可誘發細胞焦亡[15-16]。細胞焦亡的形態學特征包括核固縮、染色質斷裂和最為典型的胞膜上孔隙形成，在細胞破裂的同時釋放大量炎性介質和細胞內容物，激活強烈的炎癥反應[17]。細胞焦亡可分為經典途徑、非經典途徑和其他途徑，其經典途徑是由炎性小體介導的、Caspase-1活化的死亡方式。炎性小體作為細胞焦亡的關鍵環節，是一組蛋白質復合物，NLRP3、NLRP1和NLRC4是最常見的炎癥小體[18]。其中，NLRP3炎癥小體作為細胞焦亡的基石，可被多種損傷相關分子模式和病原相關分子模式所識別[19]，當受到焦亡誘導因子的刺激后，無活性的 Caspase-1前體裂解成有活性的 Caspase-1，后者作用于 GSDMD，將其裂解成 N端結構和 C端結構，其中N端結構將細胞膜上的脂質體裂解，使細胞膜出現孔洞，細胞外的水通過滲透壓梯度進入細胞，最終導致細胞膨脹、破裂和死亡。與此同時，無活性的IL-1β前體和IL-18前體也被活化為IL-1β和IL-18，通過孔洞釋放至細胞外，造成炎性細胞的黏附和聚集，這就是細胞焦亡經典途徑發生的主要機制[20-22]。國內潘徐彪等[23]用免疫組化的方法觀察，與健康肝組織相比，在近病灶肝組織內NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-33陽性細胞數量增多且染色較強，表明人體肝AE病灶邊緣帶內NLRP3炎性小體被激活，且炎性小體相關蛋白及因子表達水平同步增高。因此，本研究擬從動物水平著手，進一步論證細胞焦亡作為一種新的細胞死亡方式是否參與了AE的發生與發展過程。
肝纖維化是一個多因素共同作用的病理生理過程，其發病機制非常復雜，是肝臟受到各種損傷因素刺激后的一種可逆的組織過度修復反應，其病理學特征是細胞外基質過度增生和沉積，是多種病因慢性肝損傷轉變成肝硬化、甚至癌變的共同階段[24-25]。有研究[26-27]表明，炎癥反應伴隨肝纖維化發生發展，肝細胞焦亡可使炎癥小體活化，造成炎癥介質釋放，引發肝臟炎癥，進而發展為肝纖維化。Em感染作為一種特殊類型的慢性肝損傷，所致肝纖維化是棘球蚴在肝臟生長發育形成包囊對周圍肝組織造成損傷后所發生的慢性修復反應，其病理基礎是機體對棘球蚴分泌的抗原產生免疫應答，進而激活肝星狀細胞轉化為成纖維細胞，釋放并積累大量細胞外基質，破壞正常肝組織結構，最終導致肝纖維化[28]。所以，為發掘宿主抗寄生蟲的固有免疫應答，細胞焦亡作為AE導致肝纖維化的中間環節之一，本研究將為AE的治療提供理論依據。
如何尋找合適的種植方法，在減少實驗動物造模并發癥的同時提高肝臟種植感染率呢？腹腔注射法[29]是最早使用且最常用的小鼠AE造模方法，具體方法是直接在小鼠右下腹腹腔內注射多房棘球蚴原頭節的混懸液，此方法操作簡單，術后感染少，動物一般狀況良好，存活率高，弊端是感染后形成的棘球蚴病灶往往分布在腹腔內各個器官，肝臟陽性率低，且腹腔粘連明顯。開腹肝穿刺法[29]是小鼠開腹后，將定量的多房棘球蚴原頭節混懸液直接注射于肝臟。該方法的優點是穿刺點定位明確，接種率高，不容易發生誤入胸腔、誤穿大血管等并發癥，弊端是手術步驟繁瑣，操作過程出血多，損傷大，且術后易并發感染、腸梗阻、甚至死亡。卞志遠等[30]發現經皮肝穿刺法操作簡易，存活率較高，缺點是肝葉定位不確切，穿刺過程易誤入胸腔，導致小鼠氣胸、呼吸衰竭甚至死亡，若誤穿進入大血管或膽道后可發生嚴重并發癥。若能憑借影像學輔助定位，可明顯降低誤穿引起的嚴重并發癥。切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺法[30-31]是經腹壁肌層，向肝臟注射多房棘球蚴原頭節混懸液的動物造模辦法，因小鼠腹壁肌層較薄呈半透明狀，可避開腹壁大血管且不易誤入胸腔，因此該方法操作簡單，造模成功率高，弊端是僅適用于小體型實驗動物的接種。門靜脈分支注射法同開腹肝穿刺法一樣，首先需要動物開腹，然后將定量的多房棘球蚴原頭節混懸液穿刺并注入暴露的門靜脈分支內，并用絲線結扎注射靜脈的遠端。吳亮亮等[32]認為該操作方法近似棘球蚴的自然感染途徑，但在小型實驗動物的接種過程中操作復雜，因門靜脈分支靜較細，故注射難度較大，且實驗動物術后易發生出血、腸梗阻、腸壞死甚至死亡。權衡利弊后，本研究最終采用通過切開皮膚經腹壁肌層肝穿刺注射原頭蚴的方法構建BALB/c小鼠多房棘球蚴病模型，發現Em感染宿主后，均定植在肝組織，此造模方式操作簡單，創傷小，可用于推廣。在本次實驗中，受感染的小鼠肝臟表面出現了大小不一的白色病灶，隨著感染時間的延長，病變范圍明顯擴大，感染后期導致部分病灶發生實質性變化。
本研究通過免疫組化聯合免疫印跡法檢測，雙重證實了小鼠Em感染后，細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路關鍵蛋白的表達呈現先升高后逐漸降低的趨勢。本研究僅從細胞焦亡的經典途徑入手，證明了小鼠肝Em感染后存在細胞焦亡現象，可能通過細胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路發揮炎癥放大作用。本研究只通過小鼠模型證明了存在細胞焦亡現象，若能通過AE患者手術標本去驗證是否有相同的現象，將更能證明細胞焦亡與AE之間的關系。流式細胞技術可將細胞焦亡現象進一步定位到細胞水平，明確具體發生焦亡的細胞。未來可進一步探索該疾病與細胞焦亡的其他途徑的相關性，論證有無其他更多的靶點引起病灶周圍組織中的炎癥反應。AE病程中伴隨眾多因子相互作用，且免疫逃逸機制尚不完全清楚，故探究細胞焦亡與其他免疫逃逸機制的相互作用這在AE的進一步研究方面意義深遠，同時相關因子的進一步亞型研究以及針對性的抑制劑研究，可為防治AE尋求新靶點，提供新思路。
重要聲明
利益沖突聲明:本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：乜茹、劉川川和李文登共同完成動物實驗；龐明泉、尹鳳嬌和冶賡博負責整理實驗數據和查閱文獻；乜茹負責完成論文撰寫；王志鑫和樊海寧負責論文審校和修改。
倫理聲明：本研究通過了青海大學附屬醫院科研倫理委員會的審批（批文編號：P-SL-2019054），符合倫理原則。
