引用本文： 魏念瑾, 劉鑫, 魏九峰, 陳洪生. 微小RNA在結直腸癌相關信號通路中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(4): 506-512. doi: 10.7507/1007-9424.202211017 復制
我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率和病死率均呈上升趨勢[1-2]。因此，進一步為CRC患者探尋有效的治療方法迫在眉睫。CRC是由正常結腸上皮經過一系列遺傳和表觀遺傳學改變逐步積累的結果，最終導致結直腸腺瘤和浸潤性腺癌的發生。而表觀遺傳標志如DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA是癌的重要分子標志，它出現在疾病發病機制的早期，幾乎涉及所有與癌相關的關鍵信號通路[3]，如Wnt-β-連環蛋白（β-catenin）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（又稱Akt或Rac）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）、Notch、Hippo、Hedgehog等信號通路。而微小RNA（microRNA，miRNA或miR）可以在轉錄后水平抑制蛋白表達并影響許多與癌相關的信號通路，幾乎在CRC的所有階段即從起始到進展和轉移均發生作用，調控幾乎所有與CRC相關的重要信號通路[4]。因此，筆者通過總結近3年來miRNA在CRC有關的信號通路中作用的最新研究進展（表1），希冀能為CRC的診斷、治療及預后研究提供新方向。
表1
miRNA與CRC相關的主要信號通路
1 miRNA簡介
miRNA是一種小的單鏈RNA（18～25個核苷酸），它們主要通過與其靶mRNA的3′ -非翻譯區中的互補序列結合而發揮轉錄后抑制功能，能控制＞60%的蛋白質編碼基因的翻譯，調節重要的促腫瘤過程如細胞增殖、分化和凋亡[3]。miRNA源于RNA聚合酶Ⅱ對miRNA基因的轉錄，生成雙鏈且具有發夾結構的前體miRNA，然后被由RNase Ⅲ核酸酶Drosha和RNA結合蛋白DiGeorge綜合征危象區基因8組成的微處理器復合物切割成前體miRNA，被輸出蛋白5轉運到細胞質。在細胞質中由RNase Ⅲ核酸酶Dicer切斷發夾環，產生雙鏈miRNA-miRNA分子。RNA誘導沉默復合體結合其中1條鏈，介導它與靶mRNA相互作用，從而導致翻譯抑制或mRNA降解（圖1）。
圖1
示miRNA的生成過程示意圖
RNA Pol Ⅱ：RNA聚合酶Ⅱ；m7G-Cap：帽子結構；pri-miRNA：初級miRNA；Pre-miRNA：前體miRNA；DGCR8：DiGeorge綜合征危象區基因8；Drosha和Dicer：均為RNase Ⅲ核酸酶；Exportin 5：輸出蛋白5；RISC：RNA誘導沉默復合體；Ago：Ago蛋白；Strand selection：引導鏈選擇（紅色）；Passenger degradation：乘客鏈降解（藍色）；mRNA degradation：mRNA降解；Translation：翻譯
2 miRNA在與CRC相關的重要信號通路中的作用
2.1 miRNA在Wnt-β-catenin信號通路中的作用
Wnt信號通路在物種進化過程中高度保守，在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關重要的作用[5]。如果Wnt信號通路中的關鍵蛋白發生突變，則會導致信號異常活化，可能誘導癌的發生。Wnt信號通路包括經典（β-catenin依賴）和非經典（β-catenin非依賴）通路。非經典Wnt信號通路包括Wnt/平面細胞極化信號通路和Wnt/Ca2+ 通路[6]。一般提到的Wnt信號通路主要指的是由β-catenin介導的經典通路。β-catenin是經典Wnt信號通路的關鍵效應蛋白，而Wnt蛋白是激活經典Wnt信號通路的重要細胞內配體。在無Wnt蛋白的情況下，細胞質內的β-catenin由包括核心蛋白Axis抑制蛋白、腺瘤性結腸息肉病蛋白、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）及酪蛋白激酶1共同組成的降解復合體調控，降解復合體將β-catenin的N端磷酸化并作用于蛋白酶降解蛋白，誘導β-catenin持續清除，從而阻礙其核轉運；在有Wnt蛋白的情況下，Wnt蛋白與跨膜受體卷曲相關蛋白和輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白-5/6結合，激活細胞內蓬亂蛋白，蓬亂蛋白抑制降解復合體的活性，阻止β-catenin的N端磷酸化，避免β-catenin被蛋白酶降解，從而使β-catenin穩定存在于細胞質中，于是細胞質內的β-catenin蛋白就會累積并轉移到細胞核，與轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子家族成員結合相互作用，從而啟動下游靶基因的轉錄[7-8]。
近3年研究較多的與Wnt-β-catenin信號通路有關的miRNA主要有miR-520e、miR-8063、miR-576-5p、miR-142-3p、miR-19a-3p、miR-381、miR-411及miR-1205。miR-520e抑制GSK3的磷酸化并降低β-catenin的表達[9]，miR-8063過表達可以下調Wnt3a、Wnt5a和β-catenin[10]，miR-576-5p可以調節Wnt5a介導的Wnt-β-catenin信號通路[11]，miR-142-3p通過直接靶向抑制β-catenin的轉錄活性來阻斷Wnt信號的激活[12]，沉默miR-19a-3p顯著抑制磷酸化GSK-3β和β-catenin的表達并增強GSK-3β、磷酸化β-catenin、α-catenin和E-鈣黏蛋白表達水平[13]，以上這些miRNA均通過抑制Wnt-β-catenin信號通路抑制CRC的增殖、侵襲和遷移。此外，miR-381在CRC組織中表達下調，激活Wnt-β-catenin信號通路，從而抑制CRC細胞增殖、侵襲和遷移[14]；通過海綿化miR-411或miR-1205可以激活Wnt-β-catenin信號通路，為CRC的抑制劑[15]。
從以上研究結果提示，許多miRNA涉及到Wnt-β-catenin信號通路的調控，從而抑制或增強CRC組織細胞的增殖、遷移和侵襲。
2.2 miRNA在PI3K-Akt信號通路中的作用
PI3K-Akt是一種重要的細胞內信號通路，它負責細胞生長、增殖、分化、遷移等多種細胞活動[16]。PI3K是一種細胞內的磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，它由調節性亞基p85和催化性亞基p110構成；Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K的下游靶點，介導PI3K對腫瘤的增殖作用，磷酸化的Akt與CRC細胞的生長和凋亡抑制有關。PI3K信號通路由生長因子如表皮生長因子受體激活，激活的PI3K磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3），PIP3可激活Akt，促進細胞增殖和存活，而抑癌基因10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源物缺失（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）可通過對PIP3的去磷酸化來下調PI3K信號通路[17]。Akt調節的下游靶點如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調控基因的轉錄及蛋白質的合成，還可調控細胞的生長和存活，促進血管生成、蛋白質翻譯和新陳代謝[18]。
近3年研究較多的與PI3K-Akt信號通路有關的miRNA主要有miR-19a、miR-493-5p、miR-3064-5p、miR-196b-5p及miR-3651。miR-19a與PTEN mRNA結合，激活PI3K-Akt信號通路[19]；miR-493-5p在CRC中表達顯著下調，其上調降低PI3K（提示直接靶向PI3K），其過表達抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲[20]；miR-3064-5p在CRC中表達顯著下調，其過表達抑制PI3K-Akt信號通路的激活[21]。此外，miR-196b-5p在CRC中表達豐富，靶向調控PI3K-Akt信號通路激活，促進CRC的細胞增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡[22]；miR-3651在CRC中過度表達，其下調可使CRC中的PI3K-Akt信號通路失活[23]。
2.3 miRNA在MAPK信號通路中的作用
MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是從細胞表面到細胞核的主要細胞增殖信號通路，該信號通路已在哺乳動物細胞中得到廣泛研究，并通過促進細胞增殖和調節細胞周期進程在人類癌中發揮重要作用[8]。MAPK有3個主要亞家族：細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK；又被稱為應激活化蛋白激酶）和MAPK14。ERK MAPK信號通路是細胞增殖最重要的途徑之一，該信號通路的激活與人類CRC的發病機制、進展和致癌有關。MAPK通路位于許多生長因子受體的下游，包括表皮生長因子受體。MAPK信號通路被各種刺激因素激活如肽生長因子、細胞因子、激素等，調節細胞的增殖、分化和死亡[24]。通過蛋白激酶C或Ras傳遞的信號觸發ERK信號通路，然后激活Raf，啟動絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）和ERK激活的級聯反應，從而形成Ras/Raf/MEK/ERK信號通路[25]。
近3年研究較多的與MAPK信號通路有關的miRNA主要有miR-1288-3p、miR-3651及miR-152-3p。MAPK信號通路的Ras樣雌激素調節生長抑制因子為miR-1288-3p的靶基因[26]；miR-3651在CRC組織中過度表達，其下調使CRC細胞中的MAPK信號通路失活[23]；下調miR-152-3p可以通過MAPK信號通路激活而促進CRC的進展[27]。
2.4 miRNA在TGF-β信號通路中的作用
TGF-β信號通路在癌細胞增殖、分化、遷移和凋亡中發揮重要作用。TGF-β抑制正常腸上皮細胞增殖并誘導細胞凋亡和分化，在正常腸上皮中充當腫瘤抑制因子。CRC在起始階段和后續階段會丟失腫瘤抑制蛋白如TGF-β，對TGF-β誘導的生長抑制具有抗性。然而已證明TGF-β在CRC發生的晚期高表達，因此它在CRC的晚期階段又充當腫瘤促進因子[28]。TGF-β信號的啟動通過TGF-β配體與Ⅱ型TGF-β受體（type Ⅱ transforming growth factor beta receptor，TGFBR2）的結合而發生，TGFBR2募集并磷酸化Ⅰ型TGF-β受體（type Ⅰ transforming growth factor beta receptor，TGFBR1），從而刺激TGFBR1的蛋白激酶活性；然后下游的轉錄因子、受體相關Smad蛋白或Smad2和Smad3被激活的TGFBR1磷酸化和激活，從而使它們與Smad4結合；最終，受體相關Smad蛋白效應子與Smad4形成復合物，轉入細胞核以調節靶基因的轉錄[29]。
近3年研究較多的與TGF-β信號通路有關的miRNA主要有miR-183-5p、miR-21-5p、miR-195-5p、miR-581、miR-2911、miR-128-3p及let-7a。上調的miR-183-5p和miR-21-5p以及下調的miR-195-5p通過TGF-β信號通路參與癌發展[30]；miR-581與Smad7結合既可以影響細胞侵襲能力，又可以通過TGF-β信號通路調節上皮間質轉化[31]；miR-2911能與TGF-β1 mRNA強結合而下調TGF-β1的表達，通過靶向TGF-β1 mRNA抑制CRC發展[32]；miR-128-3p在CRC細胞中高表達，過表達激活TGF-β/Smad信號通路，從而導致上皮間質轉化[33]；miRNA let-7a可通過調節TGF-β信號通路有效抑制腫瘤的增殖和轉移，用let-7a轉染CRC細胞導致TGF-β1和磷酸化Smad2蛋白表達下調[34]。
2.5 miRNA在NF-κB信號通路中的作用
NF-κB廣泛參與癌的發展和進展。在CRC中，NF-κB在細胞增殖、凋亡、炎癥、血管生成、轉移等癌相關過程中起關鍵作用。NF-κB是一種異源二聚體蛋白，發現了5種：p50、p52、p65（又叫RelA）、RelB和c-Rel。p50和p65是NF-κB激活和核轉位所必需。在細胞處于靜息狀態時，NF-κB與存在于細胞質中的NF-κB抑制劑（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB）結合，通過覆蓋核定位序列、阻斷DNA結合和NF-κB的核攝取來使NF-κB失活[35]。NF-κB信號轉導分為2條途徑：經典途徑和非經典途徑。在經典NF-κB信號通路中，NF-κB可被多種炎癥刺激物激活，如細菌、病毒、脂多糖、白細胞介素-1α/β、腫瘤壞死因子-α和許多藥物。IκB激酶（IκB kinase，IKK）復合物由2個催化亞基（IKKα和IKKβ）和一個調節亞基（IKKγ）組成，IKK的激活主要由IKKβ介導。受體的激活信號主要通過IKK傳遞，IKK復合物磷酸化p65/p50結合的IκB，磷酸化的IκB通過泛素-蛋白酶體途徑降解，從而激活NF-κB，促進NF-κB易位并進入細胞核，激活靶基因如趨化因子、細胞因子和抗凋亡基因。非經典NF-κB 通路主要由B細胞激活因子、CD40和淋巴毒素β介導。NF-κB誘導激酶可促進IKKα的激活，磷酸化IKKα，將第Ⅱ類IκB p100轉化為p52蛋白，與RelB形成RelB/p52復合物，易位至細胞核中，激活轉錄[8, 35]。
近3年研究較多的與NF-κB信號通路有關的miRNA主要有miR-155、miR-129及miR-21。miR-155的過表達促進了NF-κB的核轉位，下調其表達可以抑制NF-κB通路的激活[36]；miR-129過表達顯著抑制細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，并激活CRC細胞中的NF-κB信號通路[37]；miR-21通過激活NF-κB通路促進癌變[38]；NF-κB信號通路能被miR-372顯著抑制[39]。
2.6 miRNA在JAK-STAT信號通路中的作用
JAK-STAT信號通路參與癌細胞遷移、生長和分化。當JAKs被細胞因子激活時反過來激活信號分子STATs。激活的STATs從細胞質轉移到細胞核，增強了靶基因的轉錄。現已發現4種JAK（JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）和7 種 STAT（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6）。JAK-STAT信號通路中最重要的分子是JAK2和STAT3。在被細胞因子激活后，幾個JAK2分子緊密靠近并磷酸化；然后磷酸化的JAK2通過磷酸化激活STAT3，磷酸化STAT3易位并進入細胞核導致幾個基因的轉錄增強，如上皮間質轉化相關基因、c-myc、基質金屬蛋白酶2和p53。在CRC中，JAK-STAT信號通路可以增強癌細胞的侵襲、遷移、生長和化學藥物治療耐藥性，同時調節細胞進程、細胞凋亡和細胞周期進程[40]。
近3年研究較多的與JAK-STAT信號通路有關的miRNA主要有miR-198、miR-452、miR-128-3p及miR-495。miR-198在CRC細胞系中的表達顯著降低，它阻斷CRC細胞中的JAK-STAT信號通路來抑制細胞增殖[41]；miR-452在CRC細胞系中的過表達顯著降低了JAK1、STAT1和STAT3的表達[42]；miR-128-3p的高表達與CRC患者的神經周圍浸潤、淋巴血管浸潤、腫瘤分期和CA19-9含量顯著相關，它可以激活JAK-STAT3信號，從而導致上皮間質轉化[33]；JAK2-STAT3信號通路的激活還受miR-495的調控[43]。
2.7 miRNA在Notch信號通路中的作用
Notch通路是負責直接細胞間相互作用的高度保守的細胞通路之一。Notch通路的正常功能對于正常細胞發育、分化、增殖和凋亡至關重要。Notch信號通路有4種受體Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4 以及5種配體Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1、Delta-like-3和Delta-like-4。Notch受體是包含兩種類型的細胞外和細胞內結構域的跨膜蛋白。Notch配體是Delta-Serrate-Lag2（DSL）家族的單通道跨膜蛋白，含有表皮細胞生長因子樣重復序列。當Notch配體與靶細胞的Notch受體結合時，通過激活γ-分泌酶蛋白復合物并切割Notch受體，將啟動Notch信號激活[29]。
近3年研究較多的與Notch信號通路有關的miRNA主要有miR-223、miR-10b及miR-449a。miR-223可以通過Notch信號通路增強CRC細胞的增殖并阻止其凋亡[44]；miR-10b可以靶向結合Notch信號通路受體進而調節Notch信號通路[45]；Notch-1是miR-449a的靶mRNA，增強其表達可以抑制CRC細胞增殖[46]。
2.8 miRNA在Hippo信號通路中的作用
Hippo信號通路是調節干細胞增殖、形態、存活、遷移、自我更新、遷移、組織穩態和器官大小的重要信號通路。Hippo信號通路被認為是腫瘤形成中最重要的信號通路之一，因為它通過該通路的多個成分抑制腫瘤的發展，包括大腫瘤抑制激酶、巨噬細胞刺激 （macrophage stimulating，MST）、Taffazin（TAZ）激酶、Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）和轉錄增強相關結構域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）。Hippo負調控其主要效應子YAP1和TAZ激酶，它們作為轉錄共激活因子誘導基因表達，不僅參與組織修復和增殖，而且是參與腫瘤進展的癌蛋白。由脂肪酸轉運蛋白家族的跨膜蛋白增加的MST上調大腫瘤抑制激酶使YAP磷酸化，從而阻止YAP從細胞質轉移到細胞核，減弱了YAP/TAZ復合物與TEAD相互作用的能力，導致β-catenin、K-ras、Akt/mTOR等癌基因在CRC的發生和發展過程中失活。在CRC中，Hippo信號通路受到抑制，YAP表達增加，從而誘導結腸癌細胞的遷移、侵襲、增殖和上皮間質轉化[8, 47]。
近3年研究較多的與Hippo信號通路有關的miRNA主要有miR-30a-5p、miR-375和miR-9。CRC組織和細胞中miR-30a-5p的表達下調伴隨著Hippo信號通路的失活，可以促進CRC細胞的活力、侵襲和遷移[48]；miR-375下調YAP1，導致Hippo-YAP1信號通路下游基因結締組織生長因子、cyclin D1和含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復蛋白5的表達降低[49]；miR-9影響Hippo信號通路抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[50]。
2.9 miRNA在Hedgehog信號通路中的作用
Hedgehog信號通路參與多種細胞功能包括細胞生長、增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲。Hedgehog信號通路由3種配體（聲波Hedgehog、印度Hedgehog和沙漠Hedgehog）和2種跨膜受體Patched（Ptch）和Smoothened（Smo）組成。正常情況下Ptch蛋白能夠抑制Smo蛋白活性，聲波Hedgehog與Ptch結合后可以解除Ptch介導的Smo抑制，從而激活下游的信號通路，導致膠質瘤相關癌基因同源物1和2從細胞質移位到細胞核，調節靶基因的轉錄[8, 51]。
近3年研究較多的與Hedgehog信號通路有關的miRNA主要有miR-372和miR-373。miR-372和miR-373在CRC組織中表達水平升高，二者可以上調CRC細胞中Hedgehog信號通路[39]。
3 miRNA與CRC的早期診斷
CRC仍缺乏有效診斷和預后生物標志物，確診時間早晚對患者生存影響大。研究[52]表明，Ⅰ期CRC的生存率為93%，而Ⅳ期CRC的生存率降至8%。目前，結腸鏡檢查是診斷CRC的金標準，但具有侵入和繁瑣缺點。此外，糞便潛血試驗也是CRC常用的診斷方法之一，但靈敏度和特異度較低[53]。miRNA靈敏度和特異度較高，因此miRNA在CRC中是一種新的、有前景的生物標志物。
有研究者[54]通過組合let-7e-5p、miRNA-106a-5p、miRNA-28-3p及miRNA-542-5p構成預測工具，可區分CRC患者與健康人群，還可區分息肉和腺瘤。miR-19a-3p、miR-203-3p、miR-221-3p和let-7f-5p在CRC中表達量升高，可作為早期診斷的生物標志物[55]。miR-183、miR-20a、miR -21[52]、miR-216a-5p[56]、let-7c、let-7e、miR-34c和miR-133b[57]在CRC組織中表達升高，可以早期診斷CRC。近年來，關于血清外泌體miRNA在CRC診斷及預后中應用的研究越來越多[58]。4種血清外泌體miRNA（miR-15b、miR-16、miR-21和miR-31）可以區分健康人群與CRC患者，也可以區分腺瘤與CRC患者[53]。
4 總結與展望
miRNA調控幾乎所有與CRC相關的重要信號通路。在CRC的發展過程中這些通路并不是只存在一種信號通路的異常激活，且涉及多個信號通路的共同激活，它們互相交互作用，促進CRC的發生、發展和轉移。miRNA也不僅僅在某一種信號通路中發揮作用，如miR-21激活PI3K-Akt和NF-κB信號通路[38]；miR-128-3p過表達可以激活TGF-β和JAK-STAT3信號通路[33]；miR-335可使NF-κB和Wnt-β-catenin信號通路失活[59]；miR-3651的下調使CRC細胞中的PI3K-Akt和MAPK信號通路失活[23]；上調的miR-183-5p和miR-21-5p以及下調的miR-195-5p和miR-497-5p參與CRC中的 Wnt-β-catenin、MAPK、PI3K-Akt和TGF-β信號通路的調節[30]；miR-1246可調節Wnt-β-catenin、MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt和Notch2信號通路的活性[60]；miR-372和miR-373過表達使CRC細胞中Hedgehog信號通路被上調，而NF-κB和MAPK信號通路被顯著抑制[39]。因此，miRNA可以在多種信號通路中同時發揮作用，幾乎在CRC的所有階段都有作用，從起始到進展和轉移，這可能是CRC具有高度分子異質性的原因。隨著分子生物學的發展，越來越多的miRNA在CRC相關信號通路中的作用被發現，CRC相關信號通路的作用機制也會被逐漸闡明。筆者通過總結近3年miRNA在CRC相關信號通路的研究進展，希望可以為通過對miRNA的靶向干預提供新思路，同時希望miRNA作為腫瘤分子標志物來預測CRC細胞的增殖、遷移、侵襲及轉移過程，從而對CRC進行早期干預。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：魏念瑾整理文獻并撰寫文章；陳洪生和魏九峰指導論文撰寫；劉鑫完成文獻檢索和信息收集。
我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率和病死率均呈上升趨勢[1-2]。因此，進一步為CRC患者探尋有效的治療方法迫在眉睫。CRC是由正常結腸上皮經過一系列遺傳和表觀遺傳學改變逐步積累的結果，最終導致結直腸腺瘤和浸潤性腺癌的發生。而表觀遺傳標志如DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA是癌的重要分子標志，它出現在疾病發病機制的早期，幾乎涉及所有與癌相關的關鍵信號通路[3]，如Wnt-β-連環蛋白（β-catenin）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（又稱Akt或Rac）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）、Notch、Hippo、Hedgehog等信號通路。而微小RNA（microRNA，miRNA或miR）可以在轉錄后水平抑制蛋白表達并影響許多與癌相關的信號通路，幾乎在CRC的所有階段即從起始到進展和轉移均發生作用，調控幾乎所有與CRC相關的重要信號通路[4]。因此，筆者通過總結近3年來miRNA在CRC有關的信號通路中作用的最新研究進展（表1），希冀能為CRC的診斷、治療及預后研究提供新方向。
表1
miRNA與CRC相關的主要信號通路
1 miRNA簡介
miRNA是一種小的單鏈RNA（18～25個核苷酸），它們主要通過與其靶mRNA的3′ -非翻譯區中的互補序列結合而發揮轉錄后抑制功能，能控制＞60%的蛋白質編碼基因的翻譯，調節重要的促腫瘤過程如細胞增殖、分化和凋亡[3]。miRNA源于RNA聚合酶Ⅱ對miRNA基因的轉錄，生成雙鏈且具有發夾結構的前體miRNA，然后被由RNase Ⅲ核酸酶Drosha和RNA結合蛋白DiGeorge綜合征危象區基因8組成的微處理器復合物切割成前體miRNA，被輸出蛋白5轉運到細胞質。在細胞質中由RNase Ⅲ核酸酶Dicer切斷發夾環，產生雙鏈miRNA-miRNA分子。RNA誘導沉默復合體結合其中1條鏈，介導它與靶mRNA相互作用，從而導致翻譯抑制或mRNA降解（圖1）。
圖1
示miRNA的生成過程示意圖
RNA Pol Ⅱ：RNA聚合酶Ⅱ；m7G-Cap：帽子結構；pri-miRNA：初級miRNA；Pre-miRNA：前體miRNA；DGCR8：DiGeorge綜合征危象區基因8；Drosha和Dicer：均為RNase Ⅲ核酸酶；Exportin 5：輸出蛋白5；RISC：RNA誘導沉默復合體；Ago：Ago蛋白；Strand selection：引導鏈選擇（紅色）；Passenger degradation：乘客鏈降解（藍色）；mRNA degradation：mRNA降解；Translation：翻譯
2 miRNA在與CRC相關的重要信號通路中的作用
2.1 miRNA在Wnt-β-catenin信號通路中的作用
Wnt信號通路在物種進化過程中高度保守，在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關重要的作用[5]。如果Wnt信號通路中的關鍵蛋白發生突變，則會導致信號異常活化，可能誘導癌的發生。Wnt信號通路包括經典（β-catenin依賴）和非經典（β-catenin非依賴）通路。非經典Wnt信號通路包括Wnt/平面細胞極化信號通路和Wnt/Ca2+ 通路[6]。一般提到的Wnt信號通路主要指的是由β-catenin介導的經典通路。β-catenin是經典Wnt信號通路的關鍵效應蛋白，而Wnt蛋白是激活經典Wnt信號通路的重要細胞內配體。在無Wnt蛋白的情況下，細胞質內的β-catenin由包括核心蛋白Axis抑制蛋白、腺瘤性結腸息肉病蛋白、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）及酪蛋白激酶1共同組成的降解復合體調控，降解復合體將β-catenin的N端磷酸化并作用于蛋白酶降解蛋白，誘導β-catenin持續清除，從而阻礙其核轉運；在有Wnt蛋白的情況下，Wnt蛋白與跨膜受體卷曲相關蛋白和輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白-5/6結合，激活細胞內蓬亂蛋白，蓬亂蛋白抑制降解復合體的活性，阻止β-catenin的N端磷酸化，避免β-catenin被蛋白酶降解，從而使β-catenin穩定存在于細胞質中，于是細胞質內的β-catenin蛋白就會累積并轉移到細胞核，與轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子家族成員結合相互作用，從而啟動下游靶基因的轉錄[7-8]。
近3年研究較多的與Wnt-β-catenin信號通路有關的miRNA主要有miR-520e、miR-8063、miR-576-5p、miR-142-3p、miR-19a-3p、miR-381、miR-411及miR-1205。miR-520e抑制GSK3的磷酸化并降低β-catenin的表達[9]，miR-8063過表達可以下調Wnt3a、Wnt5a和β-catenin[10]，miR-576-5p可以調節Wnt5a介導的Wnt-β-catenin信號通路[11]，miR-142-3p通過直接靶向抑制β-catenin的轉錄活性來阻斷Wnt信號的激活[12]，沉默miR-19a-3p顯著抑制磷酸化GSK-3β和β-catenin的表達并增強GSK-3β、磷酸化β-catenin、α-catenin和E-鈣黏蛋白表達水平[13]，以上這些miRNA均通過抑制Wnt-β-catenin信號通路抑制CRC的增殖、侵襲和遷移。此外，miR-381在CRC組織中表達下調，激活Wnt-β-catenin信號通路，從而抑制CRC細胞增殖、侵襲和遷移[14]；通過海綿化miR-411或miR-1205可以激活Wnt-β-catenin信號通路，為CRC的抑制劑[15]。
從以上研究結果提示，許多miRNA涉及到Wnt-β-catenin信號通路的調控，從而抑制或增強CRC組織細胞的增殖、遷移和侵襲。
2.2 miRNA在PI3K-Akt信號通路中的作用
PI3K-Akt是一種重要的細胞內信號通路，它負責細胞生長、增殖、分化、遷移等多種細胞活動[16]。PI3K是一種細胞內的磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，它由調節性亞基p85和催化性亞基p110構成；Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K的下游靶點，介導PI3K對腫瘤的增殖作用，磷酸化的Akt與CRC細胞的生長和凋亡抑制有關。PI3K信號通路由生長因子如表皮生長因子受體激活，激活的PI3K磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3），PIP3可激活Akt，促進細胞增殖和存活，而抑癌基因10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源物缺失（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）可通過對PIP3的去磷酸化來下調PI3K信號通路[17]。Akt調節的下游靶點如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調控基因的轉錄及蛋白質的合成，還可調控細胞的生長和存活，促進血管生成、蛋白質翻譯和新陳代謝[18]。
近3年研究較多的與PI3K-Akt信號通路有關的miRNA主要有miR-19a、miR-493-5p、miR-3064-5p、miR-196b-5p及miR-3651。miR-19a與PTEN mRNA結合，激活PI3K-Akt信號通路[19]；miR-493-5p在CRC中表達顯著下調，其上調降低PI3K（提示直接靶向PI3K），其過表達抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲[20]；miR-3064-5p在CRC中表達顯著下調，其過表達抑制PI3K-Akt信號通路的激活[21]。此外，miR-196b-5p在CRC中表達豐富，靶向調控PI3K-Akt信號通路激活，促進CRC的細胞增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡[22]；miR-3651在CRC中過度表達，其下調可使CRC中的PI3K-Akt信號通路失活[23]。
2.3 miRNA在MAPK信號通路中的作用
MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是從細胞表面到細胞核的主要細胞增殖信號通路，該信號通路已在哺乳動物細胞中得到廣泛研究，并通過促進細胞增殖和調節細胞周期進程在人類癌中發揮重要作用[8]。MAPK有3個主要亞家族：細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK；又被稱為應激活化蛋白激酶）和MAPK14。ERK MAPK信號通路是細胞增殖最重要的途徑之一，該信號通路的激活與人類CRC的發病機制、進展和致癌有關。MAPK通路位于許多生長因子受體的下游，包括表皮生長因子受體。MAPK信號通路被各種刺激因素激活如肽生長因子、細胞因子、激素等，調節細胞的增殖、分化和死亡[24]。通過蛋白激酶C或Ras傳遞的信號觸發ERK信號通路，然后激活Raf，啟動絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）和ERK激活的級聯反應，從而形成Ras/Raf/MEK/ERK信號通路[25]。
近3年研究較多的與MAPK信號通路有關的miRNA主要有miR-1288-3p、miR-3651及miR-152-3p。MAPK信號通路的Ras樣雌激素調節生長抑制因子為miR-1288-3p的靶基因[26]；miR-3651在CRC組織中過度表達，其下調使CRC細胞中的MAPK信號通路失活[23]；下調miR-152-3p可以通過MAPK信號通路激活而促進CRC的進展[27]。
2.4 miRNA在TGF-β信號通路中的作用
TGF-β信號通路在癌細胞增殖、分化、遷移和凋亡中發揮重要作用。TGF-β抑制正常腸上皮細胞增殖并誘導細胞凋亡和分化，在正常腸上皮中充當腫瘤抑制因子。CRC在起始階段和后續階段會丟失腫瘤抑制蛋白如TGF-β，對TGF-β誘導的生長抑制具有抗性。然而已證明TGF-β在CRC發生的晚期高表達，因此它在CRC的晚期階段又充當腫瘤促進因子[28]。TGF-β信號的啟動通過TGF-β配體與Ⅱ型TGF-β受體（type Ⅱ transforming growth factor beta receptor，TGFBR2）的結合而發生，TGFBR2募集并磷酸化Ⅰ型TGF-β受體（type Ⅰ transforming growth factor beta receptor，TGFBR1），從而刺激TGFBR1的蛋白激酶活性；然后下游的轉錄因子、受體相關Smad蛋白或Smad2和Smad3被激活的TGFBR1磷酸化和激活，從而使它們與Smad4結合；最終，受體相關Smad蛋白效應子與Smad4形成復合物，轉入細胞核以調節靶基因的轉錄[29]。
近3年研究較多的與TGF-β信號通路有關的miRNA主要有miR-183-5p、miR-21-5p、miR-195-5p、miR-581、miR-2911、miR-128-3p及let-7a。上調的miR-183-5p和miR-21-5p以及下調的miR-195-5p通過TGF-β信號通路參與癌發展[30]；miR-581與Smad7結合既可以影響細胞侵襲能力，又可以通過TGF-β信號通路調節上皮間質轉化[31]；miR-2911能與TGF-β1 mRNA強結合而下調TGF-β1的表達，通過靶向TGF-β1 mRNA抑制CRC發展[32]；miR-128-3p在CRC細胞中高表達，過表達激活TGF-β/Smad信號通路，從而導致上皮間質轉化[33]；miRNA let-7a可通過調節TGF-β信號通路有效抑制腫瘤的增殖和轉移，用let-7a轉染CRC細胞導致TGF-β1和磷酸化Smad2蛋白表達下調[34]。
2.5 miRNA在NF-κB信號通路中的作用
NF-κB廣泛參與癌的發展和進展。在CRC中，NF-κB在細胞增殖、凋亡、炎癥、血管生成、轉移等癌相關過程中起關鍵作用。NF-κB是一種異源二聚體蛋白，發現了5種：p50、p52、p65（又叫RelA）、RelB和c-Rel。p50和p65是NF-κB激活和核轉位所必需。在細胞處于靜息狀態時，NF-κB與存在于細胞質中的NF-κB抑制劑（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB）結合，通過覆蓋核定位序列、阻斷DNA結合和NF-κB的核攝取來使NF-κB失活[35]。NF-κB信號轉導分為2條途徑：經典途徑和非經典途徑。在經典NF-κB信號通路中，NF-κB可被多種炎癥刺激物激活，如細菌、病毒、脂多糖、白細胞介素-1α/β、腫瘤壞死因子-α和許多藥物。IκB激酶（IκB kinase，IKK）復合物由2個催化亞基（IKKα和IKKβ）和一個調節亞基（IKKγ）組成，IKK的激活主要由IKKβ介導。受體的激活信號主要通過IKK傳遞，IKK復合物磷酸化p65/p50結合的IκB，磷酸化的IκB通過泛素-蛋白酶體途徑降解，從而激活NF-κB，促進NF-κB易位并進入細胞核，激活靶基因如趨化因子、細胞因子和抗凋亡基因。非經典NF-κB 通路主要由B細胞激活因子、CD40和淋巴毒素β介導。NF-κB誘導激酶可促進IKKα的激活，磷酸化IKKα，將第Ⅱ類IκB p100轉化為p52蛋白，與RelB形成RelB/p52復合物，易位至細胞核中，激活轉錄[8, 35]。
近3年研究較多的與NF-κB信號通路有關的miRNA主要有miR-155、miR-129及miR-21。miR-155的過表達促進了NF-κB的核轉位，下調其表達可以抑制NF-κB通路的激活[36]；miR-129過表達顯著抑制細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，并激活CRC細胞中的NF-κB信號通路[37]；miR-21通過激活NF-κB通路促進癌變[38]；NF-κB信號通路能被miR-372顯著抑制[39]。
2.6 miRNA在JAK-STAT信號通路中的作用
JAK-STAT信號通路參與癌細胞遷移、生長和分化。當JAKs被細胞因子激活時反過來激活信號分子STATs。激活的STATs從細胞質轉移到細胞核，增強了靶基因的轉錄。現已發現4種JAK（JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）和7 種 STAT（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6）。JAK-STAT信號通路中最重要的分子是JAK2和STAT3。在被細胞因子激活后，幾個JAK2分子緊密靠近并磷酸化；然后磷酸化的JAK2通過磷酸化激活STAT3，磷酸化STAT3易位并進入細胞核導致幾個基因的轉錄增強，如上皮間質轉化相關基因、c-myc、基質金屬蛋白酶2和p53。在CRC中，JAK-STAT信號通路可以增強癌細胞的侵襲、遷移、生長和化學藥物治療耐藥性，同時調節細胞進程、細胞凋亡和細胞周期進程[40]。
近3年研究較多的與JAK-STAT信號通路有關的miRNA主要有miR-198、miR-452、miR-128-3p及miR-495。miR-198在CRC細胞系中的表達顯著降低，它阻斷CRC細胞中的JAK-STAT信號通路來抑制細胞增殖[41]；miR-452在CRC細胞系中的過表達顯著降低了JAK1、STAT1和STAT3的表達[42]；miR-128-3p的高表達與CRC患者的神經周圍浸潤、淋巴血管浸潤、腫瘤分期和CA19-9含量顯著相關，它可以激活JAK-STAT3信號，從而導致上皮間質轉化[33]；JAK2-STAT3信號通路的激活還受miR-495的調控[43]。
2.7 miRNA在Notch信號通路中的作用
Notch通路是負責直接細胞間相互作用的高度保守的細胞通路之一。Notch通路的正常功能對于正常細胞發育、分化、增殖和凋亡至關重要。Notch信號通路有4種受體Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4 以及5種配體Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1、Delta-like-3和Delta-like-4。Notch受體是包含兩種類型的細胞外和細胞內結構域的跨膜蛋白。Notch配體是Delta-Serrate-Lag2（DSL）家族的單通道跨膜蛋白，含有表皮細胞生長因子樣重復序列。當Notch配體與靶細胞的Notch受體結合時，通過激活γ-分泌酶蛋白復合物并切割Notch受體，將啟動Notch信號激活[29]。
近3年研究較多的與Notch信號通路有關的miRNA主要有miR-223、miR-10b及miR-449a。miR-223可以通過Notch信號通路增強CRC細胞的增殖并阻止其凋亡[44]；miR-10b可以靶向結合Notch信號通路受體進而調節Notch信號通路[45]；Notch-1是miR-449a的靶mRNA，增強其表達可以抑制CRC細胞增殖[46]。
2.8 miRNA在Hippo信號通路中的作用
Hippo信號通路是調節干細胞增殖、形態、存活、遷移、自我更新、遷移、組織穩態和器官大小的重要信號通路。Hippo信號通路被認為是腫瘤形成中最重要的信號通路之一，因為它通過該通路的多個成分抑制腫瘤的發展，包括大腫瘤抑制激酶、巨噬細胞刺激 （macrophage stimulating，MST）、Taffazin（TAZ）激酶、Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）和轉錄增強相關結構域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）。Hippo負調控其主要效應子YAP1和TAZ激酶，它們作為轉錄共激活因子誘導基因表達，不僅參與組織修復和增殖，而且是參與腫瘤進展的癌蛋白。由脂肪酸轉運蛋白家族的跨膜蛋白增加的MST上調大腫瘤抑制激酶使YAP磷酸化，從而阻止YAP從細胞質轉移到細胞核，減弱了YAP/TAZ復合物與TEAD相互作用的能力，導致β-catenin、K-ras、Akt/mTOR等癌基因在CRC的發生和發展過程中失活。在CRC中，Hippo信號通路受到抑制，YAP表達增加，從而誘導結腸癌細胞的遷移、侵襲、增殖和上皮間質轉化[8, 47]。
近3年研究較多的與Hippo信號通路有關的miRNA主要有miR-30a-5p、miR-375和miR-9。CRC組織和細胞中miR-30a-5p的表達下調伴隨著Hippo信號通路的失活，可以促進CRC細胞的活力、侵襲和遷移[48]；miR-375下調YAP1，導致Hippo-YAP1信號通路下游基因結締組織生長因子、cyclin D1和含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復蛋白5的表達降低[49]；miR-9影響Hippo信號通路抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[50]。
2.9 miRNA在Hedgehog信號通路中的作用
Hedgehog信號通路參與多種細胞功能包括細胞生長、增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲。Hedgehog信號通路由3種配體（聲波Hedgehog、印度Hedgehog和沙漠Hedgehog）和2種跨膜受體Patched（Ptch）和Smoothened（Smo）組成。正常情況下Ptch蛋白能夠抑制Smo蛋白活性，聲波Hedgehog與Ptch結合后可以解除Ptch介導的Smo抑制，從而激活下游的信號通路，導致膠質瘤相關癌基因同源物1和2從細胞質移位到細胞核，調節靶基因的轉錄[8, 51]。
近3年研究較多的與Hedgehog信號通路有關的miRNA主要有miR-372和miR-373。miR-372和miR-373在CRC組織中表達水平升高，二者可以上調CRC細胞中Hedgehog信號通路[39]。
3 miRNA與CRC的早期診斷
CRC仍缺乏有效診斷和預后生物標志物，確診時間早晚對患者生存影響大。研究[52]表明，Ⅰ期CRC的生存率為93%，而Ⅳ期CRC的生存率降至8%。目前，結腸鏡檢查是診斷CRC的金標準，但具有侵入和繁瑣缺點。此外，糞便潛血試驗也是CRC常用的診斷方法之一，但靈敏度和特異度較低[53]。miRNA靈敏度和特異度較高，因此miRNA在CRC中是一種新的、有前景的生物標志物。
有研究者[54]通過組合let-7e-5p、miRNA-106a-5p、miRNA-28-3p及miRNA-542-5p構成預測工具，可區分CRC患者與健康人群，還可區分息肉和腺瘤。miR-19a-3p、miR-203-3p、miR-221-3p和let-7f-5p在CRC中表達量升高，可作為早期診斷的生物標志物[55]。miR-183、miR-20a、miR -21[52]、miR-216a-5p[56]、let-7c、let-7e、miR-34c和miR-133b[57]在CRC組織中表達升高，可以早期診斷CRC。近年來，關于血清外泌體miRNA在CRC診斷及預后中應用的研究越來越多[58]。4種血清外泌體miRNA（miR-15b、miR-16、miR-21和miR-31）可以區分健康人群與CRC患者，也可以區分腺瘤與CRC患者[53]。
4 總結與展望
miRNA調控幾乎所有與CRC相關的重要信號通路。在CRC的發展過程中這些通路并不是只存在一種信號通路的異常激活，且涉及多個信號通路的共同激活，它們互相交互作用，促進CRC的發生、發展和轉移。miRNA也不僅僅在某一種信號通路中發揮作用，如miR-21激活PI3K-Akt和NF-κB信號通路[38]；miR-128-3p過表達可以激活TGF-β和JAK-STAT3信號通路[33]；miR-335可使NF-κB和Wnt-β-catenin信號通路失活[59]；miR-3651的下調使CRC細胞中的PI3K-Akt和MAPK信號通路失活[23]；上調的miR-183-5p和miR-21-5p以及下調的miR-195-5p和miR-497-5p參與CRC中的 Wnt-β-catenin、MAPK、PI3K-Akt和TGF-β信號通路的調節[30]；miR-1246可調節Wnt-β-catenin、MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt和Notch2信號通路的活性[60]；miR-372和miR-373過表達使CRC細胞中Hedgehog信號通路被上調，而NF-κB和MAPK信號通路被顯著抑制[39]。因此，miRNA可以在多種信號通路中同時發揮作用，幾乎在CRC的所有階段都有作用，從起始到進展和轉移，這可能是CRC具有高度分子異質性的原因。隨著分子生物學的發展，越來越多的miRNA在CRC相關信號通路中的作用被發現，CRC相關信號通路的作用機制也會被逐漸闡明。筆者通過總結近3年miRNA在CRC相關信號通路的研究進展，希望可以為通過對miRNA的靶向干預提供新思路，同時希望miRNA作為腫瘤分子標志物來預測CRC細胞的增殖、遷移、侵襲及轉移過程，從而對CRC進行早期干預。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：魏念瑾整理文獻并撰寫文章；陳洪生和魏九峰指導論文撰寫；劉鑫完成文獻檢索和信息收集。
