引用本文： 林浩, 王朝樣, 張海寶, 巨家華, 俞永江. 微小RNA在胃癌干細胞干性調控及靶向治療中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(3): 358-363. doi: 10.7507/1007-9424.202209019 復制
胃癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，全球每年新發病例約93萬例，近70萬人死亡，其發病率和病死率分別位居所有惡性腫瘤的第4位和第2位[1]。胃鏡等臨床診斷技術的進步提高了胃癌患者的早期檢出率[2]。對于早期胃癌患者，手術切除有著良好的療效。然而，對于晚期患者，由于存在局部浸潤和遠處轉移，治療選擇仍然有限，手術切除效果不理想。進一步鑒定調控胃癌進展的關鍵分子可為晚期胃癌患者提供新的治療靶點[3]。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是能夠引起腫瘤生長并具有自我更新、多向分化能力的一類細胞亞群，可以分化成大量新的腫瘤細胞，與腫瘤的惡性生物學行為及不良預后有著重要的關系[4]。研究發現胃癌干細胞（gastric cancer stem cells，GCSCs）在胃癌疾病進展過程中扮演重要角色[5]。目前的研究已證實微小RNA（microRNA，miRNA）對GCSCs生物學行為的影響有重要意義，但這些miRNAs對GCSCs的相關調控機制和臨床用途仍未完全闡明。因此，更好地了解miRNA在GCSCs中的調控機制，將有助于為胃癌的臨床治療提供新的視角。本綜述旨在總結目前miRNA在GCSCs中的調控機制，以及總結基于干性相關基因靶向GCSCs抗腫瘤治療的措施。
1 miRNA概述
miRNA是一類高度保守的內源性、非編碼短鏈RNA，長度為18～24個核苷酸。通常miRNA與其靶mRNA的3′ -非翻譯區（3′ -untranslated region，3′ -UTR）互補靶點結合并相互作用，誘導沉默復合物的形成，引起mRNA的降解或翻譯抑制，從而參與一系列重要的細胞過程[6]。到目前為止，miRNA的異常表達已經在包括胃癌在內的多種惡性腫瘤中被發現，其既可以作為抑癌基因發揮作用，如miRNA-195[7]、miRNA-4521[8]、Hsa-miRNA-29c[9]等對胃癌的進展具有抑制作用；也可作為癌基因發揮作用，如miRNA-328-3p[10]、miRNA-135b[11]、miRNA-196a[12]等可以促進胃癌細胞的生長，提高其侵襲能力。諸多研究證實了miRNA潛在的致癌能力，包括靶向基因的降解，而這些基因與正常細胞內穩態的調節有關，如細胞增殖、細胞周期調節、分化、發育、血管生成、細胞凋亡等[13]。
miRNA在調節CSCs的自我更新能力、轉移、耐藥等方面也發揮著重要作用[14]。值得注意的是，miRNA可以調節與信號通路相關的基因及其產物的表達和功能，通過相關信號通路調節CSCs對環境和生物刺激的反應，在細胞的發生發展過程中起著核心作用。越來越多的研究結果表明，miRNA在確保信號通路的激活、功能發揮等方面起著非常重要的作用[15]。盡管人們在理解miRNA調控CSCs生物學中的作用方面取得了相當大的進展，但仍需進一步研究miRNA的作用機制和臨床用途。
2 GCSCs的鑒別與分離
根據CSCs相關理論，腫瘤是由大量異質和分化的癌細胞組成，而這些癌細胞是由少數具有不同增殖和分化能力的CSCs所驅動形成的[16]。CSCs的特點是表現出自我更新能力、高致瘤活性、放化療抗性以及通過細胞上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）遠處轉移的潛能，這使得它們成為與治療高度相關的特異性靶點[17]。在髓母細胞瘤和甲狀腺腫瘤中，CSCs代表腫瘤內的靜止細胞群，其特點是對藥物治療的耐藥性增加，并且能夠驅動腫瘤異質性、復發和轉移[18-19]。因此，針對CSCs的研究有助于解決腫瘤復發、轉移等臨床問題。然而，由于CSCs在實體瘤中的數量極少，因此CSCs的鑒別和分離對于探索其潛在機制和功能至關重要。
研究[20]發現，成球實驗是獲得CSCs的便捷方法，在添加了生長因子的無血清懸浮培養基中，CSCs可以形成球狀細胞并保持自我更新特性，而非CSCs則無法存活。因為球狀細胞具有干性特性，例如無限增殖、持續自我更新和CSCs相關基因表達上調。此外，GCSCs中還存在一些特定的分離表面標志物。例如，Takaishi等[21]在胃癌細胞系中發現了相當數量的CD44+ 細胞，當將這些細胞注射到嚴重免疫缺陷小鼠的胃和皮膚中時，在小鼠體內顯示出顯著的致瘤性；然而，只有大約5%的CD44+細胞最終被鑒定為GCSCs。因此，單個細胞表面標記很難檢測到所有具有GCSCs特征的細胞，仍然存在一些限制和爭議。一些研究也證實了結合幾種分子作為細胞表面標志物來提高特異性識別和分離GCSCs的能力。例如，CD44+/CD24+[22]、CD133+/CD166+[23]等組合可作為鑒別GCSCs的潛在標志物。CD44不僅可作為鑒別GCSCs的特征性識別靶點，最新的研究還發現CD45–CD44+CD54+ 細胞亞群的數量與腫瘤進展有相關性，可能有助于判斷胃癌的分期[24]。除了通過細胞表面標志物分離CSCs外，研究還發現三維腫瘤培養體系可以模擬腫瘤微環境，從而有效地分離CSCs；最新的研究也開始使用這種三維培養體系來分離和培養GCSCs[25-26]。
3 miRNA在GCSCs干性調控中的作用
3.1 miRNA對GCSCs干性調控的雙向性
越來越多的研究表明，miRNA可以通過各種靶基因調控GCSCs的干性特征[15]。根據miRNA調控腫瘤發生和發展的作用方式不同，miRNA對胃癌的進展可表現為促進或抑制的雙向作用。發揮抑癌基因的作用方面，Hui等[27]研究發現，miRNA-363-3p作為長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding ribonucleic acid，lncRNA）FEZ家族鋅指1反義RNA1（FEZ family zinc finger 1 antisense RNA 1，FEZF1-AS1）的靶標，因為miRNA-363-3p在GCSCs中的表達被FEZF1-AS1抑制，FEZF1-AS1還可以通過海綿miRNA-363-3p增加高遷移率組AT-hook2（high-mobility group AT-hook 2，HMGA2）的表達；而沉默lncRNA FEZF1-AS1會影響GCSCs的干性特征，并通過miRNA-363-3p介導下調HMGA2，從而抑制GCSCs的體內致瘤能力。此外，還發現miRNA-375可通過miRNA-375/SLC7A11調節軸觸發鐵死亡，這表明miRNA-375對胃癌干性特征的抑制至關重要[28]。發揮癌基因作用方面，Wu等[29]發現上調miRNA-483-5p可誘導β-catenin及其下游靶分子（包括細胞周期蛋白D1、B淋巴細胞瘤-2和基質金屬蛋白酶2）的蛋白表達水平升高，表明miRNA-483-5p通過激活Wnt/β-catenin信號通路調節GCSCs的生長、侵襲和自我更新，從而促進胃癌的進展。Sun等[30]研究發現，應用miRNA-3619-5p模擬物恢復胃癌細胞中的小核仁RNA宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）表達水平后，八聚體結合轉錄因子4、性別決定相關基因簇-2和CD44的表達水平在SNHG3過表達后顯著增加，這些結果表明，miRNA-3619-5p作為調節軸關鍵因子促進胃癌細胞的干性特征。總之，在大多數情況下，miRNA可通過以上兩種方式共同調控GCSCs的干性特征，從而在胃癌發生發展中具有重要意義。
3.2 miRNA與GCSCs相關信號通路
GCSCs穩態的維持依賴于多條信號通路調控，它們的調控異常可能是GCSCs自我更新失衡的主要原因[31]。如Notch、轉化生長因子-β1（trans- forming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad、Wnt/β-catenin等信號通路，特定的miRNA通過靶向關鍵基因，從而參與干性調控的相關信號通路。Xin等[32]研究表明，通過使用甲基化特異性PCR發現，miRNA-7-5p在GCSCs中顯著下調是由于啟動子區域中DNA 甲基化增加所致，而過表達miRNA-7-5p通過靶向平滑受體蛋白和發狀分裂相關增強子1，以及隨后在體外抑制Notch和Hedgehog信號通路來減少集落的形成并降低GCSCs的侵襲能力。在體外通過TGF-β1誘導胃癌細胞中的TGF-β信號通路后，觀察到miRNA-200a的下調，而EMT相關轉錄因子E盒結合鋅指蛋白1和鋅指轉錄因子則上調，從而獲得了CSCs的侵襲和轉移特性[33]。除了Notch和TGF-β信號通路外，還發現miRNA的異常表達與Wnt信號通路有關。Song等[34]發現在球狀胃癌細胞中溴結構域蛋白4過表達，并通過啟動子區域的甲基化來下調miRNA-216a-3p的表達，通過轉染miRNA-216a-3p可下調CSCs相關Wnt信號通路的直接靶標Wnt3a的表達。
除了上述信號通路之外，還發現與其他通路相關的miRNA。例如，觀察到miRNA-26a在胃癌中表達下調，并通過下調同源盒基因C9（homeobox C9，HOXC9）來調節CSCs相關表面標志物CD44和上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的表達，從而提示HOXC9在體外可以促進胃癌細胞的CSCs表型，由此可發現miRNA-26a的低表達促進了GCSCs的自我更新能力和侵襲能力[35]。最近的研究還發現了miRNA在Hippo途徑調控中的作用，Li等[36]報道，miRNA-93-5p通過使Hippo信號通路失活來促進胃癌細胞的進展。而Du等[37]通過生物信息學預測并在胃癌組織和細胞系實驗中證實miRNA-95在胃癌中高表達，其通過負向調控雙特異性磷酸酶5（dual specificity phosphatase 5，DUSP5）激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，并觀察到CSCs表面標志物（CD133、CD44、乙醛脫氫酶1和富含亮氨酸重復單位的G蛋白耦聯受體5）水平提高。因此，miRNA-95通過DUSP5依賴性MAPK通路調控胃癌進展。
3.3 miRNA與GCSCs轉移和耐藥
目前胃癌治療的局限主要是由于其復發轉移和對治療的抵抗，而CSCs的干性特征是導致晚期胃癌患者的不良預后的關鍵因素。研究[38-39]發現miRNA可以維持CSCs的EMT特性，而獲得EMT表型的CSCs不僅可以促進腫瘤侵襲轉移，還可以對化療藥物具有抵抗性。Xiao等[40]研究表明，miRNA-711在胃癌中低表達，上調miRNA-711的表達水平抑制了胃癌細胞的侵襲轉移及EMT的發生；進一步研究發現，miRNA-711介導的CD44表達下調是通過下調波形蛋白表達和上調E-鈣黏蛋白表達實現的，在體內外抑制胃癌細胞的EMT。Pan等[41]通過miRNA微陣列分析顯示，在CD44+ 細胞中miRNA-196a-5p的表達顯著高于CD44– 細胞，miRNA-196a-5p可通過靶向mRNA的3′ -UTR來調控胃癌組織中Smad4的表達，在GCSCs的EMT和轉移侵襲中起到關鍵作用。此外，Zhang等[42]的研究結果表明，miRNA-345通過靶向表皮生長因子受體激酶底物8使Rac1信號失活，從而抑制細胞轉移、EMT和CSCs表型，在胃癌轉移中發揮抑制作用。
化療是繼手術和放療之后惡性腫瘤的主要治療方案，可用于治療晚期胃癌患者并延長生存時間。然而，化療耐藥通常會導致治療失敗及患者預后不良。miRNA可以調控GCSCs的化療藥物敏感性，與胃癌復發和轉移密切相關。Wu等[43]研究發現DNA甲基化轉移酶3B（DNA methyltransferase 3 beta，DNMT3B）作為CSCs的標志物，參與調控CSCs。miRNA-492過表達通過靶向DNMT3B的3′ -UTR、促進CSCs干性特征來刺激腫瘤轉移并誘導化療耐藥，而抑制miRNA-492則顯著增強胃癌細胞對順鉑化療的敏感性，并通過靶向DNMT3B抑制胃癌干性特征來抑制胃癌的轉移。Shen等[44]通過流式細胞分選技術分離出CD133+/CD44+ 胃癌細胞系MKN45作為 GCSCs進行研究，發現其具有高水平的一切順勢盒2（one cut homeobox 2，ONECUT2）和低水平的hsa-miRNA-15a-5p。進一步體內外實驗表明，hsa-miRNA-15a-5p通過靶向ONECUT2調控GCSCs的干性特征、EMT和化療敏感性。Zhan等[45]發現miRNA-98過表達可抑制干細胞相關基因的表達，抑制GCSCs的自我更新、侵襲轉移及致瘤能力；此外，還發現miRNA-98過表達增強了體外順鉑治療的敏感性；通過異種移植模型，還發現miRNA-98過度表達逆轉了紫杉醇對CD44+ GCSCs的耐藥性。研究還發現，miRNA還可通過調控細胞凋亡基因的表達導致CSCs耐藥現象的發生[46]。在CD44+ 的GCSCs中，miRNA-193a-3p的抑制增加了富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2的表達，并且還改變了多個凋亡基因的水平；抑制miRNA-193a-3p會降低細胞活性并增加凋亡細胞的數量。因此，miRNA-193a-3p可能通過調節線粒體凋亡途徑參與順鉑耐藥[47]。
最近的研究明確了miRNA在GCSCs中的干性調控機制，通過相關信號通路可以調節GCSCs自我更新或分化能力[15]。此外，miRNA還可通過EMT，在GCSCs的腫瘤轉移、侵襲、化療耐藥等方面起著關鍵的調控作用。miRNA對GCSCs的相關調控的研究可能有助于提高對胃癌的臨床治療效果，通過降低腫瘤轉移和復發、預測和逆轉腫瘤細胞耐藥有著重要的臨床意義。
4 miRNA在研發靶向GCSCs治療方法中的研究進展
胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，發現時已進展至中晚期，預后較差。雖然目前臨床療效有所提高，但患者的病死率并未得到有效降低[48]。研究證實，胃癌的治療進展主要集中于新的治療靶點的確定[3]。Wei等[49]通過一系列機器學習方法為胃癌開發了胃癌干細胞相關評分（GCSC-related score，GCScore），基于GCScore研究GCSCs的免疫學特征和潛在的免疫逃逸機制，提出GCScore可以作為預后和免疫治療反應的預測因子，確定高GCScore胃癌患者的4個潛在靶點（DARS2、SLC2A1、TPMT和ATPV1C1），為GCSCs的精準治療提供新策略。而miRNA作為重要的基因表達調控因子，除了在調節GCSCs干性特征中發揮著關鍵作用之外，通過上述諸多調控機制，其中一些miRNA在研發靶向GCSCs的治療方法中起著重要作用。因此，在腫瘤治療過程中通過沉默或過表達調節特定的miRNA是一個重要的探索途徑。
某些miRNA可促進GCSCs對化療藥物的耐藥性，通過沉默這些miRNA可以提高胃癌患者對治療的敏感性。例如，抑制GCSCs中miRNA-193-3p的表達會使CD44+ 的GCSCs對順鉑敏感性提高[47]。除了通過沉默某些可以促進GCSCs干性特征的miRNA以提高對化療藥物的敏感性外，在對化療藥物耐藥的GCSCs中還發現一些miRNA的表達下調，與沉默促進化療耐藥的miRNA治療相似，重新恢復這些被下調的miRNA的表達量能提高對治療的敏感度，可能也是一種有前景的治療方式。有研究[50]發現用miRNA模擬miR-876-3p治療可增強GCSCs對順鉑的敏感性。此外，中藥成分益氣補腎含藥血清可通過上調GCSCs中miRNA-139-5p的表達水平，作用其靶基因Notch1，通過調控miRNA-139-5p/Notch1/Jagged1信號通路發揮抗胃癌增殖轉移的作用[51]。一種miRNA-34模擬物MRX34被開發用于腫瘤治療，并進行了Ⅰ期臨床試驗。由于可能與miRNA-34模擬物傳遞載體相關的嚴重免疫反應，該試驗被終止，但對基于miRNA的表達靶向CSCs從而治療胃癌，仍然做出了重要貢獻[52-53]。
基于miRNA的療法，無論是恢復還是抑制miRNA的表達和活性，都具有很大的臨床應用前景。然而，將miRNA有效遞送至靶組織是miRNA治療向臨床過渡的主要挑戰。利用與抗體和（或）多肽結合的納米顆粒高效持續靶向釋放miRNA/抗miRNA，可以減少所需的治療劑量，同時將細胞毒性降至最低[54]。Liu等[55]通過凝膠刺激納米顆粒來共同遞送miRNA-200c和多西紫杉醇（docetaxel，DOC），比較miRNA-200c/DOC納米顆粒與DOC納米顆粒在移植瘤小鼠中的抗腫瘤作用，發現miRNA-200c/DOC納米顆粒表現出較高的miRNA-200c轉染效率，顯著上調miRNA-200c的表達，并在較長一段時間內降低β-微管蛋白Ⅲ的表達，顯著增強DOC的細胞毒性，從而產生協同的腫瘤抑制作用；miRNA-200c/DOC納米顆粒還通過下調CSCs表面標志物CD44的表達抑制GCSCs；此外，當將miRNA-200c/DOC納米顆粒治療后的殘余腫瘤再次移植到裸鼠體內時，腫瘤的生長速度明顯減慢。因此，miRNA-200c/DOC納米顆粒可能為miRNA和化療藥物的聯合運用提供一種很有前途的方式，同時抑制CSCs和非CSCs。最近的研究[56]還發現，miRNA-200c納米顆粒聯合放療對胃癌細胞具有協同抑制作用。可能的機制包括：通過納米顆粒將miRNA-200c穩定有效地遞送到胃癌細胞中以及通過抑制TGF-β1和CD44來逆轉EMT。因此，miRNA-200c納米顆粒聯合放療可能是治療胃癌的潛在策略。
5 小結與展望
GCSCs已被研究發現是胃癌治療的主要障礙，因為它們在腫瘤轉移、復發以及對治療的抵抗中發揮重要作用，制定能夠解決這一障礙的治療策略非常重要。在本篇綜述中，回顧了miRNA的異常表達對GCSCs干性特征的調控以及基于miRNA靶向GCSCs抗腫瘤治療的最新進展。更好地了解miRNA的分子機制及其參與GCSCs調控的基因靶點可以為GCSCs的靶向治療開辟新的策略。雖然用于介導傳遞miRNA的納米顆粒可用于模擬miRNA發揮其抑癌基因的作用，從而抑制GCSCs的干性特征，但基于miRNA藥物的安全性和有效性仍然是值得關注的問題，需要更多研究來優化miRNA由基礎實驗向臨床應用的轉化。因此，以miRNA為調控靶點預防及克服GCSCs轉移、耐藥等干性特征對改善胃癌的治療是值得探索研究的重要方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：林浩主要撰寫論文；王朝樣、張海寶、巨家華和俞永江對論文進行指導并修改。
胃癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，全球每年新發病例約93萬例，近70萬人死亡，其發病率和病死率分別位居所有惡性腫瘤的第4位和第2位[1]。胃鏡等臨床診斷技術的進步提高了胃癌患者的早期檢出率[2]。對于早期胃癌患者，手術切除有著良好的療效。然而，對于晚期患者，由于存在局部浸潤和遠處轉移，治療選擇仍然有限，手術切除效果不理想。進一步鑒定調控胃癌進展的關鍵分子可為晚期胃癌患者提供新的治療靶點[3]。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是能夠引起腫瘤生長并具有自我更新、多向分化能力的一類細胞亞群，可以分化成大量新的腫瘤細胞，與腫瘤的惡性生物學行為及不良預后有著重要的關系[4]。研究發現胃癌干細胞（gastric cancer stem cells，GCSCs）在胃癌疾病進展過程中扮演重要角色[5]。目前的研究已證實微小RNA（microRNA，miRNA）對GCSCs生物學行為的影響有重要意義，但這些miRNAs對GCSCs的相關調控機制和臨床用途仍未完全闡明。因此，更好地了解miRNA在GCSCs中的調控機制，將有助于為胃癌的臨床治療提供新的視角。本綜述旨在總結目前miRNA在GCSCs中的調控機制，以及總結基于干性相關基因靶向GCSCs抗腫瘤治療的措施。
1 miRNA概述
miRNA是一類高度保守的內源性、非編碼短鏈RNA，長度為18～24個核苷酸。通常miRNA與其靶mRNA的3′ -非翻譯區（3′ -untranslated region，3′ -UTR）互補靶點結合并相互作用，誘導沉默復合物的形成，引起mRNA的降解或翻譯抑制，從而參與一系列重要的細胞過程[6]。到目前為止，miRNA的異常表達已經在包括胃癌在內的多種惡性腫瘤中被發現，其既可以作為抑癌基因發揮作用，如miRNA-195[7]、miRNA-4521[8]、Hsa-miRNA-29c[9]等對胃癌的進展具有抑制作用；也可作為癌基因發揮作用，如miRNA-328-3p[10]、miRNA-135b[11]、miRNA-196a[12]等可以促進胃癌細胞的生長，提高其侵襲能力。諸多研究證實了miRNA潛在的致癌能力，包括靶向基因的降解，而這些基因與正常細胞內穩態的調節有關，如細胞增殖、細胞周期調節、分化、發育、血管生成、細胞凋亡等[13]。
miRNA在調節CSCs的自我更新能力、轉移、耐藥等方面也發揮著重要作用[14]。值得注意的是，miRNA可以調節與信號通路相關的基因及其產物的表達和功能，通過相關信號通路調節CSCs對環境和生物刺激的反應，在細胞的發生發展過程中起著核心作用。越來越多的研究結果表明，miRNA在確保信號通路的激活、功能發揮等方面起著非常重要的作用[15]。盡管人們在理解miRNA調控CSCs生物學中的作用方面取得了相當大的進展，但仍需進一步研究miRNA的作用機制和臨床用途。
2 GCSCs的鑒別與分離
根據CSCs相關理論，腫瘤是由大量異質和分化的癌細胞組成，而這些癌細胞是由少數具有不同增殖和分化能力的CSCs所驅動形成的[16]。CSCs的特點是表現出自我更新能力、高致瘤活性、放化療抗性以及通過細胞上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）遠處轉移的潛能，這使得它們成為與治療高度相關的特異性靶點[17]。在髓母細胞瘤和甲狀腺腫瘤中，CSCs代表腫瘤內的靜止細胞群，其特點是對藥物治療的耐藥性增加，并且能夠驅動腫瘤異質性、復發和轉移[18-19]。因此，針對CSCs的研究有助于解決腫瘤復發、轉移等臨床問題。然而，由于CSCs在實體瘤中的數量極少，因此CSCs的鑒別和分離對于探索其潛在機制和功能至關重要。
研究[20]發現，成球實驗是獲得CSCs的便捷方法，在添加了生長因子的無血清懸浮培養基中，CSCs可以形成球狀細胞并保持自我更新特性，而非CSCs則無法存活。因為球狀細胞具有干性特性，例如無限增殖、持續自我更新和CSCs相關基因表達上調。此外，GCSCs中還存在一些特定的分離表面標志物。例如，Takaishi等[21]在胃癌細胞系中發現了相當數量的CD44+ 細胞，當將這些細胞注射到嚴重免疫缺陷小鼠的胃和皮膚中時，在小鼠體內顯示出顯著的致瘤性；然而，只有大約5%的CD44+細胞最終被鑒定為GCSCs。因此，單個細胞表面標記很難檢測到所有具有GCSCs特征的細胞，仍然存在一些限制和爭議。一些研究也證實了結合幾種分子作為細胞表面標志物來提高特異性識別和分離GCSCs的能力。例如，CD44+/CD24+[22]、CD133+/CD166+[23]等組合可作為鑒別GCSCs的潛在標志物。CD44不僅可作為鑒別GCSCs的特征性識別靶點，最新的研究還發現CD45–CD44+CD54+ 細胞亞群的數量與腫瘤進展有相關性，可能有助于判斷胃癌的分期[24]。除了通過細胞表面標志物分離CSCs外，研究還發現三維腫瘤培養體系可以模擬腫瘤微環境，從而有效地分離CSCs；最新的研究也開始使用這種三維培養體系來分離和培養GCSCs[25-26]。
3 miRNA在GCSCs干性調控中的作用
3.1 miRNA對GCSCs干性調控的雙向性
越來越多的研究表明，miRNA可以通過各種靶基因調控GCSCs的干性特征[15]。根據miRNA調控腫瘤發生和發展的作用方式不同，miRNA對胃癌的進展可表現為促進或抑制的雙向作用。發揮抑癌基因的作用方面，Hui等[27]研究發現，miRNA-363-3p作為長鏈非編碼核糖核酸（long noncoding ribonucleic acid，lncRNA）FEZ家族鋅指1反義RNA1（FEZ family zinc finger 1 antisense RNA 1，FEZF1-AS1）的靶標，因為miRNA-363-3p在GCSCs中的表達被FEZF1-AS1抑制，FEZF1-AS1還可以通過海綿miRNA-363-3p增加高遷移率組AT-hook2（high-mobility group AT-hook 2，HMGA2）的表達；而沉默lncRNA FEZF1-AS1會影響GCSCs的干性特征，并通過miRNA-363-3p介導下調HMGA2，從而抑制GCSCs的體內致瘤能力。此外，還發現miRNA-375可通過miRNA-375/SLC7A11調節軸觸發鐵死亡，這表明miRNA-375對胃癌干性特征的抑制至關重要[28]。發揮癌基因作用方面，Wu等[29]發現上調miRNA-483-5p可誘導β-catenin及其下游靶分子（包括細胞周期蛋白D1、B淋巴細胞瘤-2和基質金屬蛋白酶2）的蛋白表達水平升高，表明miRNA-483-5p通過激活Wnt/β-catenin信號通路調節GCSCs的生長、侵襲和自我更新，從而促進胃癌的進展。Sun等[30]研究發現，應用miRNA-3619-5p模擬物恢復胃癌細胞中的小核仁RNA宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）表達水平后，八聚體結合轉錄因子4、性別決定相關基因簇-2和CD44的表達水平在SNHG3過表達后顯著增加，這些結果表明，miRNA-3619-5p作為調節軸關鍵因子促進胃癌細胞的干性特征。總之，在大多數情況下，miRNA可通過以上兩種方式共同調控GCSCs的干性特征，從而在胃癌發生發展中具有重要意義。
3.2 miRNA與GCSCs相關信號通路
GCSCs穩態的維持依賴于多條信號通路調控，它們的調控異常可能是GCSCs自我更新失衡的主要原因[31]。如Notch、轉化生長因子-β1（trans- forming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad、Wnt/β-catenin等信號通路，特定的miRNA通過靶向關鍵基因，從而參與干性調控的相關信號通路。Xin等[32]研究表明，通過使用甲基化特異性PCR發現，miRNA-7-5p在GCSCs中顯著下調是由于啟動子區域中DNA 甲基化增加所致，而過表達miRNA-7-5p通過靶向平滑受體蛋白和發狀分裂相關增強子1，以及隨后在體外抑制Notch和Hedgehog信號通路來減少集落的形成并降低GCSCs的侵襲能力。在體外通過TGF-β1誘導胃癌細胞中的TGF-β信號通路后，觀察到miRNA-200a的下調，而EMT相關轉錄因子E盒結合鋅指蛋白1和鋅指轉錄因子則上調，從而獲得了CSCs的侵襲和轉移特性[33]。除了Notch和TGF-β信號通路外，還發現miRNA的異常表達與Wnt信號通路有關。Song等[34]發現在球狀胃癌細胞中溴結構域蛋白4過表達，并通過啟動子區域的甲基化來下調miRNA-216a-3p的表達，通過轉染miRNA-216a-3p可下調CSCs相關Wnt信號通路的直接靶標Wnt3a的表達。
除了上述信號通路之外，還發現與其他通路相關的miRNA。例如，觀察到miRNA-26a在胃癌中表達下調，并通過下調同源盒基因C9（homeobox C9，HOXC9）來調節CSCs相關表面標志物CD44和上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的表達，從而提示HOXC9在體外可以促進胃癌細胞的CSCs表型，由此可發現miRNA-26a的低表達促進了GCSCs的自我更新能力和侵襲能力[35]。最近的研究還發現了miRNA在Hippo途徑調控中的作用，Li等[36]報道，miRNA-93-5p通過使Hippo信號通路失活來促進胃癌細胞的進展。而Du等[37]通過生物信息學預測并在胃癌組織和細胞系實驗中證實miRNA-95在胃癌中高表達，其通過負向調控雙特異性磷酸酶5（dual specificity phosphatase 5，DUSP5）激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，并觀察到CSCs表面標志物（CD133、CD44、乙醛脫氫酶1和富含亮氨酸重復單位的G蛋白耦聯受體5）水平提高。因此，miRNA-95通過DUSP5依賴性MAPK通路調控胃癌進展。
3.3 miRNA與GCSCs轉移和耐藥
目前胃癌治療的局限主要是由于其復發轉移和對治療的抵抗，而CSCs的干性特征是導致晚期胃癌患者的不良預后的關鍵因素。研究[38-39]發現miRNA可以維持CSCs的EMT特性，而獲得EMT表型的CSCs不僅可以促進腫瘤侵襲轉移，還可以對化療藥物具有抵抗性。Xiao等[40]研究表明，miRNA-711在胃癌中低表達，上調miRNA-711的表達水平抑制了胃癌細胞的侵襲轉移及EMT的發生；進一步研究發現，miRNA-711介導的CD44表達下調是通過下調波形蛋白表達和上調E-鈣黏蛋白表達實現的，在體內外抑制胃癌細胞的EMT。Pan等[41]通過miRNA微陣列分析顯示，在CD44+ 細胞中miRNA-196a-5p的表達顯著高于CD44– 細胞，miRNA-196a-5p可通過靶向mRNA的3′ -UTR來調控胃癌組織中Smad4的表達，在GCSCs的EMT和轉移侵襲中起到關鍵作用。此外，Zhang等[42]的研究結果表明，miRNA-345通過靶向表皮生長因子受體激酶底物8使Rac1信號失活，從而抑制細胞轉移、EMT和CSCs表型，在胃癌轉移中發揮抑制作用。
化療是繼手術和放療之后惡性腫瘤的主要治療方案，可用于治療晚期胃癌患者并延長生存時間。然而，化療耐藥通常會導致治療失敗及患者預后不良。miRNA可以調控GCSCs的化療藥物敏感性，與胃癌復發和轉移密切相關。Wu等[43]研究發現DNA甲基化轉移酶3B（DNA methyltransferase 3 beta，DNMT3B）作為CSCs的標志物，參與調控CSCs。miRNA-492過表達通過靶向DNMT3B的3′ -UTR、促進CSCs干性特征來刺激腫瘤轉移并誘導化療耐藥，而抑制miRNA-492則顯著增強胃癌細胞對順鉑化療的敏感性，并通過靶向DNMT3B抑制胃癌干性特征來抑制胃癌的轉移。Shen等[44]通過流式細胞分選技術分離出CD133+/CD44+ 胃癌細胞系MKN45作為 GCSCs進行研究，發現其具有高水平的一切順勢盒2（one cut homeobox 2，ONECUT2）和低水平的hsa-miRNA-15a-5p。進一步體內外實驗表明，hsa-miRNA-15a-5p通過靶向ONECUT2調控GCSCs的干性特征、EMT和化療敏感性。Zhan等[45]發現miRNA-98過表達可抑制干細胞相關基因的表達，抑制GCSCs的自我更新、侵襲轉移及致瘤能力；此外，還發現miRNA-98過表達增強了體外順鉑治療的敏感性；通過異種移植模型，還發現miRNA-98過度表達逆轉了紫杉醇對CD44+ GCSCs的耐藥性。研究還發現，miRNA還可通過調控細胞凋亡基因的表達導致CSCs耐藥現象的發生[46]。在CD44+ 的GCSCs中，miRNA-193a-3p的抑制增加了富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2的表達，并且還改變了多個凋亡基因的水平；抑制miRNA-193a-3p會降低細胞活性并增加凋亡細胞的數量。因此，miRNA-193a-3p可能通過調節線粒體凋亡途徑參與順鉑耐藥[47]。
最近的研究明確了miRNA在GCSCs中的干性調控機制，通過相關信號通路可以調節GCSCs自我更新或分化能力[15]。此外，miRNA還可通過EMT，在GCSCs的腫瘤轉移、侵襲、化療耐藥等方面起著關鍵的調控作用。miRNA對GCSCs的相關調控的研究可能有助于提高對胃癌的臨床治療效果，通過降低腫瘤轉移和復發、預測和逆轉腫瘤細胞耐藥有著重要的臨床意義。
4 miRNA在研發靶向GCSCs治療方法中的研究進展
胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，發現時已進展至中晚期，預后較差。雖然目前臨床療效有所提高，但患者的病死率并未得到有效降低[48]。研究證實，胃癌的治療進展主要集中于新的治療靶點的確定[3]。Wei等[49]通過一系列機器學習方法為胃癌開發了胃癌干細胞相關評分（GCSC-related score，GCScore），基于GCScore研究GCSCs的免疫學特征和潛在的免疫逃逸機制，提出GCScore可以作為預后和免疫治療反應的預測因子，確定高GCScore胃癌患者的4個潛在靶點（DARS2、SLC2A1、TPMT和ATPV1C1），為GCSCs的精準治療提供新策略。而miRNA作為重要的基因表達調控因子，除了在調節GCSCs干性特征中發揮著關鍵作用之外，通過上述諸多調控機制，其中一些miRNA在研發靶向GCSCs的治療方法中起著重要作用。因此，在腫瘤治療過程中通過沉默或過表達調節特定的miRNA是一個重要的探索途徑。
某些miRNA可促進GCSCs對化療藥物的耐藥性，通過沉默這些miRNA可以提高胃癌患者對治療的敏感性。例如，抑制GCSCs中miRNA-193-3p的表達會使CD44+ 的GCSCs對順鉑敏感性提高[47]。除了通過沉默某些可以促進GCSCs干性特征的miRNA以提高對化療藥物的敏感性外，在對化療藥物耐藥的GCSCs中還發現一些miRNA的表達下調，與沉默促進化療耐藥的miRNA治療相似，重新恢復這些被下調的miRNA的表達量能提高對治療的敏感度，可能也是一種有前景的治療方式。有研究[50]發現用miRNA模擬miR-876-3p治療可增強GCSCs對順鉑的敏感性。此外，中藥成分益氣補腎含藥血清可通過上調GCSCs中miRNA-139-5p的表達水平，作用其靶基因Notch1，通過調控miRNA-139-5p/Notch1/Jagged1信號通路發揮抗胃癌增殖轉移的作用[51]。一種miRNA-34模擬物MRX34被開發用于腫瘤治療，并進行了Ⅰ期臨床試驗。由于可能與miRNA-34模擬物傳遞載體相關的嚴重免疫反應，該試驗被終止，但對基于miRNA的表達靶向CSCs從而治療胃癌，仍然做出了重要貢獻[52-53]。
基于miRNA的療法，無論是恢復還是抑制miRNA的表達和活性，都具有很大的臨床應用前景。然而，將miRNA有效遞送至靶組織是miRNA治療向臨床過渡的主要挑戰。利用與抗體和（或）多肽結合的納米顆粒高效持續靶向釋放miRNA/抗miRNA，可以減少所需的治療劑量，同時將細胞毒性降至最低[54]。Liu等[55]通過凝膠刺激納米顆粒來共同遞送miRNA-200c和多西紫杉醇（docetaxel，DOC），比較miRNA-200c/DOC納米顆粒與DOC納米顆粒在移植瘤小鼠中的抗腫瘤作用，發現miRNA-200c/DOC納米顆粒表現出較高的miRNA-200c轉染效率，顯著上調miRNA-200c的表達，并在較長一段時間內降低β-微管蛋白Ⅲ的表達，顯著增強DOC的細胞毒性，從而產生協同的腫瘤抑制作用；miRNA-200c/DOC納米顆粒還通過下調CSCs表面標志物CD44的表達抑制GCSCs；此外，當將miRNA-200c/DOC納米顆粒治療后的殘余腫瘤再次移植到裸鼠體內時，腫瘤的生長速度明顯減慢。因此，miRNA-200c/DOC納米顆粒可能為miRNA和化療藥物的聯合運用提供一種很有前途的方式，同時抑制CSCs和非CSCs。最近的研究[56]還發現，miRNA-200c納米顆粒聯合放療對胃癌細胞具有協同抑制作用。可能的機制包括：通過納米顆粒將miRNA-200c穩定有效地遞送到胃癌細胞中以及通過抑制TGF-β1和CD44來逆轉EMT。因此，miRNA-200c納米顆粒聯合放療可能是治療胃癌的潛在策略。
5 小結與展望
GCSCs已被研究發現是胃癌治療的主要障礙，因為它們在腫瘤轉移、復發以及對治療的抵抗中發揮重要作用，制定能夠解決這一障礙的治療策略非常重要。在本篇綜述中，回顧了miRNA的異常表達對GCSCs干性特征的調控以及基于miRNA靶向GCSCs抗腫瘤治療的最新進展。更好地了解miRNA的分子機制及其參與GCSCs調控的基因靶點可以為GCSCs的靶向治療開辟新的策略。雖然用于介導傳遞miRNA的納米顆粒可用于模擬miRNA發揮其抑癌基因的作用，從而抑制GCSCs的干性特征，但基于miRNA藥物的安全性和有效性仍然是值得關注的問題，需要更多研究來優化miRNA由基礎實驗向臨床應用的轉化。因此，以miRNA為調控靶點預防及克服GCSCs轉移、耐藥等干性特征對改善胃癌的治療是值得探索研究的重要方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：林浩主要撰寫論文；王朝樣、張海寶、巨家華和俞永江對論文進行指導并修改。