引用本文： 姚豫桐, 賴春友, 馮天航, 尚進, 楊欽焱, 楊卯竹, 張雯, 黃孝倫. 同種異體胰島聯合自體外周血干細胞移植治療1型糖尿病：隨訪3年的臨床研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(9): 1189-1194. doi: 10.7507/1007-9424.202207011 復制
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由于胰島β細胞受損導致胰島素分泌絕對不足的一種T淋巴細胞引起的自身免疫性疾病。現有的外源性胰島素替代治療無法阻斷其對全身多器官的微血管損害，而且容易出現酮癥酸中毒、低血糖昏迷等嚴重并發癥[1]。胰島移植是目前最有可能治愈T1DM的有效方法。自2000年Edmonton方案提出以來，全球范圍已完成超過1 500例臨床胰島移植，其術后5年胰島素脫離率已超過50%，但其遠期療效仍不滿意[2-3]。近年來研究[4-5]表明，干細胞有為胰島細胞提供良好的定植及存活環境的優勢。基于此，四川省人民醫院（以下簡稱“我院” ）筆者所在研究團隊將其二者結合，即實施同種異體胰島聯合自體干細胞移植治療T1DM，術后已隨訪3年，現將3年的研究結果進行報道。
1 資料與方法
1.1 受者臨床資料
回顧性收集2017年1月至2019年12月期間我院實施的同種異體胰島細胞聯合（或不聯合）自體外周血干細胞移植受者的臨床病理資料。我院符合胰島移植條件的標準：① 18～65歲；② T1DM病史 >5年；③ 外源性胰島素強化治療仍不能控制血糖，有低血糖或酮癥酸中毒癥狀發作或伴有如視力模糊、腎功能損害、神經性疼痛、心血管病變等糖尿病并發癥。排除合并有腫瘤、感染（獲得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或細菌性）、門靜脈高壓癥等的T1DM受者。本研究聯合干細胞移植患者的選擇是在四川省醫學科學院·四川省人民醫院細胞生物治療臨床研究機構倫理委員會批準且經患者及家屬均簽署知情同意書同意后，采用簡單隨機化臨床分組法對患者采取聯合或不聯合干細胞移植治療。
1.2 自體外周血干細胞制備
每天于受者皮下注射粒細胞集落刺激因子5 μg/kg（共3～5 d），同時監測患者的血常規及肝腎功能。當白細胞計數 >20×109/L后行股靜脈插管，同時連接至血細胞分離機（費森尤斯，型號COM.TEC）采集患者干細胞。每次循環血量8 000～12 000 mL，采集外周血單個核細胞100～200 mL，全程采用ACD抗凝劑（A檸檬酸葡萄糖，Sigma公司，C3821）抗凝，全血與抗凝劑的比例為（9～11）∶1。取1 mL分離出來的外周血干細胞懸液，在流式細胞儀中檢測CD34+干細胞的數量。干細胞采集質量控制標準：① 采集干細胞數量 ≥1×106個/kg體質量；② 采集干細胞懸液樣本經涂片及細菌和真菌培養證實無細菌及真菌生長；③ 采集的干細胞懸液樣本破壞的紅細胞和血小板數量小于細胞總數的1%。經程序降溫冷凍儀于 –80 ℃深低溫凍存。
1.3 胰島細胞獲取
1.3.1 供體胰腺的獲取
供體為成人心臟死亡器官捐獻，采用標準的腹部多器官聯合快速切取技術獲取保留部分十二指腸及脾臟的胰腺，對供者的腹主動脈和門靜脈雙重灌注4 ℃的UW液（美國諾華公司）3 L，供體胰腺需在8 h內通過4 ℃轉運箱送至GMP級別胰島實驗室。
1.3.2 胰島的分離與純化
常規檢查胰腺，排除腫瘤。判斷胰腺的質地、脂肪含量、血液含量等。初步評估胰腺可用后，在無菌冰水浴方盤中修整胰腺，去除胰腺周圍的血管、結締組織和脂肪組織后稱重。在胰頭與胰頸交界處橫斷，分別經主胰管插管固定，在120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力下經主胰管注入Liberase酶液（德國SERVA公司）200 mL，使胰腺組織均勻膨脹，隨后置于Ricordi系統中37 ℃進行消化，再使用COBE2991型細胞分離機進行連續密度梯度離心、純化，收集純化的胰島，置于22 ℃含體積分數95%的CO2孵箱中培養并取樣標本進行質量和安全評估。
1.3.3 胰島的質量和安全評估
對胰島樣本的質量、安全性和細胞活性進行評估，符合程序后進入移植程序。具體方法：① 胰島計數及純度鑒定，采用雙硫腙染色方法統計不同直徑的胰島數量，計算胰島當量（islet equivalent quantity，IEQ）及純度；② 胰島細胞活性的鑒定，以雙醋酸熒光素/碘丙啶熒光染色，計數胰島活細胞百分比；③ 胰島功能的鑒定，以葡萄糖刺激試驗檢測胰島素刺激指數；④ 病原學檢查，取胰島懸液進行細菌革蘭染色、細菌培養、真菌培養、支原體檢測等；⑤ 采用動態濁度法檢測內毒素水平。通過上述5項檢測后等待移植。
1.4 胰島細胞和（或）外周血干細胞移植
選擇與供者ABO血型一致的受者接受胰島移植。從培養箱取出配制好的胰島細胞懸液，再次離心、清洗，加入胰島專用移植液（美國Sigma公司）200 mL并按照受者體質量加入肝素（35 U/kg）。超聲引導下經皮穿刺肝門靜脈主干置管，胰島細胞懸液以自然重力輸注，移植到受者肝臟內，控制在30～40 min內完成；同時連續監測門靜脈壓和血糖變化，受者門靜脈壓均在<15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）的正常范圍內。聯合自體外周血干細胞移植者在移植當天提前進行干細胞復蘇，移植前清洗含有二甲基亞砜的凍存液，配制成干細胞懸液。按照同樣辦法依次輸入配置好的干細胞懸液。
1.5 免疫抑制方案
所有受者均采用改良的Edmonton免疫抑制劑方案。① 免疫誘導治療方案：采用兔抗人T淋巴細胞免疫球蛋白100 mg（日本安斯泰來公司），術前30 min及術后第7 天時各靜脈注射1次。術前2 h內皮下注射依那西普（美國輝瑞制藥有限公司）50 mg，分別于術后第3、7、10天時每日皮下注射依那西普25 mg。② 免疫抑制方案：聯合應用他克莫司（1 mg/d）+嗎替麥考酚酯（1 g/d）。術后1個月時根據他克莫司血藥濃度調整劑量，將血他克莫司濃度控制在3～5 μg/L。根據血糖水平、血他克莫司濃度等因素綜合考慮嗎替麥考酚酯的用量。
1.6 移植術后管理及隨訪
1.6.1 術后管理
移植術后3 d內，予以抗生素、抗真菌、抑酸、降低門靜脈壓、防止門靜脈血栓形成等預防性用藥。每2～4 h監測血糖1次，根據監測的血糖變化使用長效胰島素1個月，嚴格使用胰島素將血糖水平控制在7.8 mmol/L以下，每天監測肝腎功能，移植術后第7天時行彩色多普勒超聲檢查肝臟和門靜脈系統，以排除門靜脈高壓及血栓。
1.6.2 術后隨訪
① 每周（根據手術日當天算，滿7 d時為1周）測空腹和餐后2 h C肽水平、血常規及肝和腎功能；② 每3個月（根據手術日當天算，滿90 d時為3個月）監測糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）濃度、胰島素抗體；③ 每周（根據手術日當天算，滿7 d時為1周）監測免疫抑制劑血藥濃度，當其穩定后每滿30 d測定1次，根據其結果調整免疫抑制劑用量；④ 每6個月（根據手術日當天算，每滿180 d）行24 h尿蛋白定量及眼底熒光血管造影檢查各1次。
2 結果
2.1 納入受者的基本情況
2017年1月至2019年12月期間我院完成同種異體胰島細胞移植10例，其中單獨同種異體胰島細胞移植（簡稱單獨組）受者5例，同種異體胰島細胞聯合自體外周血干細胞移植（簡稱聯合組）受者5例。2組受者的年齡、性別、體質量指數見表1。
表1
2組T1MD受者的基本情況
2.2 胰島的分離與純化結果
所有10例供胰均成功分離出胰島細胞（圖1），胰島計數42.5×104～55.0×104 IEQ、平均49.7×104 IEQ；胰島純度40.7%～65.0%、平均51.2%；胰島活性為95.0%～97.2%、平均96.6%；刺激指數為2.7～5.6、平均4.1。所有胰島細胞經細菌革蘭染色、細菌培養、真菌培養及支原體檢測均為陰性。
圖1
示修剪后的供體胰腺（a）及消化過程中顯微鏡下所見的胰島（b， ×400）
2.3 移植胰島和 （或） 干細胞數量及胰島素使用情況
2.3.1 移植胰島和 （或） 干細胞數量
10例受者的移植胰島數量見表2。移植胰島數量在單獨組為47.0×104～53.0×104 IEQ、（50.60±2.51）×104 IEQ，在聯合組為42.5×104～55.0×104 IEQ、（48.70±4.76）×104 IEQ。聯合組5例受者的自體干細胞移植數量見表2，干細胞移植數量5.6×107～12.8×107個、（9.2±2.6）×107 個。
表2
10例受者移植胰島和（或）干細胞數量及胰島素使用情況
2.3.2 胰島素使用情況
10例受者術后在正常飲食下嚴格控制血糖在7.8 mmol/L以下，其術前（圖表中以“0”表示）及術后36個月內不同時間點所需胰島素用量見表2和圖2a。從表2可見，單獨組和聯合組受者術后第12個月時分別均有3例撤除胰島素，至術后第36個月時單獨組和聯合組受者分別有2例和3例撤除胰島素。從圖2a可見，術后不同時間點的胰島素用量均較術前下降，2組的變化趨勢基本一致，在術后12個月內，聯合組胰島素用量呈現出低于單獨組的趨勢。
圖2
示單獨組和聯合組受者移植前后胰島素用量（a）、空腹及餐后2 h C肽水平（b）及HbA1c（c）變化情況
2.4 術后糖代謝情況
2.4.1 術后C肽水平的變化
術后36個月內10例患者的空腹和餐后2 h的C肽水平見表3及圖2b。術后36個月內，10例患者的C肽水平均為陽性（空腹或餐后2 h＞0.6 μg/L）。空腹及餐后2 h的C肽水平在術后不同時間點均較術前升高。① 空腹C肽水平，單獨組在術后第24個月時達最高、聯合組于術后第12個月時達最高，然后開始下降，且單獨組下降趨勢更明顯而聯合組下降趨勢更平穩且逐步上升。② 餐后2 h的C肽水平，2組均于術后第12個月時達最高，然后開始下降，單獨組下降趨勢更明顯而聯合組下降趨勢更平穩且逐步上升。
表3
10例受者手術前后不同時間點C肽水平及HbA1c結果
2.4.2 術后HbA1c的變化
術后36個月內10例受者的HbA1c見表3及圖2c。術后不同時間點均較術前下降，至術后第6個月后基本維持正常平穩水平，2組的變化趨勢基本一致。
2.5 糖尿病相關并發癥及手術相關并發癥情況
2.5.1 24 h尿蛋白
單獨組的病例2和4的24 h尿蛋白陽性，其定量結果分別為2.36 g和1.2 g，術后第36個月時分別下降至1.06 g和0.6 g。聯合組的病例8、9和10的24 h尿蛋白陽性，其定量結果分別為1.88 g、1.0 g及1.46 g，至術后第36個月時分別下降至0.5 g、<0.15 g及0.82 g。
2.5.2 眼底病變
單獨組的病例1、2和5術前存在眼底病變，其中病例1和病例5由術前的Ⅱ級在術后第36個月時好轉為Ⅰ級，病例2術前為Ⅳ級而在術后第36個月時無明顯變化。聯合組的病例8、9和10術前存在眼底病變，其中病例9由術前的Ⅰ級在術后第36個月時恢復正常，病例8由術前的Ⅳ級在術后第36個月時好轉為Ⅲ級，病例10由術前的Ⅱ級在術后第36個月時好轉為Ⅰ級。
2.5.3 手術相關并發癥
2組受者住院及隨訪期間通過彩色多普勒超聲檢查均未發現肝臟及門靜脈系統異常，肝和腎功能正常，未發生酮癥酸中毒、嚴重低血糖等癥狀，術后均未出現急性排斥反應、感染等移植相關并發癥。
3 討論
胰島移植是目前T1MD最理想的治療方法，但也面臨著供體器官嚴重短缺和遠期療效不滿意的挑戰[6]。最初的胰島移植受到自身皮質激素等原因的排斥反應，影響了其移植后胰島的存活及功能的穩定性。2000年Edmonton免疫抑制方案的提出使胰島移植短期療效顯著提高，其療效與安全性在多項臨床研究[3, 7]中得到了證實。隨后有臨床研究[8]發現，盡管Edmonton免疫抑制方案的安全性良好，但由于患者術后免疫功能的逐漸重建，其T細胞抑制效應受到影響，移植胰島的長期療效仍不滿意。因此，目前免疫抑制劑方案的應用仍面臨長期副作用及耐藥性的客觀屏障，為進一步提高移植胰島的長期有效性，需要探究更佳有效的治療方式[9]。
由于干細胞能分泌保護性因子，對機體免疫反應起調節作用，還有組織修復功能，能改善局部微環境、胰島再血管化、緩解移植胰島免疫反應等特點，有研究[10-11]結果顯示了其在糖尿病領域的臨床應用前景。有研究[12]證實了應用胰島與骨髓間充質干細胞聯合移植治療大鼠T1MD的遠期療效；此外，研究[13-15]還證實了胰島移植手術簡捷、創傷性小、安全且近期療效良好；改良Edmonton免疫抑制劑方案使得胰島移植后能更好地在體內定植，從而持續發揮胰島分泌功能，改善T1MD的血糖調節能力及遠期預后；并且由于自體外周血干細胞無免疫原性，安全性高，成本低，分化潛能高，可分泌促進細胞存活的生長因子，為胰島細胞移植提供良好的存活環境。因此，在本研究中采用同種異體胰島聯合自體外周血干細胞移植治療T1MD，術后采用改良Edmonton免疫抑制劑方案，胰島移植采用的心臟死亡器官捐獻供者胰腺，優化了胰島分離與純化及臨床精準移植方案，結果發現，與單獨組相比，聯合組的C肽水平在術后第12個月時即達到峰值，而單獨組患者于術后第24個月時才達到峰值，且術后第36個月時聯合組的C肽水平下降不明顯，而單獨組術后第36個月時仍呈逐漸下降趨勢，提示聯合組治療的患者胰島移植存活率和穩定性更佳；此外，聯合組和單獨組患者術后第12個月時均有3例患者胰島素撤除，而術后第36個月時聯合組胰島素撤除病例多于單獨組（分別為3例和2例），并且聯合干細胞移植并未增加明顯的免疫排斥反應及不良反應。
分析聯合干細胞移植體現出良好效果趨勢的原因，干細胞可能通過以下途徑協作改善移植胰島功能：① 干細胞能增強胰島β細胞的胰島素分泌功能。通過干細胞向胰島轉移線粒體，保證其能量代謝并加強其功能，同時干細胞分泌的細胞外基質成分同樣對胰島的生存和功能起到一定的影響[16]。② 干細胞可以促進胰島移植物再血管化。由于純化胰島時，破壞了胰島本身周圍的血管，影響了胰島在受體中的存活，而干細胞分泌的多種細胞因子能幫助胰島在10～14 d內在受體中重建血運，其通過Wnt信號通路調節血管內皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、血管生成素等加快胰島移植物的血運重建工作[17]。③ 干細胞具有較強的免疫調節作用，主要組織相容性復合體Ⅱ型分子不表達，而其Ⅰ型分子不表達或低表達，表明其免疫原性低，干細胞通過自分泌或旁分泌的方式，調節免疫細胞亞群，對固有免疫細胞群如使巨噬細胞和樹突狀細胞表型發生轉化，同時對調節性T細胞和輔助性T細胞在數量跟比例上進行影響，從而調節免疫應答水平[18]。④ 干細胞調控內質網應激。當氧化應激、高糖毒性和脂毒性對胰島移植物進行影響后，內質網功能會受到一定影響，從而導致移植物大量的死亡。目前干細胞減輕內質網應激機制尚不明確，但有研究[19-20]認為，干細胞主要通過兩方面降低內質網應激，一方面干細胞分泌基質細胞衍生因子調控內質網應激關鍵蛋白表達，另一方面是干細胞分泌微小RNA-21減輕胰島移植物的內質網應激。
總之，胰島移植及干細胞移植是近年來糖尿病領域較有研究前景的治療方式。目前有少量基礎研究及少量小樣本臨床研究證實了聯合干細胞移植可改善單獨胰島移植的遠期療效。本研究初步證實了此二者聯合治療T1MD的長期有效性及安全性，為未來糖尿病細胞治療方案的制定提供了新的臨床證據和理論基礎。但其具體機制、更遠期效果以及哪種情況下選擇均不明確，需要更多中心、大樣本及更長時間的臨床試驗研究來驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃孝倫、姚豫桐和賴春友負責供體胰腺摘除及細胞移植；楊欽焱、尚進和楊卯竹負責干細胞及胰島細胞分離采集；姚豫桐、尚進、賴春友和張雯負責數據收集；馮天航負責數據分析；姚豫桐和黃孝倫負責研究指導、論文撰寫及修改。
倫理聲明：本研究通過了四川省醫學科學院·四川省人民醫院細胞生物治療臨床研究機構倫理委員會審批 ［批文編號：（干細胞）倫審2018001］。
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由于胰島β細胞受損導致胰島素分泌絕對不足的一種T淋巴細胞引起的自身免疫性疾病。現有的外源性胰島素替代治療無法阻斷其對全身多器官的微血管損害，而且容易出現酮癥酸中毒、低血糖昏迷等嚴重并發癥[1]。胰島移植是目前最有可能治愈T1DM的有效方法。自2000年Edmonton方案提出以來，全球范圍已完成超過1 500例臨床胰島移植，其術后5年胰島素脫離率已超過50%，但其遠期療效仍不滿意[2-3]。近年來研究[4-5]表明，干細胞有為胰島細胞提供良好的定植及存活環境的優勢。基于此，四川省人民醫院（以下簡稱“我院” ）筆者所在研究團隊將其二者結合，即實施同種異體胰島聯合自體干細胞移植治療T1DM，術后已隨訪3年，現將3年的研究結果進行報道。
1 資料與方法
1.1 受者臨床資料
回顧性收集2017年1月至2019年12月期間我院實施的同種異體胰島細胞聯合（或不聯合）自體外周血干細胞移植受者的臨床病理資料。我院符合胰島移植條件的標準：① 18～65歲；② T1DM病史 >5年；③ 外源性胰島素強化治療仍不能控制血糖，有低血糖或酮癥酸中毒癥狀發作或伴有如視力模糊、腎功能損害、神經性疼痛、心血管病變等糖尿病并發癥。排除合并有腫瘤、感染（獲得性免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或細菌性）、門靜脈高壓癥等的T1DM受者。本研究聯合干細胞移植患者的選擇是在四川省醫學科學院·四川省人民醫院細胞生物治療臨床研究機構倫理委員會批準且經患者及家屬均簽署知情同意書同意后，采用簡單隨機化臨床分組法對患者采取聯合或不聯合干細胞移植治療。
1.2 自體外周血干細胞制備
每天于受者皮下注射粒細胞集落刺激因子5 μg/kg（共3～5 d），同時監測患者的血常規及肝腎功能。當白細胞計數 >20×109/L后行股靜脈插管，同時連接至血細胞分離機（費森尤斯，型號COM.TEC）采集患者干細胞。每次循環血量8 000～12 000 mL，采集外周血單個核細胞100～200 mL，全程采用ACD抗凝劑（A檸檬酸葡萄糖，Sigma公司，C3821）抗凝，全血與抗凝劑的比例為（9～11）∶1。取1 mL分離出來的外周血干細胞懸液，在流式細胞儀中檢測CD34+干細胞的數量。干細胞采集質量控制標準：① 采集干細胞數量 ≥1×106個/kg體質量；② 采集干細胞懸液樣本經涂片及細菌和真菌培養證實無細菌及真菌生長；③ 采集的干細胞懸液樣本破壞的紅細胞和血小板數量小于細胞總數的1%。經程序降溫冷凍儀于 –80 ℃深低溫凍存。
1.3 胰島細胞獲取
1.3.1 供體胰腺的獲取
供體為成人心臟死亡器官捐獻，采用標準的腹部多器官聯合快速切取技術獲取保留部分十二指腸及脾臟的胰腺，對供者的腹主動脈和門靜脈雙重灌注4 ℃的UW液（美國諾華公司）3 L，供體胰腺需在8 h內通過4 ℃轉運箱送至GMP級別胰島實驗室。
1.3.2 胰島的分離與純化
常規檢查胰腺，排除腫瘤。判斷胰腺的質地、脂肪含量、血液含量等。初步評估胰腺可用后，在無菌冰水浴方盤中修整胰腺，去除胰腺周圍的血管、結締組織和脂肪組織后稱重。在胰頭與胰頸交界處橫斷，分別經主胰管插管固定，在120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力下經主胰管注入Liberase酶液（德國SERVA公司）200 mL，使胰腺組織均勻膨脹，隨后置于Ricordi系統中37 ℃進行消化，再使用COBE2991型細胞分離機進行連續密度梯度離心、純化，收集純化的胰島，置于22 ℃含體積分數95%的CO2孵箱中培養并取樣標本進行質量和安全評估。
1.3.3 胰島的質量和安全評估
對胰島樣本的質量、安全性和細胞活性進行評估，符合程序后進入移植程序。具體方法：① 胰島計數及純度鑒定，采用雙硫腙染色方法統計不同直徑的胰島數量，計算胰島當量（islet equivalent quantity，IEQ）及純度；② 胰島細胞活性的鑒定，以雙醋酸熒光素/碘丙啶熒光染色，計數胰島活細胞百分比；③ 胰島功能的鑒定，以葡萄糖刺激試驗檢測胰島素刺激指數；④ 病原學檢查，取胰島懸液進行細菌革蘭染色、細菌培養、真菌培養、支原體檢測等；⑤ 采用動態濁度法檢測內毒素水平。通過上述5項檢測后等待移植。
1.4 胰島細胞和（或）外周血干細胞移植
選擇與供者ABO血型一致的受者接受胰島移植。從培養箱取出配制好的胰島細胞懸液，再次離心、清洗，加入胰島專用移植液（美國Sigma公司）200 mL并按照受者體質量加入肝素（35 U/kg）。超聲引導下經皮穿刺肝門靜脈主干置管，胰島細胞懸液以自然重力輸注，移植到受者肝臟內，控制在30～40 min內完成；同時連續監測門靜脈壓和血糖變化，受者門靜脈壓均在<15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）的正常范圍內。聯合自體外周血干細胞移植者在移植當天提前進行干細胞復蘇，移植前清洗含有二甲基亞砜的凍存液，配制成干細胞懸液。按照同樣辦法依次輸入配置好的干細胞懸液。
1.5 免疫抑制方案
所有受者均采用改良的Edmonton免疫抑制劑方案。① 免疫誘導治療方案：采用兔抗人T淋巴細胞免疫球蛋白100 mg（日本安斯泰來公司），術前30 min及術后第7 天時各靜脈注射1次。術前2 h內皮下注射依那西普（美國輝瑞制藥有限公司）50 mg，分別于術后第3、7、10天時每日皮下注射依那西普25 mg。② 免疫抑制方案：聯合應用他克莫司（1 mg/d）+嗎替麥考酚酯（1 g/d）。術后1個月時根據他克莫司血藥濃度調整劑量，將血他克莫司濃度控制在3～5 μg/L。根據血糖水平、血他克莫司濃度等因素綜合考慮嗎替麥考酚酯的用量。
1.6 移植術后管理及隨訪
1.6.1 術后管理
移植術后3 d內，予以抗生素、抗真菌、抑酸、降低門靜脈壓、防止門靜脈血栓形成等預防性用藥。每2～4 h監測血糖1次，根據監測的血糖變化使用長效胰島素1個月，嚴格使用胰島素將血糖水平控制在7.8 mmol/L以下，每天監測肝腎功能，移植術后第7天時行彩色多普勒超聲檢查肝臟和門靜脈系統，以排除門靜脈高壓及血栓。
1.6.2 術后隨訪
① 每周（根據手術日當天算，滿7 d時為1周）測空腹和餐后2 h C肽水平、血常規及肝和腎功能；② 每3個月（根據手術日當天算，滿90 d時為3個月）監測糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）濃度、胰島素抗體；③ 每周（根據手術日當天算，滿7 d時為1周）監測免疫抑制劑血藥濃度，當其穩定后每滿30 d測定1次，根據其結果調整免疫抑制劑用量；④ 每6個月（根據手術日當天算，每滿180 d）行24 h尿蛋白定量及眼底熒光血管造影檢查各1次。
2 結果
2.1 納入受者的基本情況
2017年1月至2019年12月期間我院完成同種異體胰島細胞移植10例，其中單獨同種異體胰島細胞移植（簡稱單獨組）受者5例，同種異體胰島細胞聯合自體外周血干細胞移植（簡稱聯合組）受者5例。2組受者的年齡、性別、體質量指數見表1。
表1
2組T1MD受者的基本情況
2.2 胰島的分離與純化結果
所有10例供胰均成功分離出胰島細胞（圖1），胰島計數42.5×104～55.0×104 IEQ、平均49.7×104 IEQ；胰島純度40.7%～65.0%、平均51.2%；胰島活性為95.0%～97.2%、平均96.6%；刺激指數為2.7～5.6、平均4.1。所有胰島細胞經細菌革蘭染色、細菌培養、真菌培養及支原體檢測均為陰性。
圖1
示修剪后的供體胰腺（a）及消化過程中顯微鏡下所見的胰島（b， ×400）
2.3 移植胰島和 （或） 干細胞數量及胰島素使用情況
2.3.1 移植胰島和 （或） 干細胞數量
10例受者的移植胰島數量見表2。移植胰島數量在單獨組為47.0×104～53.0×104 IEQ、（50.60±2.51）×104 IEQ，在聯合組為42.5×104～55.0×104 IEQ、（48.70±4.76）×104 IEQ。聯合組5例受者的自體干細胞移植數量見表2，干細胞移植數量5.6×107～12.8×107個、（9.2±2.6）×107 個。
表2
10例受者移植胰島和（或）干細胞數量及胰島素使用情況
2.3.2 胰島素使用情況
10例受者術后在正常飲食下嚴格控制血糖在7.8 mmol/L以下，其術前（圖表中以“0”表示）及術后36個月內不同時間點所需胰島素用量見表2和圖2a。從表2可見，單獨組和聯合組受者術后第12個月時分別均有3例撤除胰島素，至術后第36個月時單獨組和聯合組受者分別有2例和3例撤除胰島素。從圖2a可見，術后不同時間點的胰島素用量均較術前下降，2組的變化趨勢基本一致，在術后12個月內，聯合組胰島素用量呈現出低于單獨組的趨勢。
圖2
示單獨組和聯合組受者移植前后胰島素用量（a）、空腹及餐后2 h C肽水平（b）及HbA1c（c）變化情況
2.4 術后糖代謝情況
2.4.1 術后C肽水平的變化
術后36個月內10例患者的空腹和餐后2 h的C肽水平見表3及圖2b。術后36個月內，10例患者的C肽水平均為陽性（空腹或餐后2 h＞0.6 μg/L）。空腹及餐后2 h的C肽水平在術后不同時間點均較術前升高。① 空腹C肽水平，單獨組在術后第24個月時達最高、聯合組于術后第12個月時達最高，然后開始下降，且單獨組下降趨勢更明顯而聯合組下降趨勢更平穩且逐步上升。② 餐后2 h的C肽水平，2組均于術后第12個月時達最高，然后開始下降，單獨組下降趨勢更明顯而聯合組下降趨勢更平穩且逐步上升。
表3
10例受者手術前后不同時間點C肽水平及HbA1c結果
2.4.2 術后HbA1c的變化
術后36個月內10例受者的HbA1c見表3及圖2c。術后不同時間點均較術前下降，至術后第6個月后基本維持正常平穩水平，2組的變化趨勢基本一致。
2.5 糖尿病相關并發癥及手術相關并發癥情況
2.5.1 24 h尿蛋白
單獨組的病例2和4的24 h尿蛋白陽性，其定量結果分別為2.36 g和1.2 g，術后第36個月時分別下降至1.06 g和0.6 g。聯合組的病例8、9和10的24 h尿蛋白陽性，其定量結果分別為1.88 g、1.0 g及1.46 g，至術后第36個月時分別下降至0.5 g、<0.15 g及0.82 g。
2.5.2 眼底病變
單獨組的病例1、2和5術前存在眼底病變，其中病例1和病例5由術前的Ⅱ級在術后第36個月時好轉為Ⅰ級，病例2術前為Ⅳ級而在術后第36個月時無明顯變化。聯合組的病例8、9和10術前存在眼底病變，其中病例9由術前的Ⅰ級在術后第36個月時恢復正常，病例8由術前的Ⅳ級在術后第36個月時好轉為Ⅲ級，病例10由術前的Ⅱ級在術后第36個月時好轉為Ⅰ級。
2.5.3 手術相關并發癥
2組受者住院及隨訪期間通過彩色多普勒超聲檢查均未發現肝臟及門靜脈系統異常，肝和腎功能正常，未發生酮癥酸中毒、嚴重低血糖等癥狀，術后均未出現急性排斥反應、感染等移植相關并發癥。
3 討論
胰島移植是目前T1MD最理想的治療方法，但也面臨著供體器官嚴重短缺和遠期療效不滿意的挑戰[6]。最初的胰島移植受到自身皮質激素等原因的排斥反應，影響了其移植后胰島的存活及功能的穩定性。2000年Edmonton免疫抑制方案的提出使胰島移植短期療效顯著提高，其療效與安全性在多項臨床研究[3, 7]中得到了證實。隨后有臨床研究[8]發現，盡管Edmonton免疫抑制方案的安全性良好，但由于患者術后免疫功能的逐漸重建，其T細胞抑制效應受到影響，移植胰島的長期療效仍不滿意。因此，目前免疫抑制劑方案的應用仍面臨長期副作用及耐藥性的客觀屏障，為進一步提高移植胰島的長期有效性，需要探究更佳有效的治療方式[9]。
由于干細胞能分泌保護性因子，對機體免疫反應起調節作用，還有組織修復功能，能改善局部微環境、胰島再血管化、緩解移植胰島免疫反應等特點，有研究[10-11]結果顯示了其在糖尿病領域的臨床應用前景。有研究[12]證實了應用胰島與骨髓間充質干細胞聯合移植治療大鼠T1MD的遠期療效；此外，研究[13-15]還證實了胰島移植手術簡捷、創傷性小、安全且近期療效良好；改良Edmonton免疫抑制劑方案使得胰島移植后能更好地在體內定植，從而持續發揮胰島分泌功能，改善T1MD的血糖調節能力及遠期預后；并且由于自體外周血干細胞無免疫原性，安全性高，成本低，分化潛能高，可分泌促進細胞存活的生長因子，為胰島細胞移植提供良好的存活環境。因此，在本研究中采用同種異體胰島聯合自體外周血干細胞移植治療T1MD，術后采用改良Edmonton免疫抑制劑方案，胰島移植采用的心臟死亡器官捐獻供者胰腺，優化了胰島分離與純化及臨床精準移植方案，結果發現，與單獨組相比，聯合組的C肽水平在術后第12個月時即達到峰值，而單獨組患者于術后第24個月時才達到峰值，且術后第36個月時聯合組的C肽水平下降不明顯，而單獨組術后第36個月時仍呈逐漸下降趨勢，提示聯合組治療的患者胰島移植存活率和穩定性更佳；此外，聯合組和單獨組患者術后第12個月時均有3例患者胰島素撤除，而術后第36個月時聯合組胰島素撤除病例多于單獨組（分別為3例和2例），并且聯合干細胞移植并未增加明顯的免疫排斥反應及不良反應。
分析聯合干細胞移植體現出良好效果趨勢的原因，干細胞可能通過以下途徑協作改善移植胰島功能：① 干細胞能增強胰島β細胞的胰島素分泌功能。通過干細胞向胰島轉移線粒體，保證其能量代謝并加強其功能，同時干細胞分泌的細胞外基質成分同樣對胰島的生存和功能起到一定的影響[16]。② 干細胞可以促進胰島移植物再血管化。由于純化胰島時，破壞了胰島本身周圍的血管，影響了胰島在受體中的存活，而干細胞分泌的多種細胞因子能幫助胰島在10～14 d內在受體中重建血運，其通過Wnt信號通路調節血管內皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、血管生成素等加快胰島移植物的血運重建工作[17]。③ 干細胞具有較強的免疫調節作用，主要組織相容性復合體Ⅱ型分子不表達，而其Ⅰ型分子不表達或低表達，表明其免疫原性低，干細胞通過自分泌或旁分泌的方式，調節免疫細胞亞群，對固有免疫細胞群如使巨噬細胞和樹突狀細胞表型發生轉化，同時對調節性T細胞和輔助性T細胞在數量跟比例上進行影響，從而調節免疫應答水平[18]。④ 干細胞調控內質網應激。當氧化應激、高糖毒性和脂毒性對胰島移植物進行影響后，內質網功能會受到一定影響，從而導致移植物大量的死亡。目前干細胞減輕內質網應激機制尚不明確，但有研究[19-20]認為，干細胞主要通過兩方面降低內質網應激，一方面干細胞分泌基質細胞衍生因子調控內質網應激關鍵蛋白表達，另一方面是干細胞分泌微小RNA-21減輕胰島移植物的內質網應激。
總之，胰島移植及干細胞移植是近年來糖尿病領域較有研究前景的治療方式。目前有少量基礎研究及少量小樣本臨床研究證實了聯合干細胞移植可改善單獨胰島移植的遠期療效。本研究初步證實了此二者聯合治療T1MD的長期有效性及安全性，為未來糖尿病細胞治療方案的制定提供了新的臨床證據和理論基礎。但其具體機制、更遠期效果以及哪種情況下選擇均不明確，需要更多中心、大樣本及更長時間的臨床試驗研究來驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者間沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃孝倫、姚豫桐和賴春友負責供體胰腺摘除及細胞移植；楊欽焱、尚進和楊卯竹負責干細胞及胰島細胞分離采集；姚豫桐、尚進、賴春友和張雯負責數據收集；馮天航負責數據分析；姚豫桐和黃孝倫負責研究指導、論文撰寫及修改。
倫理聲明：本研究通過了四川省醫學科學院·四川省人民醫院細胞生物治療臨床研究機構倫理委員會審批 ［批文編號：（干細胞）倫審2018001］。
