引用本文： 王朝樣, 林浩, 張海寶, 巨家華, 俞永江. 腸道菌群對結直腸癌術后吻合口漏影響的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(11): 1522-1527. doi: 10.7507/1007-9424.202205030 復制
結直腸癌最佳的外科治療方法是根治性切除腫瘤并重建消化道。盡管外科醫生遵循個體化治療原則，術中盡量減少對組織的損傷并保證吻合口血供、降低吻合口張力和采用了恰當的吻合技術，但術后吻合口漏的發生仍不可忽視[1]，有文獻[2]報道其發生率為1%～19%。術后發生吻合口漏會增加住院費用和延長住院時間，影響其短期和長期預后，甚至提高病死率。近年來，研究者們[3-5]對結直腸癌根治術后吻合口漏發生的潛在危險因素進行了廣泛研究，并且認為吻合口漏的發生歸因于多種因素，如年齡≥60歲、男性、體質量指數≥25 kg/m2、吸煙、合并糖尿病等、術前使用非甾體類藥物、術前白蛋白＜35 g/L、術后白蛋白＜32 g/L、術前貧血、圍術期輸血（術中及術后2 d內）、新輔助放化療、術前口服抗生素腸道準備、美國麻醉醫師協會評分分級≥Ⅲ級、腫瘤TNM分期Ⅲ和Ⅴ期、吻合口距肛緣距離＜7 cm、吻合技術等，但其發病機制仍未完全明了。近來有研究[6]又發現，腸道菌群的組成和多樣性改變可能也與結直腸癌根治術后吻合口漏的發生有潛在的聯系。因此，筆者就近年來結直腸癌圍術期腸道菌群變化情況及其影響吻合口漏研究的相關文獻進行綜述，以了解其相互作用及其潛在的機制，為臨床管理結直腸癌手術患者及后續研究提供一定的參考。
1 腸道菌群情況
人類腸道含有超過百億的微生物，這些微生物共同構成了腸道微生物群如細菌、病毒、真菌、古生菌等，其通過與宿主的持續協同相互作用，在維持機體健康和誘導疾病發生中發揮著至關重要的作用，其中已有超過2 000多種細菌構成了腸道菌群。多數腸道菌群分屬于4種門類：厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門[7]。正常情況下，結直腸中的優勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，其可保護腸道上皮免受病原菌的入侵，同時可誘導并促進健康的免疫反應[8]。但有研究[9-11]表明，在結直腸癌患者的腸道菌群中，芽孢桿菌科（厚壁菌門）、葡萄球菌科（厚壁菌門）、梭桿菌屬（梭桿菌門）、另枝菌屬（擬桿菌門）、卟啉單胞菌屬（擬桿菌門）、阿克曼菌（疣微菌門）和脆弱擬桿菌（擬桿菌門）數量較多，而羅氏菌屬（放線菌門）、雙歧桿菌（放線菌門）、乳桿菌（厚壁菌門）、瘤胃球菌（厚壁菌門）、普拉梭菌（厚壁菌門）和密螺旋體（螺旋體屬）數量缺乏。此外，結直腸癌術后腸道菌群也會發生明顯變化，主要體現在：專性厭氧菌顯著減少，病原菌如腸桿菌科（變形菌門）、腸球菌（厚壁菌門）、葡萄球菌（厚壁菌門）和假單胞菌（變形菌門）數量增加，有機酸濃度也有顯著變化，如短鏈脂肪酸濃度顯著降低[12]，并且這種成分的變化幾乎是立刻發生，這種變化在Guyton等[13]的研究中得以證實，在結腸切除和吻合后的幾小時內，優勢菌門種類如擬桿菌門和厚壁菌門減少了90%，其中厚壁菌門中的糞腸球菌則增加了500倍；另外Shogan等[14]通過16S rRNA測序分析結腸切除大鼠模型中腸腔和黏膜的相關菌群變化亦發現，吻合口組織中腸球菌和埃希菌或志賀菌的相對豐度顯著增加（分別為500倍和200倍）。因此，通過對這些菌群變化情況的了解，有助于進一步闡明腸道菌群失調與結直腸癌術后吻合口漏之間的聯系。
2 腸道菌群與吻合口漏的關系
通常結直腸吻合完成后，宿主會立即啟動組織修復過程即吻合口愈合過程，該過程中的生理反應被分為3個連續和重疊的階段—炎癥、增殖和重塑[15]。在炎癥階段，會產生富含纖維蛋白或纖維連接蛋白的基質，任何潛在的入侵微生物將被清除；在增殖階段，成纖維細胞和肌成纖維細胞被巨噬細胞釋放的化學誘導劑所吸引，同時導致不同類型（Ⅰ～Ⅳ型）的膠原蛋白被沉積，從而增強愈合組織的強度；在重塑階段，Ⅲ型膠原蛋白被基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）分解，取而代之的是瘢痕組織中主要的Ⅰ型膠原蛋白，同時脈管系統得到重新排列[16]。
吻合口的最終愈合過程涉及腸上皮屏障的重建及腸道微環境的許多組成成分如宿主細胞（上皮細胞和固有層細胞）、微生物群以及胃腸道腔內的膳食和非膳食成分[16]。腸道菌群可通過不同細菌種類之間的競爭和（或）協作來促進或抑制吻合口的愈合。
2015年，Lee等[17]從結直腸癌患者術后發生吻合口漏的143例患者的腹腔液或引流液中分離出的病原體發現，從滲漏部位分離出來的最主要的病原菌是糞腸球菌，其次為銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等；另外，Komen等[18]通過定量逆轉錄-PCR評估了243例接受腸切除腸吻合術患者的腹腔引流液，發現發生吻合口漏患者的引流液中大腸桿菌和糞腸球菌濃度顯著增加，還提出了在術后第2天和第3天對引流液進行糞腸球菌定量逆轉錄-PCR檢測可能是一種簡單且低成本的吻合口漏篩查方法。
以上研究結果提示，厚壁菌門的糞腸球菌、變形菌門的銅綠假單胞菌和大腸桿菌可能與吻合口漏有關，其可能的原因是它們具有產生明膠酶的能力，因明膠酶是能夠降解膠原蛋白的一種基質水解酶，但還需要更多的臨床研究來驗證腸道菌群與吻合口漏的關系。
3 腸道菌群引發吻合口漏的可能機制
吻合口漏發生的一個潛在危險因素是宿主組織細胞外基質蛋白的降解。研究[19]證明，細胞外基質中的膠原蛋白降解酶在腸吻合口的早期愈合階段扮演重要的角色，它們的平衡調節很重要，可以在不危及新形成的膠原層完整性的情況下進行膠原重組。在結直腸中，某些腸道微生物有可能直接激活MMP的活性，引起膠原蛋白降解的失衡，從而影響吻合口的愈合[20]。
膠原蛋白水解酶（簡稱“膠原酶”）是一種關鍵的細菌外產物，可以降解對吻合口愈合至關重要的Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白。Olivas等[21]在大鼠模型中證明了銅綠假單胞菌可以被吻合口組織中存在的宿主因素激活以表達膠原酶，提示銅綠假單胞菌菌株可以改變其表型，不僅改變其在吻合口組織部位的抗生素耐藥性，而且可以在體內誘導表達組織降解膠原酶，從而導致吻合口漏發生。另外，糞腸球菌能夠產生明膠酶，它通過分解膠原蛋白和激活能夠降解膠原蛋白的MMP而促進吻合口漏的發生[22]，這一論點在Shogan等[23]的研究中得到證實。在Shogan等[23]的研究中，利用大鼠模型證實了糞腸球菌通過降解宿主腸道組織中的膠原蛋白和激活組織MMP-9導致了吻合口漏的發生；他們還對接受結腸術后患者的吻合口黏膜進行了細菌培養，在64個培養的菌株中發現只有銅綠假單胞菌和糞腸球菌顯示出了顯著的膠原蛋白降解活性和MMP-9裂解能力，進一步證實了這一結論。此外，Hyoju等[24]在結直腸手術動物模型中證明了黏質沙雷菌的膠原酶溶解菌株在吻合口漏的發病機制中也起關鍵作用和致病作用。2021年，一項臨床研究[25]顯示，74%的吻合口漏患者有產生膠原酶的細菌如糞腸球菌定植（P=0.022），并且抗生素耐藥菌在吻合口漏患者中更為常見（P=0.01）。另外，MMP的重要性及其在吻合口完整性中的作用通過一系列病例進一步表征，這些病例研究了給予MMP抑制劑（包括強力霉素）后腸吻合口的強度，結果發現，添加MMP抑制劑可改善術后吻合口的組織強度和組織完整性[26]。
綜上所述，在吻合口漏的發病機制中，膠原酶產生菌如糞腸球菌、銅綠假單胞菌和黏質沙雷菌起著關鍵作用和致病作用，提示了某些特定細菌通過細菌膠原酶的表達和宿主腸道MMP的過度激活導致膠原蛋白降解，從而在吻合口漏的發展中發揮作用。
4 圍術期干預對腸道菌群及術后吻合口漏的影響
4.1 圍術期干預措施對腸道菌群的影響
圍術期干預措施如禁食、機械性腸道準備和口服或靜脈注射抗生素通常會干擾腸道菌群，目前有證據[27]表明，腸道菌群在內臟手術圍術期發生了局部改變，尤其是在吻合口部位。目前對腸道菌群的結構或功能影響的了解甚少。隨著腸道取樣技術、測序技術和蛋白質產物（轉錄組學）分析技術的進步，擴展了表征腸道微生物群的能力，并且確定了腸道菌群可能影響吻合口的愈合，從而導致或預防吻合口漏。圍術期的干預有可能導致劇毒菌群如腸球菌、假單胞菌的大量繁殖，這些細菌能夠根據環境提示轉變為更具侵襲性和破壞組織的表型[23]。
4.1.1 機械性腸道準備對腸道菌群的影響
術前機械性腸道準備（口服導瀉藥來清除腸腔內糞便）在術前以多種方式改變了患者的腸道菌群，其有利亦有弊。① 一項評估術前機械性腸道準備對結直腸癌切除患者糞便菌群影響的隨機對照試驗[28]結果表明，術后雙歧桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、腸桿菌科和乳桿菌的數量顯著減少，而腸球菌和葡萄球菌的數量無明顯減少。② Gaines等[29]的研究結果顯示，在非肥胖患者中機械性腸道準備導致膠原酶產生細菌的抑制，而在肥胖患者中則不然，這可能解釋了肥胖患者吻合口漏發生率和癌復發風險更高的原因。③ 從黏膜層分泌的黏液是胃腸道吻合口愈合的必要因素，黏膜層的微生物群決定了腸道內上皮細胞和免疫細胞的功能，這兩種細胞是促進腸吻合口愈合的已知因素，黏液在其中起屏障作用，限制了腸腔細菌與腸上皮接觸以及隨之而來的有害影響。然而由于術前機械性腸道準備（以聚乙二醇為基礎的準備工作）是有效地清除了腸道黏液，腔外細菌未能沖洗，從而改變了微生物群平衡；此外， 在機械性腸道準備過程中將氧氣輸送至腸腔，從而對厭氧菌種群產生負面影響，而且還能減少用于細菌新陳代謝營養物質的可獲得性，這些因素都可以迅速改變腸道菌群的組成和動態平衡，從而影響腸道屏障的完整性[30]；同時手術也會導致手術部位的組織損傷和缺血，從而改變腸道黏液的產生。由于缺乏保護性黏液層以及正常保護性微生物群的上皮暴露，允許了病原體被黏附和遷移，因而會導致一些不良后果如吻合口漏[31]。
4.1.2 圍術期抗生素應用對腸道菌群的影響
目前標準的預防性抗生素方案具有廣譜性，因此無法選擇性地針對特定的病原體。在一項早期研究[32]中報道，口服阿莫西林5 d，腸道菌群的多樣性和豐度在第1天就顯著降低，其組成到第60天時部分恢復到約90%。關于靜脈注射抗生素，使用β-內酰胺類藥物（氨芐西林、頭孢唑林和舒巴坦）可導致治療結束后擬桿菌門減少和厚壁菌門增加[33]；β-內酰胺類和氟喹諾酮類藥物的應用導致微生物多樣性顯著減少，增加了擬桿菌門/厚壁菌門比例[34]。從上述研究中可以看出，圍術期抗生素應用，即使是短期使用也會導致對腸道菌群有害的現象持續數月，抗生素的非特異性抗菌作用導致腸道菌群失調，大大降低了微生物的多樣性，有利于條件致病菌的增加。
4.1.3 機械性腸道準備和抗生素聯合應用對腸道菌群的影響
聯合使用機械性腸道準備和抗生素，可能會導致腸道菌群發生有益的變化[35]。已有回顧性研究[36]證明，術前機械性腸道準備和抗生素聯合使用可顯著降低術后并發癥發生率，包括吻合口漏、腸梗阻和外科手術部位感染。Klinger等[37]分析了27 804例接受擇期結直腸切除術的患者，發現機械性腸道準備和口服抗生素聯合應用可顯著降低手術部位感染、器官間隙感染、傷口裂開和吻合口漏的發生率。另有一項臨床試驗[38]亦證實了機械性腸道準備和抗生素聯合使用可顯著降低結直腸癌術后患者的吻合口漏發生率。因此，基于這些臨床研究結果，對于擇期接受結腸或直腸切除術的患者，建議盡可能同時使用機械性腸道準備和口服抗生素進行腸道準備。
4.2 圍術期干預措施對吻合口漏的影響
4.2.1 手術本身對吻合口漏的影響
手術本身的損害可能會改變宿主微生物群的毒力，同時增加術后并發癥的風險，尤其是吻合口漏。但手術后菌群失調與吻合口漏之間的因果關系需要通過臨床試驗來驗證。Ohigashi等[12]利用定量-逆轉錄PCR檢測到結直腸癌術后腸道微生物群會發生迅速的表型轉變且微生物密度和代謝物產生巨大變化，對維持胃腸道穩態有非常重要作用的專性厭氧菌如球形梭菌、柔嫩梭菌、脆弱擬桿菌、雙歧桿菌、阿托波菌和普雷沃特菌數量會減少。van Praagh等[39]從進行了結直腸吻合術患者的吻合口切緣中分離出細菌DNA并進行分析發現，后續發展為吻合口漏患者的吻合口切緣中微生物多樣性較低且與黏蛋白降解有關的擬桿菌科和毛螺菌科增多。此外，在腸切除時腸腔暴露在氧氣中，在血管結扎時會造成局部血液供應暫時中斷。在一項對小腸移植患者的研究[40]中發現，在改道的結腸中，專性厭氧菌包括類桿菌和索狀芽孢桿菌被耗盡，而乳桿菌和腸桿菌科兼性厭氧菌的數量增加。這些研究為腸道手術導致的菌群失調與吻合口漏之間的因果關系分析提供了一些合理的原因。
4.2.2 圍術期干預改善腸道菌群失調對吻合口漏的影響
前面已描述吻合口漏可能是由產生膠原酶的腸道病原菌引起的，而且腸道黏液對吻合口愈合非常重要，但常規的術前腸道準備并不能減少條件致病菌定植，而且改變了腸道黏液形成，因此需要考慮新的策略來控制這些病原菌的毒力。群體感應是細菌毒力激活的細胞間通訊系統，某些條件致病菌可以通過群體感應來觸發其編碼膠原酶的gelE基因表達[41]；并且細菌擁有極其敏感的感覺系統來檢測細胞外磷酸鹽濃度。因此，Hyoju等[24]提出了基于磷酸鹽治療的方法，其利用細胞外磷酸鹽來抑制群體感應，作為一種在不影響細菌生長的情況下減弱細菌毒力的方法，在小鼠模型中證明了口服多磷酸鹽顯著減弱了吻合口組織中黏質沙門菌和銅綠假單胞菌的定植和膠原酶活性，從而防止了吻合口漏發生。在Wiegerinck等[42]的小鼠實驗數據亦表明，口服多磷酸化聚合物ABA-PEG20K-Pi20顯著抑制了糞腸球菌中膠原酶的產生并預防吻合口漏。另外，Nichols等[43]研究發現，不同形式的磷酸鹽的持續釋放抑制了細菌膠原酶的形成，可以在不根除腸道愈合過程中的保護性菌群的情況下減弱組織破壞性細菌表型的表達。因此，為準備腸道吻合手術的患者提供多磷酸鹽可能代表了一種預防吻合口漏的新方法。此外，丁酸鹽作為一種有益的短鏈脂肪酸，由腸道細菌通過膳食纖維發酵形成，是結腸上皮細胞的主要能量來源，有利于結腸上皮細胞增殖、維持黏膜層厚度和保持腸道屏障功能及完整性[44]。在一項針對丁酸鹽的不同給藥途徑提高大鼠結腸吻合強度的對比研究[45]中發現，丁酸鹽灌腸與更好的吻合口愈合有關。另外鑒于菊粉、半乳糖等低聚糖類益生元能夠增加短鏈脂肪酸的產生和促進上皮修復，Hajjar等[46]通過圍手術期給予小鼠模型菊粉和低聚半乳糖，結果發現，菊粉和低聚半乳糖飲食的小鼠吻合口周圍組織中的膠原蛋白濃度較高，加速了吻合口愈合并增強了腸道屏障。以上這些研究結果提示，丁酸鹽對結腸上皮的增殖作用表明與組織修復和黏膜連續性有關，有可能可以防止吻合口部位的滲漏。
綜上所述，腸道菌群的個體組成及其圍術期成分的變化，可由各種原因解釋，如機械腸道準備、口服抗生素、結直腸手術本身等，可能對患者的病程有重要影響。因此，圍術期調整腸道菌群組成的措施對于降低吻合口漏的發生率可能具有臨床意義。
5 小結與展望
微生物組是一個新的且非常有前景的研究領域，尤其是在研究結直腸癌手術中吻合口漏的病因時。現有的研究證據表明，腸道微生物群與宿主之間存在著強烈的雙向作用，并且這種微生物群-宿主關系在結直腸癌術后引起和（或）加劇吻合口漏中發揮重要作用。但是現有的證據仍然有限，需要進一步的研究來確切地闡明腸道微生物群變化是如何導致吻合口漏的，從而以此為依據，識別出具有不良微生物組的高危患者如具有高膠原酶活性的病原體，并根據需要對其采取適當的經口、靜脈或灌腸的抗生素方案和（或）菌種移植，可能有助于降低吻合口漏發生率。
目前，已有一些針對腸道菌群在吻合口漏有關治療中潛在作用的研究，然而這些研究有諸多不足：① 這些研究多是探索性的，而且多數研究樣本量小且多在動物模型中完成，而關于結直腸癌患者腸道菌群與吻合口漏之間關系的臨床研究非常有限；② 在對于動物的研究中看到，將人類糞便移植到動物身體內時，細菌定植的發展與人類不同，宿主免疫反應可能不同；③ 在制作動物模型時，需要考慮到基因組學、腫瘤固有特征、動物微生物組與種植的人類細菌之間的競爭等因素，唯有如此才能更準確地優化動物模型，使其更接近于人類腸道中的情況；④ 由于宿主遺傳、環境和生活方式因素的差異如種族、地理位置、飲食等，不同個體之間微生物群的成分存在一定差異，可能導致針對人體的研究結果存在極端差異。針對以上不足，有必要進行更大規模及多中心的分析，以確定可能達成共識的結直腸癌術后與吻合口漏相關的微生物組；此外，從本綜述結果看，圍術期各項干預措施對腸道菌群會產生重要影響，并且結直腸癌術后腸道菌群也會發生顯著變化。因此，外科醫生在圍術期對患者的管理中應努力減少對腸道菌群平衡的過度干擾，減少一些非必要藥物的使用，可在有適應證的情況下適當應用口服抗生素或進行腸道準備。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王朝樣查閱文獻、設計選題及撰寫文章；林浩、張海寶、巨家華參與查閱文獻；俞永江校對文章及指導選題設計。
結直腸癌最佳的外科治療方法是根治性切除腫瘤并重建消化道。盡管外科醫生遵循個體化治療原則，術中盡量減少對組織的損傷并保證吻合口血供、降低吻合口張力和采用了恰當的吻合技術，但術后吻合口漏的發生仍不可忽視[1]，有文獻[2]報道其發生率為1%～19%。術后發生吻合口漏會增加住院費用和延長住院時間，影響其短期和長期預后，甚至提高病死率。近年來，研究者們[3-5]對結直腸癌根治術后吻合口漏發生的潛在危險因素進行了廣泛研究，并且認為吻合口漏的發生歸因于多種因素，如年齡≥60歲、男性、體質量指數≥25 kg/m2、吸煙、合并糖尿病等、術前使用非甾體類藥物、術前白蛋白＜35 g/L、術后白蛋白＜32 g/L、術前貧血、圍術期輸血（術中及術后2 d內）、新輔助放化療、術前口服抗生素腸道準備、美國麻醉醫師協會評分分級≥Ⅲ級、腫瘤TNM分期Ⅲ和Ⅴ期、吻合口距肛緣距離＜7 cm、吻合技術等，但其發病機制仍未完全明了。近來有研究[6]又發現，腸道菌群的組成和多樣性改變可能也與結直腸癌根治術后吻合口漏的發生有潛在的聯系。因此，筆者就近年來結直腸癌圍術期腸道菌群變化情況及其影響吻合口漏研究的相關文獻進行綜述，以了解其相互作用及其潛在的機制，為臨床管理結直腸癌手術患者及后續研究提供一定的參考。
1 腸道菌群情況
人類腸道含有超過百億的微生物，這些微生物共同構成了腸道微生物群如細菌、病毒、真菌、古生菌等，其通過與宿主的持續協同相互作用，在維持機體健康和誘導疾病發生中發揮著至關重要的作用，其中已有超過2 000多種細菌構成了腸道菌群。多數腸道菌群分屬于4種門類：厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門[7]。正常情況下，結直腸中的優勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門，其可保護腸道上皮免受病原菌的入侵，同時可誘導并促進健康的免疫反應[8]。但有研究[9-11]表明，在結直腸癌患者的腸道菌群中，芽孢桿菌科（厚壁菌門）、葡萄球菌科（厚壁菌門）、梭桿菌屬（梭桿菌門）、另枝菌屬（擬桿菌門）、卟啉單胞菌屬（擬桿菌門）、阿克曼菌（疣微菌門）和脆弱擬桿菌（擬桿菌門）數量較多，而羅氏菌屬（放線菌門）、雙歧桿菌（放線菌門）、乳桿菌（厚壁菌門）、瘤胃球菌（厚壁菌門）、普拉梭菌（厚壁菌門）和密螺旋體（螺旋體屬）數量缺乏。此外，結直腸癌術后腸道菌群也會發生明顯變化，主要體現在：專性厭氧菌顯著減少，病原菌如腸桿菌科（變形菌門）、腸球菌（厚壁菌門）、葡萄球菌（厚壁菌門）和假單胞菌（變形菌門）數量增加，有機酸濃度也有顯著變化，如短鏈脂肪酸濃度顯著降低[12]，并且這種成分的變化幾乎是立刻發生，這種變化在Guyton等[13]的研究中得以證實，在結腸切除和吻合后的幾小時內，優勢菌門種類如擬桿菌門和厚壁菌門減少了90%，其中厚壁菌門中的糞腸球菌則增加了500倍；另外Shogan等[14]通過16S rRNA測序分析結腸切除大鼠模型中腸腔和黏膜的相關菌群變化亦發現，吻合口組織中腸球菌和埃希菌或志賀菌的相對豐度顯著增加（分別為500倍和200倍）。因此，通過對這些菌群變化情況的了解，有助于進一步闡明腸道菌群失調與結直腸癌術后吻合口漏之間的聯系。
2 腸道菌群與吻合口漏的關系
通常結直腸吻合完成后，宿主會立即啟動組織修復過程即吻合口愈合過程，該過程中的生理反應被分為3個連續和重疊的階段—炎癥、增殖和重塑[15]。在炎癥階段，會產生富含纖維蛋白或纖維連接蛋白的基質，任何潛在的入侵微生物將被清除；在增殖階段，成纖維細胞和肌成纖維細胞被巨噬細胞釋放的化學誘導劑所吸引，同時導致不同類型（Ⅰ～Ⅳ型）的膠原蛋白被沉積，從而增強愈合組織的強度；在重塑階段，Ⅲ型膠原蛋白被基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）分解，取而代之的是瘢痕組織中主要的Ⅰ型膠原蛋白，同時脈管系統得到重新排列[16]。
吻合口的最終愈合過程涉及腸上皮屏障的重建及腸道微環境的許多組成成分如宿主細胞（上皮細胞和固有層細胞）、微生物群以及胃腸道腔內的膳食和非膳食成分[16]。腸道菌群可通過不同細菌種類之間的競爭和（或）協作來促進或抑制吻合口的愈合。
2015年，Lee等[17]從結直腸癌患者術后發生吻合口漏的143例患者的腹腔液或引流液中分離出的病原體發現，從滲漏部位分離出來的最主要的病原菌是糞腸球菌，其次為銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等；另外，Komen等[18]通過定量逆轉錄-PCR評估了243例接受腸切除腸吻合術患者的腹腔引流液，發現發生吻合口漏患者的引流液中大腸桿菌和糞腸球菌濃度顯著增加，還提出了在術后第2天和第3天對引流液進行糞腸球菌定量逆轉錄-PCR檢測可能是一種簡單且低成本的吻合口漏篩查方法。
以上研究結果提示，厚壁菌門的糞腸球菌、變形菌門的銅綠假單胞菌和大腸桿菌可能與吻合口漏有關，其可能的原因是它們具有產生明膠酶的能力，因明膠酶是能夠降解膠原蛋白的一種基質水解酶，但還需要更多的臨床研究來驗證腸道菌群與吻合口漏的關系。
3 腸道菌群引發吻合口漏的可能機制
吻合口漏發生的一個潛在危險因素是宿主組織細胞外基質蛋白的降解。研究[19]證明，細胞外基質中的膠原蛋白降解酶在腸吻合口的早期愈合階段扮演重要的角色，它們的平衡調節很重要，可以在不危及新形成的膠原層完整性的情況下進行膠原重組。在結直腸中，某些腸道微生物有可能直接激活MMP的活性，引起膠原蛋白降解的失衡，從而影響吻合口的愈合[20]。
膠原蛋白水解酶（簡稱“膠原酶”）是一種關鍵的細菌外產物，可以降解對吻合口愈合至關重要的Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白。Olivas等[21]在大鼠模型中證明了銅綠假單胞菌可以被吻合口組織中存在的宿主因素激活以表達膠原酶，提示銅綠假單胞菌菌株可以改變其表型，不僅改變其在吻合口組織部位的抗生素耐藥性，而且可以在體內誘導表達組織降解膠原酶，從而導致吻合口漏發生。另外，糞腸球菌能夠產生明膠酶，它通過分解膠原蛋白和激活能夠降解膠原蛋白的MMP而促進吻合口漏的發生[22]，這一論點在Shogan等[23]的研究中得到證實。在Shogan等[23]的研究中，利用大鼠模型證實了糞腸球菌通過降解宿主腸道組織中的膠原蛋白和激活組織MMP-9導致了吻合口漏的發生；他們還對接受結腸術后患者的吻合口黏膜進行了細菌培養，在64個培養的菌株中發現只有銅綠假單胞菌和糞腸球菌顯示出了顯著的膠原蛋白降解活性和MMP-9裂解能力，進一步證實了這一結論。此外，Hyoju等[24]在結直腸手術動物模型中證明了黏質沙雷菌的膠原酶溶解菌株在吻合口漏的發病機制中也起關鍵作用和致病作用。2021年，一項臨床研究[25]顯示，74%的吻合口漏患者有產生膠原酶的細菌如糞腸球菌定植（P=0.022），并且抗生素耐藥菌在吻合口漏患者中更為常見（P=0.01）。另外，MMP的重要性及其在吻合口完整性中的作用通過一系列病例進一步表征，這些病例研究了給予MMP抑制劑（包括強力霉素）后腸吻合口的強度，結果發現，添加MMP抑制劑可改善術后吻合口的組織強度和組織完整性[26]。
綜上所述，在吻合口漏的發病機制中，膠原酶產生菌如糞腸球菌、銅綠假單胞菌和黏質沙雷菌起著關鍵作用和致病作用，提示了某些特定細菌通過細菌膠原酶的表達和宿主腸道MMP的過度激活導致膠原蛋白降解，從而在吻合口漏的發展中發揮作用。
4 圍術期干預對腸道菌群及術后吻合口漏的影響
4.1 圍術期干預措施對腸道菌群的影響
圍術期干預措施如禁食、機械性腸道準備和口服或靜脈注射抗生素通常會干擾腸道菌群，目前有證據[27]表明，腸道菌群在內臟手術圍術期發生了局部改變，尤其是在吻合口部位。目前對腸道菌群的結構或功能影響的了解甚少。隨著腸道取樣技術、測序技術和蛋白質產物（轉錄組學）分析技術的進步，擴展了表征腸道微生物群的能力，并且確定了腸道菌群可能影響吻合口的愈合，從而導致或預防吻合口漏。圍術期的干預有可能導致劇毒菌群如腸球菌、假單胞菌的大量繁殖，這些細菌能夠根據環境提示轉變為更具侵襲性和破壞組織的表型[23]。
4.1.1 機械性腸道準備對腸道菌群的影響
術前機械性腸道準備（口服導瀉藥來清除腸腔內糞便）在術前以多種方式改變了患者的腸道菌群，其有利亦有弊。① 一項評估術前機械性腸道準備對結直腸癌切除患者糞便菌群影響的隨機對照試驗[28]結果表明，術后雙歧桿菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、腸桿菌科和乳桿菌的數量顯著減少，而腸球菌和葡萄球菌的數量無明顯減少。② Gaines等[29]的研究結果顯示，在非肥胖患者中機械性腸道準備導致膠原酶產生細菌的抑制，而在肥胖患者中則不然，這可能解釋了肥胖患者吻合口漏發生率和癌復發風險更高的原因。③ 從黏膜層分泌的黏液是胃腸道吻合口愈合的必要因素，黏膜層的微生物群決定了腸道內上皮細胞和免疫細胞的功能，這兩種細胞是促進腸吻合口愈合的已知因素，黏液在其中起屏障作用，限制了腸腔細菌與腸上皮接觸以及隨之而來的有害影響。然而由于術前機械性腸道準備（以聚乙二醇為基礎的準備工作）是有效地清除了腸道黏液，腔外細菌未能沖洗，從而改變了微生物群平衡；此外， 在機械性腸道準備過程中將氧氣輸送至腸腔，從而對厭氧菌種群產生負面影響，而且還能減少用于細菌新陳代謝營養物質的可獲得性，這些因素都可以迅速改變腸道菌群的組成和動態平衡，從而影響腸道屏障的完整性[30]；同時手術也會導致手術部位的組織損傷和缺血，從而改變腸道黏液的產生。由于缺乏保護性黏液層以及正常保護性微生物群的上皮暴露，允許了病原體被黏附和遷移，因而會導致一些不良后果如吻合口漏[31]。
4.1.2 圍術期抗生素應用對腸道菌群的影響
目前標準的預防性抗生素方案具有廣譜性，因此無法選擇性地針對特定的病原體。在一項早期研究[32]中報道，口服阿莫西林5 d，腸道菌群的多樣性和豐度在第1天就顯著降低，其組成到第60天時部分恢復到約90%。關于靜脈注射抗生素，使用β-內酰胺類藥物（氨芐西林、頭孢唑林和舒巴坦）可導致治療結束后擬桿菌門減少和厚壁菌門增加[33]；β-內酰胺類和氟喹諾酮類藥物的應用導致微生物多樣性顯著減少，增加了擬桿菌門/厚壁菌門比例[34]。從上述研究中可以看出，圍術期抗生素應用，即使是短期使用也會導致對腸道菌群有害的現象持續數月，抗生素的非特異性抗菌作用導致腸道菌群失調，大大降低了微生物的多樣性，有利于條件致病菌的增加。
4.1.3 機械性腸道準備和抗生素聯合應用對腸道菌群的影響
聯合使用機械性腸道準備和抗生素，可能會導致腸道菌群發生有益的變化[35]。已有回顧性研究[36]證明，術前機械性腸道準備和抗生素聯合使用可顯著降低術后并發癥發生率，包括吻合口漏、腸梗阻和外科手術部位感染。Klinger等[37]分析了27 804例接受擇期結直腸切除術的患者，發現機械性腸道準備和口服抗生素聯合應用可顯著降低手術部位感染、器官間隙感染、傷口裂開和吻合口漏的發生率。另有一項臨床試驗[38]亦證實了機械性腸道準備和抗生素聯合使用可顯著降低結直腸癌術后患者的吻合口漏發生率。因此，基于這些臨床研究結果，對于擇期接受結腸或直腸切除術的患者，建議盡可能同時使用機械性腸道準備和口服抗生素進行腸道準備。
4.2 圍術期干預措施對吻合口漏的影響
4.2.1 手術本身對吻合口漏的影響
手術本身的損害可能會改變宿主微生物群的毒力，同時增加術后并發癥的風險，尤其是吻合口漏。但手術后菌群失調與吻合口漏之間的因果關系需要通過臨床試驗來驗證。Ohigashi等[12]利用定量-逆轉錄PCR檢測到結直腸癌術后腸道微生物群會發生迅速的表型轉變且微生物密度和代謝物產生巨大變化，對維持胃腸道穩態有非常重要作用的專性厭氧菌如球形梭菌、柔嫩梭菌、脆弱擬桿菌、雙歧桿菌、阿托波菌和普雷沃特菌數量會減少。van Praagh等[39]從進行了結直腸吻合術患者的吻合口切緣中分離出細菌DNA并進行分析發現，后續發展為吻合口漏患者的吻合口切緣中微生物多樣性較低且與黏蛋白降解有關的擬桿菌科和毛螺菌科增多。此外，在腸切除時腸腔暴露在氧氣中，在血管結扎時會造成局部血液供應暫時中斷。在一項對小腸移植患者的研究[40]中發現，在改道的結腸中，專性厭氧菌包括類桿菌和索狀芽孢桿菌被耗盡，而乳桿菌和腸桿菌科兼性厭氧菌的數量增加。這些研究為腸道手術導致的菌群失調與吻合口漏之間的因果關系分析提供了一些合理的原因。
4.2.2 圍術期干預改善腸道菌群失調對吻合口漏的影響
前面已描述吻合口漏可能是由產生膠原酶的腸道病原菌引起的，而且腸道黏液對吻合口愈合非常重要，但常規的術前腸道準備并不能減少條件致病菌定植，而且改變了腸道黏液形成，因此需要考慮新的策略來控制這些病原菌的毒力。群體感應是細菌毒力激活的細胞間通訊系統，某些條件致病菌可以通過群體感應來觸發其編碼膠原酶的gelE基因表達[41]；并且細菌擁有極其敏感的感覺系統來檢測細胞外磷酸鹽濃度。因此，Hyoju等[24]提出了基于磷酸鹽治療的方法，其利用細胞外磷酸鹽來抑制群體感應，作為一種在不影響細菌生長的情況下減弱細菌毒力的方法，在小鼠模型中證明了口服多磷酸鹽顯著減弱了吻合口組織中黏質沙門菌和銅綠假單胞菌的定植和膠原酶活性，從而防止了吻合口漏發生。在Wiegerinck等[42]的小鼠實驗數據亦表明，口服多磷酸化聚合物ABA-PEG20K-Pi20顯著抑制了糞腸球菌中膠原酶的產生并預防吻合口漏。另外，Nichols等[43]研究發現，不同形式的磷酸鹽的持續釋放抑制了細菌膠原酶的形成，可以在不根除腸道愈合過程中的保護性菌群的情況下減弱組織破壞性細菌表型的表達。因此，為準備腸道吻合手術的患者提供多磷酸鹽可能代表了一種預防吻合口漏的新方法。此外，丁酸鹽作為一種有益的短鏈脂肪酸，由腸道細菌通過膳食纖維發酵形成，是結腸上皮細胞的主要能量來源，有利于結腸上皮細胞增殖、維持黏膜層厚度和保持腸道屏障功能及完整性[44]。在一項針對丁酸鹽的不同給藥途徑提高大鼠結腸吻合強度的對比研究[45]中發現，丁酸鹽灌腸與更好的吻合口愈合有關。另外鑒于菊粉、半乳糖等低聚糖類益生元能夠增加短鏈脂肪酸的產生和促進上皮修復，Hajjar等[46]通過圍手術期給予小鼠模型菊粉和低聚半乳糖，結果發現，菊粉和低聚半乳糖飲食的小鼠吻合口周圍組織中的膠原蛋白濃度較高，加速了吻合口愈合并增強了腸道屏障。以上這些研究結果提示，丁酸鹽對結腸上皮的增殖作用表明與組織修復和黏膜連續性有關，有可能可以防止吻合口部位的滲漏。
綜上所述，腸道菌群的個體組成及其圍術期成分的變化，可由各種原因解釋，如機械腸道準備、口服抗生素、結直腸手術本身等，可能對患者的病程有重要影響。因此，圍術期調整腸道菌群組成的措施對于降低吻合口漏的發生率可能具有臨床意義。
5 小結與展望
微生物組是一個新的且非常有前景的研究領域，尤其是在研究結直腸癌手術中吻合口漏的病因時。現有的研究證據表明，腸道微生物群與宿主之間存在著強烈的雙向作用，并且這種微生物群-宿主關系在結直腸癌術后引起和（或）加劇吻合口漏中發揮重要作用。但是現有的證據仍然有限，需要進一步的研究來確切地闡明腸道微生物群變化是如何導致吻合口漏的，從而以此為依據，識別出具有不良微生物組的高危患者如具有高膠原酶活性的病原體，并根據需要對其采取適當的經口、靜脈或灌腸的抗生素方案和（或）菌種移植，可能有助于降低吻合口漏發生率。
目前，已有一些針對腸道菌群在吻合口漏有關治療中潛在作用的研究，然而這些研究有諸多不足：① 這些研究多是探索性的，而且多數研究樣本量小且多在動物模型中完成，而關于結直腸癌患者腸道菌群與吻合口漏之間關系的臨床研究非常有限；② 在對于動物的研究中看到，將人類糞便移植到動物身體內時，細菌定植的發展與人類不同，宿主免疫反應可能不同；③ 在制作動物模型時，需要考慮到基因組學、腫瘤固有特征、動物微生物組與種植的人類細菌之間的競爭等因素，唯有如此才能更準確地優化動物模型，使其更接近于人類腸道中的情況；④ 由于宿主遺傳、環境和生活方式因素的差異如種族、地理位置、飲食等，不同個體之間微生物群的成分存在一定差異，可能導致針對人體的研究結果存在極端差異。針對以上不足，有必要進行更大規模及多中心的分析，以確定可能達成共識的結直腸癌術后與吻合口漏相關的微生物組；此外，從本綜述結果看，圍術期各項干預措施對腸道菌群會產生重要影響，并且結直腸癌術后腸道菌群也會發生顯著變化。因此，外科醫生在圍術期對患者的管理中應努力減少對腸道菌群平衡的過度干擾，減少一些非必要藥物的使用，可在有適應證的情況下適當應用口服抗生素或進行腸道準備。
重要聲明
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作者貢獻聲明：王朝樣查閱文獻、設計選題及撰寫文章；林浩、張海寶、巨家華參與查閱文獻；俞永江校對文章及指導選題設計。