2022年1月7日美國馬里蘭大學醫學中心報道了全球第1例基因編輯豬心臟成功移植到1例57歲患有終末期心臟病的男性患者體內，引起了全球轟動。基因編輯豬心臟移植到人體內成功存活 59 d 而沒有出現早期排斥，邁出了異種器官移植走向臨床的關鍵一步。筆者重點探討了基因編輯在減輕免疫排斥反應中的作用，總結了本次馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例，并且對異種移植現狀以及異種移植尚未解決的問題進行了概述，期望未來異種移植能成功走進臨床。
引用本文： 李丹妮, 趙艷雙, 王軼, 潘登科, 鄧紹平. 異種移植新進展：從實驗到臨床. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(6): 705-710. doi: 10.7507/1007-9424.202204023 復制
異種移植是將動物來源的活細胞、組織、器官以及體液移植入或輸注到人類受體中。異種移植的發展動力源自臨床移植的人體器官供應嚴重不足[1]。在美國，2020年進行了3.9萬例器官移植手術[2]，在中國2020年進行了1.8萬例器官移植手術，因得不到救命器官捐獻而死亡的患者更多。器官捐獻難以滿足現階段需要器官移植的患者數量，異種移植是解決器官短缺的重要途徑。
2022年1月7日美國馬里蘭大學醫學中心報道了全球第1例基因編輯豬心臟成功移植到1例57歲患有終末期心臟病的男性患者體內，引起了全世界的關注。馬里蘭大學心臟外科團隊進行首次豬到人心臟移植而沒有出現早期排斥跡象，創造了異種移植的歷史，異種移植也因此走進了大眾的視野。未來異種移植的臨床應用將為全球每年在等待供體器官的患者提供一種潛在的解決方案。筆者擬簡要講述本次馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例，著重介紹基因編輯在減輕免疫排斥反應中的作用。
1 全球首例基因編輯豬心臟移植到患者體內
據馬里蘭大學醫學中心報道[3]，全球首例接受豬心臟移植是一位患有終末期心臟病的57歲男性，在2021年10月就醫時只能臥床，在手術前2周多依靠呼吸機（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）維持生命，隨時都可能死亡。首先，由于該患者長期酗酒且不遵醫囑，不能被納入同種心臟移植名單內；其次，該患者伴有嚴重的心律失常也不符合做人工心臟的要求；因此唯一延長生命的辦法是接受豬心臟移植。雖然異種器官移植技術還沒有獲得許可投入使用，但美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）有“同情使用” （compassionate use）條款，當患者面臨嚴重或危及生命的醫療狀況，且僅有實驗性療法這一種選擇的時候，就適用這項條款。基于這些重要原因，馬里蘭大學醫學中心遵照“同情使用”條款和該患者的意愿，最終促成了該患者移植豬心臟的壯舉。在2022年，當地時間1月7日，經FDA批準，美國馬里蘭大學醫學中心的外科醫生團隊成功將一顆基因編輯豬的心臟移植到了該患者體內。
據馬里蘭大學醫學中心披露，該患者的供體心臟來源于10基因編輯豬，涉及的基因總結為3類：一是敲除激活人天然抗體的3個糖基化抗原基因α-1，3-半乳糖基轉移酶（alpha-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）、胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）和β1，4N-乙酰半乳糖胺基轉移酶（β1，4N-acetylgalactosaminyltransferase，βGalNT2）；二是轉入6個減輕排斥反應和保護作用的人源基因CD46、CD55、血栓調節蛋白（thrombomodulin，TBM）、內皮細胞蛋白C受體（endothelial protein creceptor，EPCR）、CD47和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）；三是敲除生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因。得益于基因編輯技術的不斷發展，才能完成這10項基因編輯，力求最大限度地保證這顆心臟在人體內長期存活。該患者接受了移植基因編輯豬心臟的手術，手術后心臟狀況良好，沒有出現立即的排斥反應。根據馬里蘭大學醫學中心研究人員表示，患者手術后很快蘇醒，術后第4天去掉了ECMO，這顆心臟能達到正常人心臟的功能，豬心臟的血流量和壓力符合人體血液循環動力學要求，沒有出現超急性排斥反應，該患者存活了59 d。患者術后經歷了一系列并發癥以及多次手術，在最后一段時間出現感染和多器官衰竭問題，患者病情逐漸惡化，于2022年3月8日去世[3]。馬里蘭研究人員正在進行徹底的檢查分析，其具體的死亡原因以及是否有排斥近期將于正式的文章中進行發表。 盡管該患者仍然沒能依靠這個移植心臟延續更長久的生命，但基因編輯的豬心臟移植仍舊創造了醫學奇跡，為下一步臨床試驗提供了寶貴經驗。
2 異種移植的免疫排斥
2.1 異種移植的免疫排斥機制
異種移植的最大難題是免疫排斥，首先面臨的是超急性排斥反應。超急性排斥存在于異種移植間，能在24 h內將移植器官、組織或細胞殺死，其原因是激活了人體存在于血液中的天然抗體[4]。血液中的天然抗體與異種移植物表面抗原結合激活補體系統。人體補體系統是由無數補體蛋白構成的復雜系統，包括3條途徑：經典補體通路、替代補體通路和凝集素補體通路。最終激活的補體通路會借助膜攻擊復合物導致移植失敗。其次是急性排斥反應，與人體同種移植類似，一般發生在移植后數日至6個月內，人體特異性和非特異性免疫細胞如B細胞、T細胞、巨噬細胞和細胞殺傷因子均參與到急性排斥過程中。最后是慢性排斥反應，雖然這方面的研究還不多，但是至少異種移植物被認為可能會經歷同種異體相類似的慢性免疫排斥。所以，異種移植后患者需要接受綜合免疫抑制治療，以有效抑制復雜的免疫排斥反應。
2.2 免疫抑制劑
最早的異種移植開始于1905年，法國醫生布蘭斯多將兔腎切成薄片植入腎功能衰竭兒童體內，16 d后兒童死于肺部感染[5]。直到1960年，免疫抑制劑的出現，為異種移植帶來了新的火種。希欽斯和埃利昂兩位科學家分離出一種強有力的免疫抑制劑“硫唑嘌呤” [6]；1978年，環孢素首次應用于臨床腎移植，以后又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官移植，均取得令人滿意的效果；他克莫司（FK506）是鈣調磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNIs）的一種，在20世紀90年代應用于臨床；基因工程的進展帶動了單克隆抗體和生物制劑的發展。 所有這些免疫抑制劑都用在了異種移植基礎實驗中，并取得了較好的效果。當然，異種移植技術的突破不止在基因編輯方面，還包括新型免疫抑制。特別是抗CD40抗體的出現，2016年Mohiuddin等[7]報道了使用抗CD40抗體的方案，基因編輯豬的心臟在狒狒體內最長存活了945 d。在馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例中，也使用了抗CD40抗體，該藥物目前處于臨床二期試驗階段。免疫抑制劑的藥物優化，是確保異種移植成功的條件，但僅僅是免疫抑制劑也難以完全阻止嚴重的免疫排斥。
2.3 針對免疫排斥反應進行基因改造
對于超急性排斥反應直到轉基因技術的出現才有了更好的解決方案。 研究者[8]發現，豬血管內皮存在的特定表位α-1，3-半乳糖抗原（α-galactose，α-Gal），會與人體血液中天然抗體結合，激活補體系統引起超急性排斥反應，所以避免超急性排斥反應的方法之一是滅活編碼α-1，3-半乳糖苷轉移酶（alpha-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因。2002年，Lai等[9]利用同源重組技術成功培育出GGTA1單等位基因敲除豬，然后培育出GGTA1雙等位基因敲除豬（GTKO）。Diswall等[10]報道GTKO豬心臟移植到狒狒體內，檢測到狒狒血清與GTKO豬心臟組織中的抗原結合減少，排斥減輕。隨著基因編輯技術的出現和不斷成熟應用，研究者逐漸可以對供體器官進行多個抗原基因的敲除，包括敲除其他能引起急性排斥反應的糖基蛋白抗原：由CMAH 合成的N-乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和由豬βGalNT2 制成的Sd（a）樣聚糖。馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的異種供體心臟中就是敲除了上述3個能引起超急性和急性排斥的糖蛋白基因抗原。
2.4 轉入人類補體調節蛋白
敲除豬的幾個抗原只是遏制了豬血管內皮上的主要抗原與人體天然抗體的結合，不能完全避免補體系統的激活。在補體系統中存在天然的補體抑制因子：膜輔因子蛋白（membrane cofactor proteinCD46, hCD46）、衰變加速因子（decay-accelerating factor, hCD55）和膜攻擊復合物抑制蛋白（membrane attack complex inhibitor protein，hCD59）。這3類因子可以抑制人補體系統3條通路的激活，其中hCD46和hCD55抑制C3和C5轉化酶的形成，hCD59可以抑制攻膜復合物的形成。 由于豬補體抑制因子的同源性差異，不能很好抑制補體的激活，所以需要轉入人的補體抑制因子抑制補體的激活。2004年，Ignacio Anegon團隊[11]培育了高表達人CD46轉基因豬，并將其腎臟移植到狒狒中，很好地抑制了超急性排斥反應，能很好地抑制補體激活的經典通路和替代通路。2012年Mohiuddin等[12]報道了將GTKO/hCD46轉基因豬心臟移植到狒狒中，在抗人胸腺淋巴細胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）、抗CD154和霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）的免疫抑制方案的背景下，基因編輯后的豬心臟有效減輕了免疫排斥，延長異種心臟的存活時間至236 d。
2.5 抗血栓基因
心臟、腎臟等實質器官移植時，當異種移植物移植給受體，隨著血液的再次流通，因分子不相容導致的急性血管排斥反應（acute vascular rejection，AVR）在移植后幾天至幾周內發生。由于移植物內皮細胞激活后，造成炎癥、纖維素沉積和血小板凝集導致移植物壞死或丟失[13]，是豬到靈長類異種實質性器官移植的主要障礙之一[14]。研究[15]證明在豬中過表達1個或多個人的抗凝基因，器官移植后可以明顯抑制血小板聚集，顯著延長移植物的存活時間，例如人TBM、EPCR、CD39等。 2016年Mohiuddin等[7]人報道了GTKO/hCD46/hTBM豬的心臟移植到狒狒體內，最長存活了945 d，其中TBM起到了重要作用。此外，表達EPCR 也可能提高TBM的抗血栓作用的相關研究也正在進行中。
2.6 抗巨噬細胞和凋亡的基因
異種移植物進入受體后將被受體巨噬細胞清除，其主要原因是巨噬細胞表面的受體信號調節蛋白α（signal-regulatoryprotein，SIRPα）不能特異性地識別異種細胞表面的整合素相關蛋白CD47（integrin-associated protein，IAP），導致移植物細胞被受體內的巨噬細胞吞噬并清除。豬腎小球中人CD47的表達可預防蛋白尿并延長豬至狒狒異種移植后的移植物存活時間。在腎小球細胞上高表達hCD47的GTKO/hCD47腎臟移植物的蛋白尿水平最低[16]。表達人血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，hHO-1）可以有效抵抗細胞凋亡，有助于克服缺血性灌注和移植后的凋亡。
因此，基于基因編輯豬在臨床前試驗中的大量結果，馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的異種心臟中研究者使用了敲除3個抗原，轉入了6個人源性的免疫調節和保護基因，以幫助豬心臟能更好地被人體免疫系統接受。
2.7 生長激素受體基因
馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例移植的供體器官豬屬于大型豬品種，器官比人體的要大很多。大型豬是主要肉食品種，由國外選育而成。早期培育器官供體豬時選擇大型豬，可能沒有考慮器官大小適配問題。 研究發現生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）缺陷型豬，其血漿胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factors，IGF1）水平較低，出生后身體和器官生長顯著受限。敲除GHR后，體型變小。因此，生長激素受體敲除（growth hormone receptor knockout，GHR-KO）也被用在了該患者的器官供體豬的基因編輯中，使心臟大小和人體更加匹配。而我國有著豐富的小型豬資源，選擇小型豬作為器官供體，就不需要敲除GHR，中國的異種器官移植團隊多選擇中國特有的小型豬作為器官供體進行基因改造，如巴馬小型豬、五指山小型豬等。
馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例移植的基因編輯豬心臟集合了異種移植發展史上所有的技術結晶，盡管該患者的基因編輯豬心臟移植只是異種移植未來“萬里長征”的第一步，但仍舊鼓舞了探索異種移植發展的研究者。
3 異種移植臨床研究現狀
美國的異種移植水平世界領先，特別是馬里蘭大學醫學中心首次將基因編輯豬心臟應用在了臨床研究中，沒有任何成功是一蹴而就的。這次美國異種移植能成為世界首次，與他們前期進行了大量臨床前試驗密切相關，在近5年內開展了50多例豬到狒狒的臨床前實驗。在全球首例豬心臟移植成功之前，另美國移植團隊已經成功進行了3例基因改造豬腎臟到人體的移植。
第1例是2021年9月美國紐約大學朗格尼健康中心Montgomery教授團隊[17]，成功將基因改造過的GTKO豬腎臟移植到腦死亡患者大腿和腹部外側的血管上，并覆蓋有保護罩；豬腎臟移植到人體內，沒有立即出現排斥反應；據報道豬腎臟 “幾乎立刻” 開始產生尿液和排泄廢物肌酐，這是腎臟功能良好的標志。豬腎臟在與患者血管相連后，正常工作了54 h。
第2例是2021年12月，同一團隊[18]將GTKO豬腎移植到另一位靠呼吸機維持的腦死亡全身捐贈者身上。該例手術標志著潛在替代性器官應用領域的又一次進展。
第3例是2021年9月阿拉巴馬大學伯明翰醫學院Locke教授團隊[19]對1例腦死亡患者進行了雙側原發性腎切除術，隨后將基因編輯豬腎臟移植入體內，再灌注期間血流動力學穩定，試驗進行了74 h；在移植期間未觀察到超急性排斥反應和豬逆轉錄病毒的嵌合或傳播；供體腎來源于Revivicor提供的基因工程豬，包括兩種補體抑制基因（hDAF、hCD46）、兩種抗凝血基因（hTBM、hEPCR）和兩種保護基因（hCD47、hHO-1），以及敲除3個豬糖基抗原和豬生長激素受體基因。
國內異種器官移植的研究也走在國際前沿。湘雅醫院王維團隊[20]發表了2019年版異種胰島移植臨床研究專家共識，規定了異種胰島的質量規范以及倫理等方面的要求，標志著臨床異種胰島移植技術的成熟。腎臟移植的臨床前試驗也取得了很大的進步。2021年王毅教授帶領的團隊[21]將GTKO/hCD55和GTKO/B4GalNT2KO/hCD55/hTBM豬腎臟移植給獼猴，證實B4GalNT2基因的敲除能有效降低獼猴血清中異種抗體的結合，明確Sda抗原在豬到猴異種腎移植中的重要作用，開展了使用免疫抑制劑的豬腎臟移植，受體猴存活32 d，達到國際領先水平。
四川省人民醫院鄧紹平教授和潘登科教授團隊先后培育出的10種基因編輯豬[22]，包括GGTA1、CMAH和βGalNT2 的 3基因敲除和hCD46、hCD55、hTBM、hEPCR、hEPO、hLEA29Y和hCD47轉基因豬，提供給全國各大中心，合作開展胰島移植和腎臟移植前試驗[21, 23]。
我國的異種器官移植臨床前試驗積累了一定經驗，本次馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的臨床研究探索，為我國開展異種器官移植臨床研究提供了寶貴的經驗。
4 其他問題
盡管目前已經將基因編輯豬腎臟及心臟移植到人體中，但異種移植仍然面臨著復雜的免疫排斥問題和生物安全問題[15]。
目前已有各種類型的基因修飾豬，其中大多數正在開展臨床前豬到非人靈長類動物（non-humanprimate，NHP）異種移植模型中進行測試。新的異種反應性抗原可能被發現，基因編輯技術可以讓我們在短時間內生產出新型基因工程豬。筆者認為，基于NHP模型研究的數據，將不同的轉基因豬與不同的免疫抑制療法結合起來，對于不同器官的有效移植是必要的。 因此，在豬-NHP模型中確定最佳的基因工程豬和免疫抑制方案是臨床研究的前提。
生物安全問題是指跨物種感染的風險，比如細菌感染、外源性病毒感染、內源性逆轉錄病毒感染等。 未經凈化的豬可能會攜帶感染人類的病原體，包括布魯氏菌、結核分支桿菌等，也包括流感病毒、豬淋巴細胞皰疹病毒、豬內源性逆轉錄病毒等。針對移植器官的細菌感染和外源性病毒感染風險，可以通過屏障環境結合剖腹產手術培育無特定病原體（specific pathogen free，SPF）豬。有關豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），一般認為PERV整合在豬基因組內，存在多個拷貝，在不同品種及個體中拷貝數差異很大，分PERV- A、B、C 3個亞型，多數為缺陷型，僅少數是完整的。臨床研究共識要求供體豬無PERV-C亞型即可。2017年楊璐菡團隊[24]利用Crispr/cas9技術實現PERV相關基因的敲除，去除了豬內源性病毒感染風險。然而，PERV敲除的必要性以及對人的感染性仍需進一步研究。在報道的幾例豬到人的腎臟、心臟移植臨床研究中，供體豬均未進行PERV敲除，術后監測結果中也未發現PERV感染的證據。
5 結果與展望
隨著異種移植臨床研究的開展，安全性和倫理考慮已成為討論的重點，需要嚴格的倫理法規。關于臨床異種移植的監管挑戰和倫理問題正在全球范圍內被提出。早在2003年，美國食品和藥物管理局首次發布了異種移植指南[25]，2016年更新了異種移植的指導方針和法規，以更好地規范和安全進行異種移植的臨床試驗。
全球第1例豬心臟到人體的移植成功，為以后心臟移植到人體的長期存活提供了借鑒，也為將來其他器官移植到人體提供了經驗與技術。 相信很快會有更多的異種移植臨床研究在國內外開展，來共同推進異種器官移植從實驗階段到臨床應用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李丹妮和趙艷雙負責收集資料并撰寫論文；王軼負責審核資料；潘登科負責補充和修改論文；鄧紹平負責審閱及修改。
異種移植是將動物來源的活細胞、組織、器官以及體液移植入或輸注到人類受體中。異種移植的發展動力源自臨床移植的人體器官供應嚴重不足[1]。在美國，2020年進行了3.9萬例器官移植手術[2]，在中國2020年進行了1.8萬例器官移植手術，因得不到救命器官捐獻而死亡的患者更多。器官捐獻難以滿足現階段需要器官移植的患者數量，異種移植是解決器官短缺的重要途徑。
2022年1月7日美國馬里蘭大學醫學中心報道了全球第1例基因編輯豬心臟成功移植到1例57歲患有終末期心臟病的男性患者體內，引起了全世界的關注。馬里蘭大學心臟外科團隊進行首次豬到人心臟移植而沒有出現早期排斥跡象，創造了異種移植的歷史，異種移植也因此走進了大眾的視野。未來異種移植的臨床應用將為全球每年在等待供體器官的患者提供一種潛在的解決方案。筆者擬簡要講述本次馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例，著重介紹基因編輯在減輕免疫排斥反應中的作用。
1 全球首例基因編輯豬心臟移植到患者體內
據馬里蘭大學醫學中心報道[3]，全球首例接受豬心臟移植是一位患有終末期心臟病的57歲男性，在2021年10月就醫時只能臥床，在手術前2周多依靠呼吸機（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）維持生命，隨時都可能死亡。首先，由于該患者長期酗酒且不遵醫囑，不能被納入同種心臟移植名單內；其次，該患者伴有嚴重的心律失常也不符合做人工心臟的要求；因此唯一延長生命的辦法是接受豬心臟移植。雖然異種器官移植技術還沒有獲得許可投入使用，但美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）有“同情使用” （compassionate use）條款，當患者面臨嚴重或危及生命的醫療狀況，且僅有實驗性療法這一種選擇的時候，就適用這項條款。基于這些重要原因，馬里蘭大學醫學中心遵照“同情使用”條款和該患者的意愿，最終促成了該患者移植豬心臟的壯舉。在2022年，當地時間1月7日，經FDA批準，美國馬里蘭大學醫學中心的外科醫生團隊成功將一顆基因編輯豬的心臟移植到了該患者體內。
據馬里蘭大學醫學中心披露，該患者的供體心臟來源于10基因編輯豬，涉及的基因總結為3類：一是敲除激活人天然抗體的3個糖基化抗原基因α-1，3-半乳糖基轉移酶（alpha-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）、胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）和β1，4N-乙酰半乳糖胺基轉移酶（β1，4N-acetylgalactosaminyltransferase，βGalNT2）；二是轉入6個減輕排斥反應和保護作用的人源基因CD46、CD55、血栓調節蛋白（thrombomodulin，TBM）、內皮細胞蛋白C受體（endothelial protein creceptor，EPCR）、CD47和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）；三是敲除生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因。得益于基因編輯技術的不斷發展，才能完成這10項基因編輯，力求最大限度地保證這顆心臟在人體內長期存活。該患者接受了移植基因編輯豬心臟的手術，手術后心臟狀況良好，沒有出現立即的排斥反應。根據馬里蘭大學醫學中心研究人員表示，患者手術后很快蘇醒，術后第4天去掉了ECMO，這顆心臟能達到正常人心臟的功能，豬心臟的血流量和壓力符合人體血液循環動力學要求，沒有出現超急性排斥反應，該患者存活了59 d。患者術后經歷了一系列并發癥以及多次手術，在最后一段時間出現感染和多器官衰竭問題，患者病情逐漸惡化，于2022年3月8日去世[3]。馬里蘭研究人員正在進行徹底的檢查分析，其具體的死亡原因以及是否有排斥近期將于正式的文章中進行發表。 盡管該患者仍然沒能依靠這個移植心臟延續更長久的生命，但基因編輯的豬心臟移植仍舊創造了醫學奇跡，為下一步臨床試驗提供了寶貴經驗。
2 異種移植的免疫排斥
2.1 異種移植的免疫排斥機制
異種移植的最大難題是免疫排斥，首先面臨的是超急性排斥反應。超急性排斥存在于異種移植間，能在24 h內將移植器官、組織或細胞殺死，其原因是激活了人體存在于血液中的天然抗體[4]。血液中的天然抗體與異種移植物表面抗原結合激活補體系統。人體補體系統是由無數補體蛋白構成的復雜系統，包括3條途徑：經典補體通路、替代補體通路和凝集素補體通路。最終激活的補體通路會借助膜攻擊復合物導致移植失敗。其次是急性排斥反應，與人體同種移植類似，一般發生在移植后數日至6個月內，人體特異性和非特異性免疫細胞如B細胞、T細胞、巨噬細胞和細胞殺傷因子均參與到急性排斥過程中。最后是慢性排斥反應，雖然這方面的研究還不多，但是至少異種移植物被認為可能會經歷同種異體相類似的慢性免疫排斥。所以，異種移植后患者需要接受綜合免疫抑制治療，以有效抑制復雜的免疫排斥反應。
2.2 免疫抑制劑
最早的異種移植開始于1905年，法國醫生布蘭斯多將兔腎切成薄片植入腎功能衰竭兒童體內，16 d后兒童死于肺部感染[5]。直到1960年，免疫抑制劑的出現，為異種移植帶來了新的火種。希欽斯和埃利昂兩位科學家分離出一種強有力的免疫抑制劑“硫唑嘌呤” [6]；1978年，環孢素首次應用于臨床腎移植，以后又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官移植，均取得令人滿意的效果；他克莫司（FK506）是鈣調磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNIs）的一種，在20世紀90年代應用于臨床；基因工程的進展帶動了單克隆抗體和生物制劑的發展。 所有這些免疫抑制劑都用在了異種移植基礎實驗中，并取得了較好的效果。當然，異種移植技術的突破不止在基因編輯方面，還包括新型免疫抑制。特別是抗CD40抗體的出現，2016年Mohiuddin等[7]報道了使用抗CD40抗體的方案，基因編輯豬的心臟在狒狒體內最長存活了945 d。在馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例中，也使用了抗CD40抗體，該藥物目前處于臨床二期試驗階段。免疫抑制劑的藥物優化，是確保異種移植成功的條件，但僅僅是免疫抑制劑也難以完全阻止嚴重的免疫排斥。
2.3 針對免疫排斥反應進行基因改造
對于超急性排斥反應直到轉基因技術的出現才有了更好的解決方案。 研究者[8]發現，豬血管內皮存在的特定表位α-1，3-半乳糖抗原（α-galactose，α-Gal），會與人體血液中天然抗體結合，激活補體系統引起超急性排斥反應，所以避免超急性排斥反應的方法之一是滅活編碼α-1，3-半乳糖苷轉移酶（alpha-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因。2002年，Lai等[9]利用同源重組技術成功培育出GGTA1單等位基因敲除豬，然后培育出GGTA1雙等位基因敲除豬（GTKO）。Diswall等[10]報道GTKO豬心臟移植到狒狒體內，檢測到狒狒血清與GTKO豬心臟組織中的抗原結合減少，排斥減輕。隨著基因編輯技術的出現和不斷成熟應用，研究者逐漸可以對供體器官進行多個抗原基因的敲除，包括敲除其他能引起急性排斥反應的糖基蛋白抗原：由CMAH 合成的N-乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和由豬βGalNT2 制成的Sd（a）樣聚糖。馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的異種供體心臟中就是敲除了上述3個能引起超急性和急性排斥的糖蛋白基因抗原。
2.4 轉入人類補體調節蛋白
敲除豬的幾個抗原只是遏制了豬血管內皮上的主要抗原與人體天然抗體的結合，不能完全避免補體系統的激活。在補體系統中存在天然的補體抑制因子：膜輔因子蛋白（membrane cofactor proteinCD46, hCD46）、衰變加速因子（decay-accelerating factor, hCD55）和膜攻擊復合物抑制蛋白（membrane attack complex inhibitor protein，hCD59）。這3類因子可以抑制人補體系統3條通路的激活，其中hCD46和hCD55抑制C3和C5轉化酶的形成，hCD59可以抑制攻膜復合物的形成。 由于豬補體抑制因子的同源性差異，不能很好抑制補體的激活，所以需要轉入人的補體抑制因子抑制補體的激活。2004年，Ignacio Anegon團隊[11]培育了高表達人CD46轉基因豬，并將其腎臟移植到狒狒中，很好地抑制了超急性排斥反應，能很好地抑制補體激活的經典通路和替代通路。2012年Mohiuddin等[12]報道了將GTKO/hCD46轉基因豬心臟移植到狒狒中，在抗人胸腺淋巴細胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）、抗CD154和霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）的免疫抑制方案的背景下，基因編輯后的豬心臟有效減輕了免疫排斥，延長異種心臟的存活時間至236 d。
2.5 抗血栓基因
心臟、腎臟等實質器官移植時，當異種移植物移植給受體，隨著血液的再次流通，因分子不相容導致的急性血管排斥反應（acute vascular rejection，AVR）在移植后幾天至幾周內發生。由于移植物內皮細胞激活后，造成炎癥、纖維素沉積和血小板凝集導致移植物壞死或丟失[13]，是豬到靈長類異種實質性器官移植的主要障礙之一[14]。研究[15]證明在豬中過表達1個或多個人的抗凝基因，器官移植后可以明顯抑制血小板聚集，顯著延長移植物的存活時間，例如人TBM、EPCR、CD39等。 2016年Mohiuddin等[7]人報道了GTKO/hCD46/hTBM豬的心臟移植到狒狒體內，最長存活了945 d，其中TBM起到了重要作用。此外，表達EPCR 也可能提高TBM的抗血栓作用的相關研究也正在進行中。
2.6 抗巨噬細胞和凋亡的基因
異種移植物進入受體后將被受體巨噬細胞清除，其主要原因是巨噬細胞表面的受體信號調節蛋白α（signal-regulatoryprotein，SIRPα）不能特異性地識別異種細胞表面的整合素相關蛋白CD47（integrin-associated protein，IAP），導致移植物細胞被受體內的巨噬細胞吞噬并清除。豬腎小球中人CD47的表達可預防蛋白尿并延長豬至狒狒異種移植后的移植物存活時間。在腎小球細胞上高表達hCD47的GTKO/hCD47腎臟移植物的蛋白尿水平最低[16]。表達人血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，hHO-1）可以有效抵抗細胞凋亡，有助于克服缺血性灌注和移植后的凋亡。
因此，基于基因編輯豬在臨床前試驗中的大量結果，馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的異種心臟中研究者使用了敲除3個抗原，轉入了6個人源性的免疫調節和保護基因，以幫助豬心臟能更好地被人體免疫系統接受。
2.7 生長激素受體基因
馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例移植的供體器官豬屬于大型豬品種，器官比人體的要大很多。大型豬是主要肉食品種，由國外選育而成。早期培育器官供體豬時選擇大型豬，可能沒有考慮器官大小適配問題。 研究發現生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）缺陷型豬，其血漿胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factors，IGF1）水平較低，出生后身體和器官生長顯著受限。敲除GHR后，體型變小。因此，生長激素受體敲除（growth hormone receptor knockout，GHR-KO）也被用在了該患者的器官供體豬的基因編輯中，使心臟大小和人體更加匹配。而我國有著豐富的小型豬資源，選擇小型豬作為器官供體，就不需要敲除GHR，中國的異種器官移植團隊多選擇中國特有的小型豬作為器官供體進行基因改造，如巴馬小型豬、五指山小型豬等。
馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例移植的基因編輯豬心臟集合了異種移植發展史上所有的技術結晶，盡管該患者的基因編輯豬心臟移植只是異種移植未來“萬里長征”的第一步，但仍舊鼓舞了探索異種移植發展的研究者。
3 異種移植臨床研究現狀
美國的異種移植水平世界領先，特別是馬里蘭大學醫學中心首次將基因編輯豬心臟應用在了臨床研究中，沒有任何成功是一蹴而就的。這次美國異種移植能成為世界首次，與他們前期進行了大量臨床前試驗密切相關，在近5年內開展了50多例豬到狒狒的臨床前實驗。在全球首例豬心臟移植成功之前，另美國移植團隊已經成功進行了3例基因改造豬腎臟到人體的移植。
第1例是2021年9月美國紐約大學朗格尼健康中心Montgomery教授團隊[17]，成功將基因改造過的GTKO豬腎臟移植到腦死亡患者大腿和腹部外側的血管上，并覆蓋有保護罩；豬腎臟移植到人體內，沒有立即出現排斥反應；據報道豬腎臟 “幾乎立刻” 開始產生尿液和排泄廢物肌酐，這是腎臟功能良好的標志。豬腎臟在與患者血管相連后，正常工作了54 h。
第2例是2021年12月，同一團隊[18]將GTKO豬腎移植到另一位靠呼吸機維持的腦死亡全身捐贈者身上。該例手術標志著潛在替代性器官應用領域的又一次進展。
第3例是2021年9月阿拉巴馬大學伯明翰醫學院Locke教授團隊[19]對1例腦死亡患者進行了雙側原發性腎切除術，隨后將基因編輯豬腎臟移植入體內，再灌注期間血流動力學穩定，試驗進行了74 h；在移植期間未觀察到超急性排斥反應和豬逆轉錄病毒的嵌合或傳播；供體腎來源于Revivicor提供的基因工程豬，包括兩種補體抑制基因（hDAF、hCD46）、兩種抗凝血基因（hTBM、hEPCR）和兩種保護基因（hCD47、hHO-1），以及敲除3個豬糖基抗原和豬生長激素受體基因。
國內異種器官移植的研究也走在國際前沿。湘雅醫院王維團隊[20]發表了2019年版異種胰島移植臨床研究專家共識，規定了異種胰島的質量規范以及倫理等方面的要求，標志著臨床異種胰島移植技術的成熟。腎臟移植的臨床前試驗也取得了很大的進步。2021年王毅教授帶領的團隊[21]將GTKO/hCD55和GTKO/B4GalNT2KO/hCD55/hTBM豬腎臟移植給獼猴，證實B4GalNT2基因的敲除能有效降低獼猴血清中異種抗體的結合，明確Sda抗原在豬到猴異種腎移植中的重要作用，開展了使用免疫抑制劑的豬腎臟移植，受體猴存活32 d，達到國際領先水平。
四川省人民醫院鄧紹平教授和潘登科教授團隊先后培育出的10種基因編輯豬[22]，包括GGTA1、CMAH和βGalNT2 的 3基因敲除和hCD46、hCD55、hTBM、hEPCR、hEPO、hLEA29Y和hCD47轉基因豬，提供給全國各大中心，合作開展胰島移植和腎臟移植前試驗[21, 23]。
我國的異種器官移植臨床前試驗積累了一定經驗，本次馬里蘭醫學中心異種心臟移植案例的臨床研究探索，為我國開展異種器官移植臨床研究提供了寶貴的經驗。
4 其他問題
盡管目前已經將基因編輯豬腎臟及心臟移植到人體中，但異種移植仍然面臨著復雜的免疫排斥問題和生物安全問題[15]。
目前已有各種類型的基因修飾豬，其中大多數正在開展臨床前豬到非人靈長類動物（non-humanprimate，NHP）異種移植模型中進行測試。新的異種反應性抗原可能被發現，基因編輯技術可以讓我們在短時間內生產出新型基因工程豬。筆者認為，基于NHP模型研究的數據，將不同的轉基因豬與不同的免疫抑制療法結合起來，對于不同器官的有效移植是必要的。 因此，在豬-NHP模型中確定最佳的基因工程豬和免疫抑制方案是臨床研究的前提。
生物安全問題是指跨物種感染的風險，比如細菌感染、外源性病毒感染、內源性逆轉錄病毒感染等。 未經凈化的豬可能會攜帶感染人類的病原體，包括布魯氏菌、結核分支桿菌等，也包括流感病毒、豬淋巴細胞皰疹病毒、豬內源性逆轉錄病毒等。針對移植器官的細菌感染和外源性病毒感染風險，可以通過屏障環境結合剖腹產手術培育無特定病原體（specific pathogen free，SPF）豬。有關豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），一般認為PERV整合在豬基因組內，存在多個拷貝，在不同品種及個體中拷貝數差異很大，分PERV- A、B、C 3個亞型，多數為缺陷型，僅少數是完整的。臨床研究共識要求供體豬無PERV-C亞型即可。2017年楊璐菡團隊[24]利用Crispr/cas9技術實現PERV相關基因的敲除，去除了豬內源性病毒感染風險。然而，PERV敲除的必要性以及對人的感染性仍需進一步研究。在報道的幾例豬到人的腎臟、心臟移植臨床研究中，供體豬均未進行PERV敲除，術后監測結果中也未發現PERV感染的證據。
5 結果與展望
隨著異種移植臨床研究的開展，安全性和倫理考慮已成為討論的重點，需要嚴格的倫理法規。關于臨床異種移植的監管挑戰和倫理問題正在全球范圍內被提出。早在2003年，美國食品和藥物管理局首次發布了異種移植指南[25]，2016年更新了異種移植的指導方針和法規，以更好地規范和安全進行異種移植的臨床試驗。
全球第1例豬心臟到人體的移植成功，為以后心臟移植到人體的長期存活提供了借鑒，也為將來其他器官移植到人體提供了經驗與技術。 相信很快會有更多的異種移植臨床研究在國內外開展，來共同推進異種器官移植從實驗階段到臨床應用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李丹妮和趙艷雙負責收集資料并撰寫論文；王軼負責審核資料；潘登科負責補充和修改論文；鄧紹平負責審閱及修改。