引用本文： 李晶晶, 朱成章, 史新龍, 杜斌斌, 楊熊飛. 基于16S rDNA測序分析膽囊結石及膽囊切除對結直腸癌患者腸道菌群的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(12): 1573-1582. doi: 10.7507/1007-9424.202203003 復制
隨著代謝組學和基因測序技術在分子生物學中的應用及發展，發現腸道菌群改變與結直腸癌的發生發展關系緊密[1]。膽囊結石是膽道系統的常見疾病，從無癥狀的膽囊結石（多由體檢發現）到有癥狀的膽囊結石（膽絞痛、上腹隱痛、惡心、嘔吐），再到有并發癥的膽囊結石（包括膽囊炎、繼發性膽總管結石、膽源性胰腺炎、Mirizzi綜合征及膽囊癌）。腹腔鏡膽囊切除術是治療膽囊結石的有效手段。膽囊切除術后未濃縮的膽汁大量流入腸道影響膽汁酸的腸肝循環，結腸內膽汁酸的增加改變腸黏膜的通透性，影響腸道微生物群，增加了結直腸癌的發生風險[2]。然而，有關膽囊切除術后膽汁酸代謝途徑改變進而引起患者腸道菌群發生變化，是否會導致某種具有致癌潛力的微生物群落發展，以及是否直接導致結直腸癌的發生發展知之甚少。為此，本研究采用16S rDNA高通量測序技術測定糞便微生物群組成，旨在探究膽囊結石及膽囊切除術后引起腸道菌群失調與結直腸癌發病的相關性，為預防和治療結直腸癌提供新思路。
1 資料與方法
1.1 研究對象
采用前瞻性研究方法，收集2020年6月至2021年3月期間就診于甘肅省人民醫院肛腸科的168例患者，所有患者均進行電子結腸鏡檢查及病理活檢確診為結直腸癌，經彩色多普勒超聲證實無膽管結石和膽石性息肉，收集患者的臨床資料、實驗室檢查結果和糞便樣本。所有患者均簽署知情同意書，本研究通過了甘肅省人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：2021-278）。
1.1.1 納入標準
① 男女分布均衡、年齡46～74歲、體質量指數（body mass index，BMI） 18～23 kg/m2；② 結直腸癌患者（病理活檢確診）；③ 腹部B超、胸腹部CT或MRI檢查提示無遠處轉移；④ 患者均為在甘肅生活20年以上的本地居民，飲食結構均衡；⑤ 膽囊結石伴膽囊炎或膽囊切除病史15年以上；⑥ 膽囊切除術后2年無膽管損傷、傷口感染、膽結石殘留、膿腫形成和（或）膽管狹窄。
1.1.2 排除標準
① 年齡 <46歲或 >74歲、BMI <18 kg/m2或 >23 kg/m2；② 既往有結直腸癌手術史、胃癌手術史及婦科腫瘤手術史；③ 行新輔助放化療；④ 既往有炎癥性腸病、腸易激綜合征、慢性腹痛、腹瀉、腸梗阻、高血壓等疾病；⑤ 既往有內分泌疾病病史（如2型糖尿病、庫欣綜合征、甲狀腺功能亢進等）；⑥ 3個月內服用過免疫抑制劑、抗生素、益生菌、微生態活菌制劑、質子泵抑制劑、二甲雙胍等相關藥物；⑦ 既往有吸煙、飲酒史。
根據上述納入及排除標準，本研究最終納入29例結直腸癌患者作為研究對象，其中結直腸癌合并膽囊結石伴膽囊炎患者10例（膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組），膽囊切除術后結直腸癌患者10例（膽囊切除+結直腸癌組），膽囊正常結直腸癌患者9例（正常膽囊+結直腸癌組）。研究對象篩選流程見圖1。
圖1
示研究對象篩選流程
1.2 16S rDNA高通量測序方法
1.2.1 大便標本采集
納入研究患者于入院后第1次自然排便時用無菌勺采集患者的新鮮大便標本約10 g，盡量避免尿液、灰塵等污染，裝入已滅菌的大便收集管，立即存放于–30 ℃的冰柜中，并在6 h內置于–80 ℃冰箱冷凍保存備檢。
1.2.2 主要試劑和儀器
① 主要試劑：DNA 抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司），FastPfu DNA 聚合酶（北京全式金生物技術股份有限公司），MiSeq試劑盒v3試劑盒和TruSeq納米DNA LT文庫制備試劑盒（美國Illumina 公司），Quant-iT PicoGreen雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒（北京諾為生物技術有限公司）。② 主要儀器：移液器（法國Gilson公司），離心機（長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），PCR儀（美國應用生物系統公司），MiSeq測序儀（美國Illumina 公司）， 微孔板閱讀器 FLx800（美國BioTek儀器有限公司）， 超微量分光光度計（北京凱奧科技發展有限公司）；生物分析儀 ［安捷倫科技（中國）有限公司］。
1.2.3 DNA 提取、PCR 擴增
① DNA提取：稱取大便樣本200 mg至2 mL離心管中，然后按DNA抽提試劑盒（離心柱型）說明書進行DNA提取。② PCR擴增：抽取DNA對其定量，凝膠電泳檢測其完整性，利用引物對16S rDNA V3～V4區進行PCR擴增，PCR正向引物（V3區）為：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物（V4區）為：5′-GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAGGACTAC HVGGGTATCTAATCC-3′。
1.2.4 文庫制備及基因測序
采用TruSeq納米DNA LT文庫制備試劑盒（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit）制備測序文庫，在DNA序列的3′ 端添加A堿基以防止DNA片段自連，在序列5′ 端添加含有文庫特異性標簽（即Index序列）的測序接頭，使DNA分子能被固定；先通過磁珠對文庫純化，再通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收，使用DNA凝膠回收試劑盒說明進行純化，對文庫做最終片段的選擇與純化。然后在生物分析儀上進行質檢，并使用Quant-iT PicoGreen雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒對文庫進行定量檢測，將合格的測序文庫按所需測序量等比例混合后在Illumina MiSeq平臺上進行高通量測序。
1.3 生物信息學分析
1.3.1 操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的聚類分析
使用MiSeq測序儀進行雙端測序，為提高分析結果的準確性，使用DADA2方法進行序列去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體，進行序列分析，將相似性 ≥97%的序列歸為相同的OTU，運用數據分析平臺進行樣本腸道菌群的相關性分析。
1.3.2 稀釋曲線
稀釋曲線基于Chao1、Shannon和Simpson這 3個指數值，由R軟件繪制。稀釋曲線可以用來評估所得到的數據是否足以覆蓋群落中的所有物種。當曲線趨于平緩時，表明產生的數據已足夠。否則，當曲線隨著測序工作量的增加而繼續攀升時，表明樣本的復雜性很高，仍然會有測序數據未發現的物種。
1.3.3 OTU維恩圖
根據OTU豐度，列出各組的OTU，用R軟件的Venn Diagram繪制韋恩圖。維恩圖可以直觀地顯示多樣本中常見及唯一OTU的數量，結合代表物種的OTU，可以獲得不同環境的核心微生物組。
1.3.4 物種注釋
對各樣本在各分類水平 ［如門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）和種（species）］ 的鑒定結果進行統計，并使用R軟件繪制直方圖。基于Greengene數據庫，使用QIIME2的classify-sklearn算法，將獲得的每個OTU的代表序列與數據庫進行相似性和物種注釋比較，計算每個樣本在不同分類水平上的群落組成，并用直方圖可視化。
1.3.5 單一樣本的多樣性分析即Alpha多樣性分析
通過多個指標來分析樣本物種多樣性的復雜性，包括observed species指數、 Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou’s evenness指數和Good’s coverage指數。 observed species指數和Chao1指數反映群落的物種豐富度；Shannon指數、Simpson指數和Faith’s PD指數反映群落的物種多樣性；Pielou’s evenness指數反映群落的均勻度；Good’s coverage指數反映群落的覆蓋度。在物種豐富度相同的情況下，物種均勻度越大，群落多樣性越高。使用R軟件將數據繪制成箱式圖，以直觀地展示不同樣本組之間Alpha多樣性的差異，通過Kruskal-Wallis H秩和檢驗驗證差異的顯著性，P<0.05表示差異有統計學意義。
1.3.6 樣本間多樣性分析
評估樣本間物種多樣性方面的差異采用Beta多樣性分析，即用不同的值來衡量Beta多樣性，如Bray-Curtis、加權UniFrac、未加權UniFrac、Jaccard和Pearson，尤其是前3個值。Bray-Curtis距離是反映2個群落差異的常用指標；UniFrac是利用系統進化信息來比較樣本間的群落物種組成，UniFrac距離可作為Beta多樣性的衡量指標。它考慮了物種間的進化距離，指數越大，樣本間的差異越大。
1.3.7 主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）
PCoA是一種多元統計分析方法，基于樣本距離矩陣進行降維處理，并將結果直觀地呈現在二維坐標圖中以反映組間的差異。利用QIIME2軟件中的迭代算法，根據上述計算得到的Beta多樣性指數矩陣行PCoA分析。2點在坐標軸上的投影距離越近，表明這2個樣本在相應維度中的物種組成結構越相似，故群落差異較大的樣本會遠遠分開，群落結構相似度高的樣本則傾向于聚集在一起。
1.3.8 主成分分析（principal component analysis，PCA）
為了顯示不同樣本中OTU組成的差異，采用基于物種豐度矩陣進行降維處理的PCA構建二維圖，2點在坐標軸上的投影距離越近，表明這2個樣本間的物種豐度組成在相應維度中越相似。
1.4 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件進行人口資料及實驗數據分析。 正態分布的計量資料使用均數±標準差（
±s）表示，3組間比較采用Tukey-Kramer單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗；偏態分布的計量資料用中位數和四分位間距 ［M（IQR）］ 表示，組間比較使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。計數資料使用R×C 的Fisher精確檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本特征
本研究前瞻性納入符合標準的結直腸癌患者29例，根據是否合并膽囊疾病分為3組，3組患者的人口特征見表1，由表1提示3組患者具有可比性。
表1
3組患者的基本特征
2.2 納入患者的實驗室檢查結果
本研究3組患者的血清白細胞介素-6、降鈣素原和總膽汁酸相比差異有統計學意義（P<0.05），但血清總膽汁酸值均在正常范圍內。其余實驗室檢查結果在3組間相比差異均無統計學意義（P>0.05），具體見表2。
表2
3組患者的實驗室檢查結果
2.3 樣本數據分析結果
通過16S rDNA高通量測序總共得到375.037 4萬條原始序列，通過質控、去噪、拼接和去嵌合體后，得到242.251 1萬條高質量擴增特征序列。通過稀釋曲線可以看出，樣本測序數據量合理，能夠反映樣本中絕大多數的微生物信息（圖2a、2b）。
圖2
示稀釋曲線（a）、Shannon曲線（b）和3組間OUT組成的韋恩圖（c）
a b c
2.4 OTU水平的韋恩分析結果
選用相似水平為97%的OTU樣本表，進行聚類，繪制韋恩圖。 3組29個樣本共產生18 039個OTU（圖2c）。
2.5 Alpha多樣性分析結果
本研究對3組樣本微生物群落多樣性進行分析比較。由observed species指數和Chao1指數可知：膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組的群落豐度較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組低，但差異無統計學意義（P>0.05），由Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou’s evenness指數和Good’s coverage指數可知，群落的物種多樣性、均勻度及覆蓋度的差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖3a～3g。
圖3
示Alpha多樣性分析、PCoA、PCA以及3組在門和屬水平上的菌群組成及相對豐度分析結果
a～g：Alpha多樣性分析中各指數分析結果，Chao1指數（a）、Simpson指數（b）、Shannon指數（c）、Pielou’s evenness 指數（d）、observed species指數（e）、Faith’s PD指數（f）、Good’s coverage指數（g）；h：基于Weighted Unifrac距離的PCoA結果；i：3組在OTU水平上的PCA結果；j、k：3組在門（j）和屬（k）水平上的菌群組成及相對豐度分析結果
2.6 Beta多樣性分析結果
為了進一步顯示樣本間物種多樣性的差異，采用PCoA來顯示樣本間的差異。PCoA結果中：坐標軸括號中的百分比代表了對應的坐標軸所能解釋的樣本差異數據（距離矩陣）的比例。具體見圖3h，圖中1個點代表1個樣本，不同的顏色代表不同的組。其結果顯示3組之間的細菌群落組成區分不明顯。
2.7 PCA結果
PCA結果中：X軸代表第一主成分，Y軸代表第二主成分；括號中的47.7%代表PC1成分對樣本的貢獻，19.8%代表PC2成分對樣本的貢獻，具體見圖3i，圖中1個點代表1個樣本，不同的顏色代表不同的組。其結果顯示3組之間的物種豐度組成區分不明顯。
2.8 群落結構分析結果
2.8.1 門水平的群落組成分析結果
在門水平上，3組樣本中擬桿菌（Bacteroidetes）門、厚壁菌（Firmicutes）門、變形桿菌（Proteobacteria）門、梭桿菌（Fusobacteria）門和疣微菌（Verrucomicrobia）門的相對豐度都較高，幾乎占據了腸道細菌總量的95%以上。其中梭桿菌門的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組升高（Z=–2.104，P=0.035）；疣微菌門的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組升高（Z=–2.207，P=0.027；Z=–2.027，P=0.042）；膽囊切除+結直腸癌組的互養菌（Synergistetes）門的相對豐度較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.304，P=0.021；Z=–2.410，P=0.016），見圖3j。
2.8.2 屬水平的群落組成分析
在屬水平上，擬桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.268，P=0.023；Z=–2.342，P=0.019）；羅斯菌（Roseburia）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.297，P=0.021；Z=–1.988，P=0.047）；志賀桿菌（Shigella）屬的相對豐度在膽囊切除+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組增高（Z=–2.192，P=0.028）；毛螺旋菌（Lachnospira）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–1.967，P=0.049）；普氏菌（Prevotella）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.859，P=0.004；Z=–2.843，P=0.004）；梭桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.085，P=0.037；Z=–2.170，P=0.030）；梭菌（Clostridium）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.043，P=0.041；Z=–2.043，P=0.041）；腸球菌（Enterococcus）屬的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組增高（Z=–2.121，P=0.033）；阿克曼菌（Akkermansia）屬的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組增高（Z=–2.134，P=0.032；Z=–2.067，P=0.038）。具體見圖3k。
3 討論
腸道菌群作為人體內最大的微生物群體，在人類疾病預防和治療中的作用逐漸被重視。伴隨著高通量測序技術的廣泛使用，人們逐漸發現腸道菌群參與人體內環境穩態及皮脂溢出、腎臟疾病、炎癥性腸病、婦科腫瘤等疾病的發生與發展[3-5]。此外，不良的飲食習慣、醫源性抗生素等藥物的濫用及益生菌的廣泛使用也會影響腸道菌群結構的變化。
已經有動物實驗證實腸道微生物群落的改變可以促進結直腸癌的發生和發展。 Wong等[6]和Jobin等[7]的研究將結直腸癌患者和健康自愿者的糞便菌群移植到無菌小鼠和常規小鼠體內，喂食結直腸癌患者糞便的常規小鼠與喂食健康自愿者糞便的常規小鼠相比，表現為腸道細胞高度不典型增生和肉眼可見的息肉明顯增多；與喂食健康自愿者糞便的無菌小鼠相比，喂食結直腸癌患者糞便的無菌小鼠表現為結腸細胞異常增殖，但兩種小鼠的糞便菌群豐度均下降。因此有充分理由認為，將結直腸癌患者的糞便樣本進行灌胃會促進無菌小鼠和常規小鼠的腸道發生癌變。有研究[8-10]發現，與健康自愿者相比，結直腸癌患者腸道中梭桿菌門、變形菌門、梭桿菌屬、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）屬、腸球菌屬、大腸桿菌/志賀菌（Escherichia/Shigella）屬、克雷伯桿菌（Klebsiella）屬、鏈球菌（Streptococcus）屬、瘤胃球菌屬、糞芽孢菌（Coprobacillus）屬、伯克霍爾德菌（Burkholderia）屬、卟啉單胞菌（Porphyromonas）屬、副球菌（Paracoccus）、嗜胨菌屬（Peptoniphilus）屬、聚球藻（Synechococcus）屬、藍絲菌（Cyanothece）屬、梭菌屬、消化鏈球菌（Peptostreptococcus）屬等菌群豐度顯著升高，而羅斯菌屬和毛螺旋菌屬菌群豐度顯著降低。膽囊結石可導致多種消化系統并發癥并導致炎癥。有研究[11-13]表明，與健康自愿者相比，膽囊結石患者腸道微生物群中變形桿菌、藍細菌門、梭桿菌門、螺旋體（Spirochaetes）門等菌群豐度顯著增加，而糞桿菌（Faecalibacterium）屬、毛螺旋菌屬和羅斯菌屬菌群豐度明顯降低。本研究比較了結直腸癌患者中正常膽囊、膽囊結石伴膽囊炎和膽囊切除術后患者的微生物組成，進一步確定與結直腸癌發展密切相關的菌群。
人體內腸道菌群組成復雜，其中主要為擬桿菌門和厚壁菌門 [14]。本研究也證實3組樣本的優勢菌門分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門、梭桿菌門和疣微菌門。高豐度的瘤胃球菌和擬桿菌會促進腸道炎癥反應，增加患結直腸癌的風險，而乳酸桿菌、雙歧桿菌和產丁酸鹽細菌能夠保護腸黏膜，減輕腸道炎癥反應[15-16]。Ohigashi等[17]分析結直腸癌患者腸道菌群變化發現，常見的菌群改變特點是條件致病菌的數量明顯增加和產丁酸鹽細菌的數量明顯減少。產丁酸鹽細菌是腸道內通過發酵膳食纖維產生大量短鏈脂肪酸的一類細菌。短鏈脂肪酸尤其是丁酸鹽、丙酸鹽和乙酸鹽，通過調節局部免疫反應和保護腸道屏障，在維持結腸黏膜的正常生理功能方面發揮著至關重要的作用[18]。丁酸鹽的抗腫瘤作用與丁酸鹽抑制結腸細胞和免疫細胞中的組蛋白去乙酰化酶活性，從而下調促炎細胞因子并誘導結直腸癌細胞凋亡有關，丁酸鹽和丙酸鹽通過調節結腸T細胞分化來塑造黏膜免疫系統[19]。除了抗癌作用外，短鏈脂肪酸在腸道中還具有抗炎作用，丁酸鹽在腸上皮細胞中通過降低白細胞介素-8的表達和抑制誘導型一氧化氮合酶的表達來調節結腸炎癥[20]。丁酸鹽通過影響自由基清除蛋白質的表達和谷胱甘肽S-轉移酶（一種負責代謝潛在致癌物的蛋白質）活性來減輕氧化應激，保護腸黏膜細胞免受DNA氧化損傷[21]。已知產丁酸鹽的細菌有瘤胃球菌屬、梭菌屬、糞球菌屬和羅斯菌屬 [22]。Wu等[11]分析膽囊結石患者與健康自愿者腸道微生物群發現，糞桿菌屬、毛螺旋菌屬和羅斯菌屬在膽囊結石患者組菌群豐度明顯降低。本研究中，與正常膽囊+結直腸癌組相比，膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組的擬桿菌屬、羅斯菌屬、梭菌屬、毛螺旋菌屬及疣微菌門的相對豐度均降低，而普氏菌屬、梭桿菌屬和梭桿菌門的相對豐度均增高。該結果提示，長期患膽囊結石伴膽囊炎會引起腸道菌群紊亂，但是否直接影響結直腸癌的發生發展仍需要進一步的大規模研究來驗證。
膽囊具有吸收和分泌功能，有助于膽汁流入腸道，因此膽囊疾病患者易患消化道腫瘤[23]。膽囊結石患者常伴有慢性膽囊炎，長期反復的炎癥刺激易引起膽汁酸代謝紊亂，導致腸黏膜結構的改變，從而誘發腸炎，而腸炎反復發作則會導致腸道組織產生息肉，增加結直腸癌的發病率風險[24]。Keren等[12]分析比較膽囊結石患者膽囊切除術前后糞便微生物群變化發現，擬桿菌門的豐度在膽囊切除術后明顯增加。Grigor’eva等[25]研究表明，膽囊切除術前后擬桿菌門豐度幾乎沒有變化，本研究結果與此相同。Wang等[26]研究比較了膽囊切除術后患者糞便微生物與健康人群發現的細菌種類沒有差異，但群落豐度顯著降低，在膽囊切除術患者中，擬桿菌屬、普氏菌屬、脫硫弧菌（Desulfovibrio）屬、巴尼斯菌（Barnesiella）屬、帕魯菌（Paludibacter）屬和另枝菌（Alistipes）屬的群落豐度均降低，而厭氧棒狀菌（Anaerostipes）屬、多爾菌（Dorea）屬和腸球菌屬的豐度均增高。本研究中，與正常膽囊+結直腸癌組相比，膽囊切除+結直腸癌組的梭菌屬、腸球菌屬、阿克曼菌屬和疣微菌門的相對豐度降低，互養菌門的相對豐度增高。
擬桿菌屬是重要的臨床病原體，存在于大多數厭氧感染中，相關死亡率超過19%，當這些細菌停留在腸道中時，它們通常與宿主保持著一種復雜且有益的關系，當它們脫離這種共生狀態時會導致嚴重的病理狀態，包括在身體多個部位形成菌血癥和膿腫[27]。基因組學和蛋白質組學的分析極大地加深了我們對擬桿菌屬等物種適應人類腸道環境并在其中生長方式的理解[28]。例如：① 感知和適應營養供應的復雜系統；② 多泵系統排出有毒物質；③ 影響宿主免疫系統以控制其他（競爭的）病原體的能力。在所有厭氧病原體中，擬桿菌屬具有最高的耐藥率[29]。臨床上，擬桿菌屬對許多抗生素的耐藥性增加，包括頭孢西丁、克林霉素、甲硝唑、碳青霉烯類和氟喹諾酮類藥物（如加替沙星、左氧氟沙星和莫西沙星）。本研究中，擬桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低。提示長期患膽囊結石伴膽囊炎可能會破壞人體與腸道菌群互利共生的平衡狀態，從而影響疾病的發生發展。
梭桿菌屬是一種革蘭陰性厭氧菌，是健康人口腔和胃腸道微生物群中天然存在的共生微生物之一，一直被認為是一種條件致病菌[30-31]。有研究[32]發現，梭桿菌屬可以穿透腫瘤細胞并引起促炎細胞因子的釋放，包括IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α，幫助構建結直腸癌發生的免疫微環境。梭桿菌屬相關結直腸癌的潛在機制[33]包括：① 突變的上皮細胞導致局部腸道屏障受損，這使梭桿菌屬有機會黏附并侵入上皮細胞。一旦梭桿菌黏附素A（fusobacterium adhesin A，FadA；梭桿菌屬的一種膜蛋白）與E-鈣黏蛋白結合并被上皮細胞內化，β-連環蛋白信號通路就會被激活。② 磷酸化的β-catenin會從細胞質進入細胞核，促進核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）基因、促炎基因和許多其他癌基因的表達。 ③ 惡性腫瘤的腸道微環境是缺氧和酸性的，梭桿菌屬比其他細菌更適合在此條件下繁殖。梭桿菌屬引起髓系來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的富集，進而抑制抗腫瘤免疫并促進結直腸黏膜細胞癌變的發生。Keren等[12]研究發現，梭桿菌門在健康自愿者組的相對豐度較膽囊切除術組明顯降低。本研究發現，梭桿菌門的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組增高，與膽囊切除+結直腸癌組相比差異無統計學意義（P>0.05），與正常膽囊+結直腸癌組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。與膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組相比，梭桿菌屬和白細胞介素-6在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組明顯增高，且差異均具有統計學意義（P<0.05）。由此提示：長期患膽囊結石伴膽囊炎的患者，腸道中梭桿菌屬的富集可能促進了炎癥細胞因子（如白細胞介素-6）的釋放，為腸道創造了一個腫瘤發生的免疫微環境，引起腸道長期的慢性炎癥，進而促進結直腸癌的發生發展。這與之前的研究認為膽囊切除術后梭桿菌屬富集促進結直腸癌的發生發展的研究結論不一致。可能的原因是膽囊切除術之前長期膽囊結石伴膽囊炎已經引起腸道菌群的改變，甚至導致癌前病變。
綜上所述，腸道菌群的種類與數量平衡狀態發生改變在結直腸癌的發生發展及治療機制中起著關鍵作用，腸道菌群失調會影響免疫和化學治療，以及藥物的療效。所以，臨床醫生在結直腸癌的診治過程中，不僅要盡量全面評估患者腸道微生態，還要盡量謹慎、嚴格地使用抗生素等藥物，避免破壞腸道菌群。本研究結果提示：長期患膽囊結石伴膽囊炎及膽囊切除術后會導致腸道菌群種類和數量的改變，但是否會增加患結直腸癌的風險，還需大規模的長期隨訪研究加以驗證；更加深入探討膽囊結石伴膽囊炎和膽囊切除術后特定菌群改變與結直腸癌發生發展的機制，為腸道微生態相關疾病的預防、診斷和治療提供新思路。調節腸道菌群或添加益生菌對免疫和化學治療有益，甚至在未來的某一天，益生菌會在致癌過程中破壞腫瘤細胞。建議臨床醫生應嘗試使用益生菌來維持和改善腸道微生態平衡，從而預防結直腸癌的發生。
重要聲明
利益沖突聲明： 本研究中的全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。
作者貢獻聲明： 李晶晶負責文章撰寫及數據收集；朱成章負責輔助撰稿及統計學分析；史新龍和杜斌斌負責倫理審批及稿件修改；楊熊飛負責跟進整個研究進度。
倫理聲明： 本研究方案通過了甘肅省人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號： 2021-278）。
隨著代謝組學和基因測序技術在分子生物學中的應用及發展，發現腸道菌群改變與結直腸癌的發生發展關系緊密[1]。膽囊結石是膽道系統的常見疾病，從無癥狀的膽囊結石（多由體檢發現）到有癥狀的膽囊結石（膽絞痛、上腹隱痛、惡心、嘔吐），再到有并發癥的膽囊結石（包括膽囊炎、繼發性膽總管結石、膽源性胰腺炎、Mirizzi綜合征及膽囊癌）。腹腔鏡膽囊切除術是治療膽囊結石的有效手段。膽囊切除術后未濃縮的膽汁大量流入腸道影響膽汁酸的腸肝循環，結腸內膽汁酸的增加改變腸黏膜的通透性，影響腸道微生物群，增加了結直腸癌的發生風險[2]。然而，有關膽囊切除術后膽汁酸代謝途徑改變進而引起患者腸道菌群發生變化，是否會導致某種具有致癌潛力的微生物群落發展，以及是否直接導致結直腸癌的發生發展知之甚少。為此，本研究采用16S rDNA高通量測序技術測定糞便微生物群組成，旨在探究膽囊結石及膽囊切除術后引起腸道菌群失調與結直腸癌發病的相關性，為預防和治療結直腸癌提供新思路。
1 資料與方法
1.1 研究對象
采用前瞻性研究方法，收集2020年6月至2021年3月期間就診于甘肅省人民醫院肛腸科的168例患者，所有患者均進行電子結腸鏡檢查及病理活檢確診為結直腸癌，經彩色多普勒超聲證實無膽管結石和膽石性息肉，收集患者的臨床資料、實驗室檢查結果和糞便樣本。所有患者均簽署知情同意書，本研究通過了甘肅省人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號：2021-278）。
1.1.1 納入標準
① 男女分布均衡、年齡46～74歲、體質量指數（body mass index，BMI） 18～23 kg/m2；② 結直腸癌患者（病理活檢確診）；③ 腹部B超、胸腹部CT或MRI檢查提示無遠處轉移；④ 患者均為在甘肅生活20年以上的本地居民，飲食結構均衡；⑤ 膽囊結石伴膽囊炎或膽囊切除病史15年以上；⑥ 膽囊切除術后2年無膽管損傷、傷口感染、膽結石殘留、膿腫形成和（或）膽管狹窄。
1.1.2 排除標準
① 年齡 <46歲或 >74歲、BMI <18 kg/m2或 >23 kg/m2；② 既往有結直腸癌手術史、胃癌手術史及婦科腫瘤手術史；③ 行新輔助放化療；④ 既往有炎癥性腸病、腸易激綜合征、慢性腹痛、腹瀉、腸梗阻、高血壓等疾病；⑤ 既往有內分泌疾病病史（如2型糖尿病、庫欣綜合征、甲狀腺功能亢進等）；⑥ 3個月內服用過免疫抑制劑、抗生素、益生菌、微生態活菌制劑、質子泵抑制劑、二甲雙胍等相關藥物；⑦ 既往有吸煙、飲酒史。
根據上述納入及排除標準，本研究最終納入29例結直腸癌患者作為研究對象，其中結直腸癌合并膽囊結石伴膽囊炎患者10例（膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組），膽囊切除術后結直腸癌患者10例（膽囊切除+結直腸癌組），膽囊正常結直腸癌患者9例（正常膽囊+結直腸癌組）。研究對象篩選流程見圖1。
圖1
示研究對象篩選流程
1.2 16S rDNA高通量測序方法
1.2.1 大便標本采集
納入研究患者于入院后第1次自然排便時用無菌勺采集患者的新鮮大便標本約10 g，盡量避免尿液、灰塵等污染，裝入已滅菌的大便收集管，立即存放于–30 ℃的冰柜中，并在6 h內置于–80 ℃冰箱冷凍保存備檢。
1.2.2 主要試劑和儀器
① 主要試劑：DNA 抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司），FastPfu DNA 聚合酶（北京全式金生物技術股份有限公司），MiSeq試劑盒v3試劑盒和TruSeq納米DNA LT文庫制備試劑盒（美國Illumina 公司），Quant-iT PicoGreen雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒（北京諾為生物技術有限公司）。② 主要儀器：移液器（法國Gilson公司），離心機（長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），PCR儀（美國應用生物系統公司），MiSeq測序儀（美國Illumina 公司）， 微孔板閱讀器 FLx800（美國BioTek儀器有限公司）， 超微量分光光度計（北京凱奧科技發展有限公司）；生物分析儀 ［安捷倫科技（中國）有限公司］。
1.2.3 DNA 提取、PCR 擴增
① DNA提取：稱取大便樣本200 mg至2 mL離心管中，然后按DNA抽提試劑盒（離心柱型）說明書進行DNA提取。② PCR擴增：抽取DNA對其定量，凝膠電泳檢測其完整性，利用引物對16S rDNA V3～V4區進行PCR擴增，PCR正向引物（V3區）為：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′；反向引物（V4區）為：5′-GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAGGACTAC HVGGGTATCTAATCC-3′。
1.2.4 文庫制備及基因測序
采用TruSeq納米DNA LT文庫制備試劑盒（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit）制備測序文庫，在DNA序列的3′ 端添加A堿基以防止DNA片段自連，在序列5′ 端添加含有文庫特異性標簽（即Index序列）的測序接頭，使DNA分子能被固定；先通過磁珠對文庫純化，再通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收，使用DNA凝膠回收試劑盒說明進行純化，對文庫做最終片段的選擇與純化。然后在生物分析儀上進行質檢，并使用Quant-iT PicoGreen雙鏈DNA熒光定量檢測試劑盒對文庫進行定量檢測，將合格的測序文庫按所需測序量等比例混合后在Illumina MiSeq平臺上進行高通量測序。
1.3 生物信息學分析
1.3.1 操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的聚類分析
使用MiSeq測序儀進行雙端測序，為提高分析結果的準確性，使用DADA2方法進行序列去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體，進行序列分析，將相似性 ≥97%的序列歸為相同的OTU，運用數據分析平臺進行樣本腸道菌群的相關性分析。
1.3.2 稀釋曲線
稀釋曲線基于Chao1、Shannon和Simpson這 3個指數值，由R軟件繪制。稀釋曲線可以用來評估所得到的數據是否足以覆蓋群落中的所有物種。當曲線趨于平緩時，表明產生的數據已足夠。否則，當曲線隨著測序工作量的增加而繼續攀升時，表明樣本的復雜性很高，仍然會有測序數據未發現的物種。
1.3.3 OTU維恩圖
根據OTU豐度，列出各組的OTU，用R軟件的Venn Diagram繪制韋恩圖。維恩圖可以直觀地顯示多樣本中常見及唯一OTU的數量，結合代表物種的OTU，可以獲得不同環境的核心微生物組。
1.3.4 物種注釋
對各樣本在各分類水平 ［如門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）和種（species）］ 的鑒定結果進行統計，并使用R軟件繪制直方圖。基于Greengene數據庫，使用QIIME2的classify-sklearn算法，將獲得的每個OTU的代表序列與數據庫進行相似性和物種注釋比較，計算每個樣本在不同分類水平上的群落組成，并用直方圖可視化。
1.3.5 單一樣本的多樣性分析即Alpha多樣性分析
通過多個指標來分析樣本物種多樣性的復雜性，包括observed species指數、 Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou’s evenness指數和Good’s coverage指數。 observed species指數和Chao1指數反映群落的物種豐富度；Shannon指數、Simpson指數和Faith’s PD指數反映群落的物種多樣性；Pielou’s evenness指數反映群落的均勻度；Good’s coverage指數反映群落的覆蓋度。在物種豐富度相同的情況下，物種均勻度越大，群落多樣性越高。使用R軟件將數據繪制成箱式圖，以直觀地展示不同樣本組之間Alpha多樣性的差異，通過Kruskal-Wallis H秩和檢驗驗證差異的顯著性，P<0.05表示差異有統計學意義。
1.3.6 樣本間多樣性分析
評估樣本間物種多樣性方面的差異采用Beta多樣性分析，即用不同的值來衡量Beta多樣性，如Bray-Curtis、加權UniFrac、未加權UniFrac、Jaccard和Pearson，尤其是前3個值。Bray-Curtis距離是反映2個群落差異的常用指標；UniFrac是利用系統進化信息來比較樣本間的群落物種組成，UniFrac距離可作為Beta多樣性的衡量指標。它考慮了物種間的進化距離，指數越大，樣本間的差異越大。
1.3.7 主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）
PCoA是一種多元統計分析方法，基于樣本距離矩陣進行降維處理，并將結果直觀地呈現在二維坐標圖中以反映組間的差異。利用QIIME2軟件中的迭代算法，根據上述計算得到的Beta多樣性指數矩陣行PCoA分析。2點在坐標軸上的投影距離越近，表明這2個樣本在相應維度中的物種組成結構越相似，故群落差異較大的樣本會遠遠分開，群落結構相似度高的樣本則傾向于聚集在一起。
1.3.8 主成分分析（principal component analysis，PCA）
為了顯示不同樣本中OTU組成的差異，采用基于物種豐度矩陣進行降維處理的PCA構建二維圖，2點在坐標軸上的投影距離越近，表明這2個樣本間的物種豐度組成在相應維度中越相似。
1.4 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件進行人口資料及實驗數據分析。 正態分布的計量資料使用均數±標準差（±s）表示，3組間比較采用Tukey-Kramer單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗；偏態分布的計量資料用中位數和四分位間距 ［M（IQR）］ 表示，組間比較使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。計數資料使用R×C 的Fisher精確檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 納入患者的基本特征
本研究前瞻性納入符合標準的結直腸癌患者29例，根據是否合并膽囊疾病分為3組，3組患者的人口特征見表1，由表1提示3組患者具有可比性。
表1
3組患者的基本特征
2.2 納入患者的實驗室檢查結果
本研究3組患者的血清白細胞介素-6、降鈣素原和總膽汁酸相比差異有統計學意義（P<0.05），但血清總膽汁酸值均在正常范圍內。其余實驗室檢查結果在3組間相比差異均無統計學意義（P>0.05），具體見表2。
表2
3組患者的實驗室檢查結果
2.3 樣本數據分析結果
通過16S rDNA高通量測序總共得到375.037 4萬條原始序列，通過質控、去噪、拼接和去嵌合體后，得到242.251 1萬條高質量擴增特征序列。通過稀釋曲線可以看出，樣本測序數據量合理，能夠反映樣本中絕大多數的微生物信息（圖2a、2b）。
圖2
示稀釋曲線（a）、Shannon曲線（b）和3組間OUT組成的韋恩圖（c）
a b c
2.4 OTU水平的韋恩分析結果
選用相似水平為97%的OTU樣本表，進行聚類，繪制韋恩圖。 3組29個樣本共產生18 039個OTU（圖2c）。
2.5 Alpha多樣性分析結果
本研究對3組樣本微生物群落多樣性進行分析比較。由observed species指數和Chao1指數可知：膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組的群落豐度較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組低，但差異無統計學意義（P>0.05），由Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou’s evenness指數和Good’s coverage指數可知，群落的物種多樣性、均勻度及覆蓋度的差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見圖3a～3g。
圖3
示Alpha多樣性分析、PCoA、PCA以及3組在門和屬水平上的菌群組成及相對豐度分析結果
a～g：Alpha多樣性分析中各指數分析結果，Chao1指數（a）、Simpson指數（b）、Shannon指數（c）、Pielou’s evenness 指數（d）、observed species指數（e）、Faith’s PD指數（f）、Good’s coverage指數（g）；h：基于Weighted Unifrac距離的PCoA結果；i：3組在OTU水平上的PCA結果；j、k：3組在門（j）和屬（k）水平上的菌群組成及相對豐度分析結果
2.6 Beta多樣性分析結果
為了進一步顯示樣本間物種多樣性的差異，采用PCoA來顯示樣本間的差異。PCoA結果中：坐標軸括號中的百分比代表了對應的坐標軸所能解釋的樣本差異數據（距離矩陣）的比例。具體見圖3h，圖中1個點代表1個樣本，不同的顏色代表不同的組。其結果顯示3組之間的細菌群落組成區分不明顯。
2.7 PCA結果
PCA結果中：X軸代表第一主成分，Y軸代表第二主成分；括號中的47.7%代表PC1成分對樣本的貢獻，19.8%代表PC2成分對樣本的貢獻，具體見圖3i，圖中1個點代表1個樣本，不同的顏色代表不同的組。其結果顯示3組之間的物種豐度組成區分不明顯。
2.8 群落結構分析結果
2.8.1 門水平的群落組成分析結果
在門水平上，3組樣本中擬桿菌（Bacteroidetes）門、厚壁菌（Firmicutes）門、變形桿菌（Proteobacteria）門、梭桿菌（Fusobacteria）門和疣微菌（Verrucomicrobia）門的相對豐度都較高，幾乎占據了腸道細菌總量的95%以上。其中梭桿菌門的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組升高（Z=–2.104，P=0.035）；疣微菌門的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組升高（Z=–2.207，P=0.027；Z=–2.027，P=0.042）；膽囊切除+結直腸癌組的互養菌（Synergistetes）門的相對豐度較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.304，P=0.021；Z=–2.410，P=0.016），見圖3j。
2.8.2 屬水平的群落組成分析
在屬水平上，擬桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.268，P=0.023；Z=–2.342，P=0.019）；羅斯菌（Roseburia）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.297，P=0.021；Z=–1.988，P=0.047）；志賀桿菌（Shigella）屬的相對豐度在膽囊切除+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組增高（Z=–2.192，P=0.028）；毛螺旋菌（Lachnospira）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–1.967，P=0.049）；普氏菌（Prevotella）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.859，P=0.004；Z=–2.843，P=0.004）；梭桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組增高（Z=–2.085，P=0.037；Z=–2.170，P=0.030）；梭菌（Clostridium）屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組較正常膽囊+結直腸癌組降低（Z=–2.043，P=0.041；Z=–2.043，P=0.041）；腸球菌（Enterococcus）屬的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組增高（Z=–2.121，P=0.033）；阿克曼菌（Akkermansia）屬的相對豐度在正常膽囊+結直腸癌組較膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組和膽囊切除+結直腸癌組增高（Z=–2.134，P=0.032；Z=–2.067，P=0.038）。具體見圖3k。
3 討論
腸道菌群作為人體內最大的微生物群體，在人類疾病預防和治療中的作用逐漸被重視。伴隨著高通量測序技術的廣泛使用，人們逐漸發現腸道菌群參與人體內環境穩態及皮脂溢出、腎臟疾病、炎癥性腸病、婦科腫瘤等疾病的發生與發展[3-5]。此外，不良的飲食習慣、醫源性抗生素等藥物的濫用及益生菌的廣泛使用也會影響腸道菌群結構的變化。
已經有動物實驗證實腸道微生物群落的改變可以促進結直腸癌的發生和發展。 Wong等[6]和Jobin等[7]的研究將結直腸癌患者和健康自愿者的糞便菌群移植到無菌小鼠和常規小鼠體內，喂食結直腸癌患者糞便的常規小鼠與喂食健康自愿者糞便的常規小鼠相比，表現為腸道細胞高度不典型增生和肉眼可見的息肉明顯增多；與喂食健康自愿者糞便的無菌小鼠相比，喂食結直腸癌患者糞便的無菌小鼠表現為結腸細胞異常增殖，但兩種小鼠的糞便菌群豐度均下降。因此有充分理由認為，將結直腸癌患者的糞便樣本進行灌胃會促進無菌小鼠和常規小鼠的腸道發生癌變。有研究[8-10]發現，與健康自愿者相比，結直腸癌患者腸道中梭桿菌門、變形菌門、梭桿菌屬、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）屬、腸球菌屬、大腸桿菌/志賀菌（Escherichia/Shigella）屬、克雷伯桿菌（Klebsiella）屬、鏈球菌（Streptococcus）屬、瘤胃球菌屬、糞芽孢菌（Coprobacillus）屬、伯克霍爾德菌（Burkholderia）屬、卟啉單胞菌（Porphyromonas）屬、副球菌（Paracoccus）、嗜胨菌屬（Peptoniphilus）屬、聚球藻（Synechococcus）屬、藍絲菌（Cyanothece）屬、梭菌屬、消化鏈球菌（Peptostreptococcus）屬等菌群豐度顯著升高，而羅斯菌屬和毛螺旋菌屬菌群豐度顯著降低。膽囊結石可導致多種消化系統并發癥并導致炎癥。有研究[11-13]表明，與健康自愿者相比，膽囊結石患者腸道微生物群中變形桿菌、藍細菌門、梭桿菌門、螺旋體（Spirochaetes）門等菌群豐度顯著增加，而糞桿菌（Faecalibacterium）屬、毛螺旋菌屬和羅斯菌屬菌群豐度明顯降低。本研究比較了結直腸癌患者中正常膽囊、膽囊結石伴膽囊炎和膽囊切除術后患者的微生物組成，進一步確定與結直腸癌發展密切相關的菌群。
人體內腸道菌群組成復雜，其中主要為擬桿菌門和厚壁菌門 [14]。本研究也證實3組樣本的優勢菌門分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門、梭桿菌門和疣微菌門。高豐度的瘤胃球菌和擬桿菌會促進腸道炎癥反應，增加患結直腸癌的風險，而乳酸桿菌、雙歧桿菌和產丁酸鹽細菌能夠保護腸黏膜，減輕腸道炎癥反應[15-16]。Ohigashi等[17]分析結直腸癌患者腸道菌群變化發現，常見的菌群改變特點是條件致病菌的數量明顯增加和產丁酸鹽細菌的數量明顯減少。產丁酸鹽細菌是腸道內通過發酵膳食纖維產生大量短鏈脂肪酸的一類細菌。短鏈脂肪酸尤其是丁酸鹽、丙酸鹽和乙酸鹽，通過調節局部免疫反應和保護腸道屏障，在維持結腸黏膜的正常生理功能方面發揮著至關重要的作用[18]。丁酸鹽的抗腫瘤作用與丁酸鹽抑制結腸細胞和免疫細胞中的組蛋白去乙酰化酶活性，從而下調促炎細胞因子并誘導結直腸癌細胞凋亡有關，丁酸鹽和丙酸鹽通過調節結腸T細胞分化來塑造黏膜免疫系統[19]。除了抗癌作用外，短鏈脂肪酸在腸道中還具有抗炎作用，丁酸鹽在腸上皮細胞中通過降低白細胞介素-8的表達和抑制誘導型一氧化氮合酶的表達來調節結腸炎癥[20]。丁酸鹽通過影響自由基清除蛋白質的表達和谷胱甘肽S-轉移酶（一種負責代謝潛在致癌物的蛋白質）活性來減輕氧化應激，保護腸黏膜細胞免受DNA氧化損傷[21]。已知產丁酸鹽的細菌有瘤胃球菌屬、梭菌屬、糞球菌屬和羅斯菌屬 [22]。Wu等[11]分析膽囊結石患者與健康自愿者腸道微生物群發現，糞桿菌屬、毛螺旋菌屬和羅斯菌屬在膽囊結石患者組菌群豐度明顯降低。本研究中，與正常膽囊+結直腸癌組相比，膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組的擬桿菌屬、羅斯菌屬、梭菌屬、毛螺旋菌屬及疣微菌門的相對豐度均降低，而普氏菌屬、梭桿菌屬和梭桿菌門的相對豐度均增高。該結果提示，長期患膽囊結石伴膽囊炎會引起腸道菌群紊亂，但是否直接影響結直腸癌的發生發展仍需要進一步的大規模研究來驗證。
膽囊具有吸收和分泌功能，有助于膽汁流入腸道，因此膽囊疾病患者易患消化道腫瘤[23]。膽囊結石患者常伴有慢性膽囊炎，長期反復的炎癥刺激易引起膽汁酸代謝紊亂，導致腸黏膜結構的改變，從而誘發腸炎，而腸炎反復發作則會導致腸道組織產生息肉，增加結直腸癌的發病率風險[24]。Keren等[12]分析比較膽囊結石患者膽囊切除術前后糞便微生物群變化發現，擬桿菌門的豐度在膽囊切除術后明顯增加。Grigor’eva等[25]研究表明，膽囊切除術前后擬桿菌門豐度幾乎沒有變化，本研究結果與此相同。Wang等[26]研究比較了膽囊切除術后患者糞便微生物與健康人群發現的細菌種類沒有差異，但群落豐度顯著降低，在膽囊切除術患者中，擬桿菌屬、普氏菌屬、脫硫弧菌（Desulfovibrio）屬、巴尼斯菌（Barnesiella）屬、帕魯菌（Paludibacter）屬和另枝菌（Alistipes）屬的群落豐度均降低，而厭氧棒狀菌（Anaerostipes）屬、多爾菌（Dorea）屬和腸球菌屬的豐度均增高。本研究中，與正常膽囊+結直腸癌組相比，膽囊切除+結直腸癌組的梭菌屬、腸球菌屬、阿克曼菌屬和疣微菌門的相對豐度降低，互養菌門的相對豐度增高。
擬桿菌屬是重要的臨床病原體，存在于大多數厭氧感染中，相關死亡率超過19%，當這些細菌停留在腸道中時，它們通常與宿主保持著一種復雜且有益的關系，當它們脫離這種共生狀態時會導致嚴重的病理狀態，包括在身體多個部位形成菌血癥和膿腫[27]。基因組學和蛋白質組學的分析極大地加深了我們對擬桿菌屬等物種適應人類腸道環境并在其中生長方式的理解[28]。例如：① 感知和適應營養供應的復雜系統；② 多泵系統排出有毒物質；③ 影響宿主免疫系統以控制其他（競爭的）病原體的能力。在所有厭氧病原體中，擬桿菌屬具有最高的耐藥率[29]。臨床上，擬桿菌屬對許多抗生素的耐藥性增加，包括頭孢西丁、克林霉素、甲硝唑、碳青霉烯類和氟喹諾酮類藥物（如加替沙星、左氧氟沙星和莫西沙星）。本研究中，擬桿菌屬的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組較膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組降低。提示長期患膽囊結石伴膽囊炎可能會破壞人體與腸道菌群互利共生的平衡狀態，從而影響疾病的發生發展。
梭桿菌屬是一種革蘭陰性厭氧菌，是健康人口腔和胃腸道微生物群中天然存在的共生微生物之一，一直被認為是一種條件致病菌[30-31]。有研究[32]發現，梭桿菌屬可以穿透腫瘤細胞并引起促炎細胞因子的釋放，包括IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α，幫助構建結直腸癌發生的免疫微環境。梭桿菌屬相關結直腸癌的潛在機制[33]包括：① 突變的上皮細胞導致局部腸道屏障受損，這使梭桿菌屬有機會黏附并侵入上皮細胞。一旦梭桿菌黏附素A（fusobacterium adhesin A，FadA；梭桿菌屬的一種膜蛋白）與E-鈣黏蛋白結合并被上皮細胞內化，β-連環蛋白信號通路就會被激活。② 磷酸化的β-catenin會從細胞質進入細胞核，促進核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）基因、促炎基因和許多其他癌基因的表達。 ③ 惡性腫瘤的腸道微環境是缺氧和酸性的，梭桿菌屬比其他細菌更適合在此條件下繁殖。梭桿菌屬引起髓系來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的富集，進而抑制抗腫瘤免疫并促進結直腸黏膜細胞癌變的發生。Keren等[12]研究發現，梭桿菌門在健康自愿者組的相對豐度較膽囊切除術組明顯降低。本研究發現，梭桿菌門的相對豐度在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組增高，與膽囊切除+結直腸癌組相比差異無統計學意義（P>0.05），與正常膽囊+結直腸癌組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。與膽囊切除+結直腸癌組和正常膽囊+結直腸癌組相比，梭桿菌屬和白細胞介素-6在膽囊結石伴膽囊炎+結直腸癌組明顯增高，且差異均具有統計學意義（P<0.05）。由此提示：長期患膽囊結石伴膽囊炎的患者，腸道中梭桿菌屬的富集可能促進了炎癥細胞因子（如白細胞介素-6）的釋放，為腸道創造了一個腫瘤發生的免疫微環境，引起腸道長期的慢性炎癥，進而促進結直腸癌的發生發展。這與之前的研究認為膽囊切除術后梭桿菌屬富集促進結直腸癌的發生發展的研究結論不一致。可能的原因是膽囊切除術之前長期膽囊結石伴膽囊炎已經引起腸道菌群的改變，甚至導致癌前病變。
綜上所述，腸道菌群的種類與數量平衡狀態發生改變在結直腸癌的發生發展及治療機制中起著關鍵作用，腸道菌群失調會影響免疫和化學治療，以及藥物的療效。所以，臨床醫生在結直腸癌的診治過程中，不僅要盡量全面評估患者腸道微生態，還要盡量謹慎、嚴格地使用抗生素等藥物，避免破壞腸道菌群。本研究結果提示：長期患膽囊結石伴膽囊炎及膽囊切除術后會導致腸道菌群種類和數量的改變，但是否會增加患結直腸癌的風險，還需大規模的長期隨訪研究加以驗證；更加深入探討膽囊結石伴膽囊炎和膽囊切除術后特定菌群改變與結直腸癌發生發展的機制，為腸道微生態相關疾病的預防、診斷和治療提供新思路。調節腸道菌群或添加益生菌對免疫和化學治療有益，甚至在未來的某一天，益生菌會在致癌過程中破壞腫瘤細胞。建議臨床醫生應嘗試使用益生菌來維持和改善腸道微生態平衡，從而預防結直腸癌的發生。
重要聲明
利益沖突聲明： 本研究中的全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。
作者貢獻聲明： 李晶晶負責文章撰寫及數據收集；朱成章負責輔助撰稿及統計學分析；史新龍和杜斌斌負責倫理審批及稿件修改；楊熊飛負責跟進整個研究進度。
倫理聲明： 本研究方案通過了甘肅省人民醫院醫學倫理委員會的審批（批文編號： 2021-278）。
