引用本文： 楊令鵬, 邱逸聞, 楊先偉, 沈舒, 王文濤. 泡型肝包蟲病手術安全切除距離的初步研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(4): 512-516. doi: 10.7507/1007-9424.202201034 復制
包蟲病是一種嚴重的人畜共患性疾病[1]，目前我國是包蟲病流行最為嚴重的國家。泡型肝包蟲病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）又稱作肝泡狀棘球蚴病。泡狀棘球蚴在肝內生長速度緩慢、潛伏時間長，病程進展隱匿[2]，其生長方式類似于腫瘤呈浸潤性生長，因此HAE的首選治療為手術切除[2-3]。然而即使是根治性的手術切除，在術后長期隨訪中還是存在復發[4]。HAE病灶無明顯包膜，與肝組織分界不清，手術切除既要將病灶完整切除以保證術后不復發，又要保留足夠多的正常肝組織供機體代謝，因此手術切除的范圍顯得尤為重要。Brunetti等[2]編寫的專家共識推薦的手術切緣是2 cm，即肝切除的斷面到病灶邊緣肉眼下至少要達到2 cm距離。對于晚期HAE患者，遵從2 cm的手術切緣在臨床實際中是很困難的。有研究[5]表明，切緣小于1 cm的R1切除，只要輔以阿苯達唑的長期治療也能到達與R0切除相近的生存率。但目前仍然缺乏前瞻性的隨機對照試驗來明確手術根治性切除的安全切緣，以保證術后HAE患者不再復發。
盡管有研究報道并比較了HAE根治性切除和姑息性切除術后患者的預后情況，但其中很少有研究描述其根治性切除的手術切緣。Cox1基因位于泡狀棘球蚴的線粒體中，目前已廣泛應用于包蟲的鑒別診斷以及亞種分析[6-7]。Liu等[8]利用Cox1基因對86份絳蟲感染的動物樣本進行細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲以及石渠棘球絳蟲感染的鑒別診斷，Cox1基因診斷的特異度高達100%。泡狀棘球蚴感染人體定植于肝臟后會引起局部肝組織變性、壞死以及肝纖維化[9]。泡狀棘球蚴生長浸潤的直接證據即泡狀棘球蚴蟲體本身，然而病灶旁正常的肝組織中并沒有觀察到泡狀棘球蚴的存在[10]。因此本研究收集HAE患者術后標本，利用PCR定量檢測肝組織中泡狀棘球蚴特異性基因Cox1的表達量，以及利用病理切片定量評價肝組織纖維化的程度來初步探索泡狀棘球蚴在肝臟中的浸潤范圍，從而為HAE根治性切除的范圍提供一定的理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本收集與分組
前瞻性收集2019年1月至2019年6月期間在四川大學華西醫院接受手術治療的20例HAE患者的術后組織標本。納入標準：① 病史、術前血清學、影像學及術后病理均支持HAE的診斷；② 肝內單發病灶；③ 初次接受HAE根治性肝切除術。排除標準：① 合并肝血管瘤、肝內原發性惡性腫瘤等其他肝臟占位性疾病者；② 肝內多發病灶；③ 術前發現有肺、腦等遠處臟器轉移。每例患者收集同時含有病灶與病灶旁肝組織的交界標本共3塊，將其中1塊放入10%甲醛溶液中固定24 h以上；另外2塊組織以交界處為起點，沿正常肝組織方向，距離病灶由近及遠間隔0.5 cm將病灶旁肝組織塊分割成4個小塊，依次分為0～0.5 cm肝組織組（0 cm<距離≤0.5 cm）、0.5～1.0 cm肝組織組（0.5 cm<距離≤1.0 cm）、1.0～1.5 cm肝組織組（1.0 cm<距離≤1.5 cm）和1.5～2.0 cm肝組織組（1.5 cm<距離≤2.0 cm），剩下的病灶組織為病灶組，見圖1。將切割后的組織塊分裝后放入液氮中冷凍保存。本研究已通過四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準 ［批文編號：2018年審（362）號］，所有患者均知情且簽署了知情同意書。
圖1
示病灶組織取材及分組示意圖
L代表病灶組，A代表0～0.5 cm肝組織組，B代表0.5～1.0 cm肝組織組，C代表1.0～1.5 cm肝組織組，D代表1.5～2.0 cm肝組織組
1.2 主要試劑
Masson染色試劑盒及蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購自碧云天公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生化公司；引物由成都擎科生物有限公司合成；PCR試劑盒購自上海東洋紡生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 組織病理學染色
固定好的組織經脫水、浸蠟、透明后包埋、切片，分別行HE染色和Masson染色。操作均按試劑盒說明書進行。
1.3.2 鏡下圖像采集與肝纖維化分析
分別在病灶組、0～0.5 cm肝組織組、0.5～1.0 cm肝組織組、1.0～1.5 cm肝組織組和1.5～2.0 cm肝組織組切片中隨機采集5張400倍鏡下Masson染色不重復的視野，然后利用Image-Pro Plus 6.0軟件計算每個區域視野下藍色的膠原纖維面積來代表肝纖維化程度，面積大小用像素密度來表示，最后計算其平均值。
1.3.3 定量PCR檢測Cox1的絕對表達量
將冷凍保存的每一塊肝臟組織標本剪碎混勻，分別取出50 mg組織放入研缽中進行充分研磨，用DNA提取試劑盒參照說明書提取肝臟組織總的DNA，應用NanoDrop 2000紫外/可見分光光度計檢測DNA濃度及純度，最后將樣品冷凍保存。Cox1基因引物由成都擎科生物有限公司合成：正向引物為5′-TTTTGGCTGCTGCTATTACTATG-3′，反向引物為5′-GATCACCACCACCTAACGGA-3′。目標基因片段PCR擴增40個循環后，檢測有無非特異擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。標準品制備：將上述PCR產物純化后與pMD19-T載體連接。將連接產物轉染感受態大腸桿菌，在無抗Luria-Bertani（LB）液體的培養基內培養1 h，然后在含氨芐西林的LB平板上進行篩選，挑取陽性克隆，采用質粒提取試劑盒提取質粒（操作按試劑盒說明書進行），經PCR鑒定后，陽性克隆送往成都擎科生物有限公司測序。之后用核酸測定儀測定陽性質粒的A260值。計算質粒拷貝數（copies/μL）=6.02×1 023（copies/moL）×質粒的質量濃度（g/μL）/質粒分子量（g/moL）。繪制標準曲線：取A260/A280介于1.8～2.0的陽性質粒作為標準品，將其10倍稀釋，分別稀釋成1×10–6～1×10–2 copies/μL的5個梯度作為模板，進行熒光定量PCR，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數（Ct）為縱坐標，陽性模板數的對數為橫坐標，即可繪出標準曲線，計算Cox1基因的表達量。
1.4 統計學方法
所有統計分析均使用GraphPad Prism 8.0完成。對計量資料采用K-S法檢驗其正態性，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多組間比較采用配伍設計的方差分析。計量資料之間的關系采用Pearson相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝臟組織的纖維化程度
病灶部分可見大量粗大、雜亂的纖維組織，其間夾雜有大小不等的囊泡；病灶旁肝臟內纖維組織較少，呈彌漫性分布在正常肝細胞之間，且主要集中于匯管區及中央靜脈周圍（圖2a～2e）。
圖2
示病灶和病灶旁肝組織的纖維化程度（Masson染色 ×400）、5 組肝組織中的纖維化面積和 Cox1 表達量比較及兩者之間的關系散點圖
a～e：分別為0～0.5 cm肝組織組（a）、0.5～1.0 cm肝組織組（b）、1.0～1.5 cm肝組織組（c）、1.5～2.0 cm肝組織組（d）、病灶組（e）的Masson染色結果；f、g：5 組肝組織的纖維化面積（f）和Cox1表達量（g）比較，*表示
利用Image-Pro Plus軟件分別計算病灶與病灶旁肝組織鏡下的纖維化面積，結果示病灶的纖維化面積大于病灶旁肝組織（P<0.000 1），說明病灶的纖維化程度高于病灶旁肝組織；另外對病灶旁肝組織的纖維化面積進行比較，結果表明4個病灶旁肝組織組之間的纖維化面積比較差異沒有統計學意義（P>0.05），見圖2f。
2.2 Cox1表達量的絕對定量分析
標準曲線的相關系數為99.73%，擴增效率為0.866，線性關系式為y=–3.776 3x+44.043，相關參數符合絕對定量要求。采用實時熒光定量PCR方法對20例HAE患者的病灶及其病灶旁肝組織的Cox1表達量進行絕對定量分析的結果顯示，Cox1表達量在病灶組織中高于病灶旁肝組織（P<0.000 1）；對于病灶旁肝組織，4個組的Cox1表達量的差異無統計學意義（P>0.05），圖2g。
2.3 Cox1表達量與鏡下纖維化面積的相關性
各組的Cox1表達量與其纖維化面積均呈正相關關系（圖2h～2l）。病灶組：r=0.6872，P=0.0008；0～0.5 cm肝組織組：r=0.5762，P=0.0078；0.5～1.0 cm肝組織組：r=0.4871，P=0.0294；1.0～1.5 cm肝組織組：r=0.5849，P=0.0068；1.5～2.0 cm肝組織組：r=0.7180，P=0.0004。
3 討論
泡狀棘球蚴定植于肝臟后類似于惡性腫瘤向外浸潤性的生長方式決定了HAE患者首選治療方法為根治性切除術，即手術操作需要將包蟲病灶完全切除才能達到根治目的。溫浩[11]認為，在HAE病灶周邊存在決定病灶不斷向外周肝組織侵犯的“浸潤帶”，術中只要切除“浸潤帶”就能達到根治，因此提出1 cm的切除范圍。而Uchino等[12]在切緣至少為2 cm的患者中未發現復發，因此主張術中的切除范圍應至少達到2 cm。然而對于晚期包蟲病患者，當病灶侵犯了肝內血管、下腔靜脈時遵從以上兩個手術切緣在臨床實際中是極其困難的。因此本研究收集了 20例HAE患者術后的標本，定量檢測肝組織中泡狀棘球蚴Cox1的表達量以及通過定量評價肝組織纖維化的程度來初步探索泡狀棘球蚴在肝臟中的浸潤范圍，為HAE根治性切除的范圍提供一定的理論依據。
3.1 肝組織中的Cox1表達量
目前國外研究者[4]認為HAE的手術切緣至少要達到2 cm才能避免術后復發，然而這一標準要求過于嚴格，大量包蟲病患者在就診時疾病已經進展到中晚期，這部分患者難以達到2 cm手術切緣的要求。因此為了探究一個更為合理的切緣，本研究以2 cm作為一個界點，選擇病灶及病灶旁2 cm以內的肝組織作為研究對象。泡狀棘球蚴在肝臟定植后向外周呈現緩慢浸潤式的生長，其病灶呈類圓形樣向外周增大，常理上Cox1基因在病灶旁肝組織中應該有一個明顯的逐級遞減的趨勢。本研究的檢測結果顯示病灶中Cox1的表達量遠遠高于病灶旁肝組織，然而2 cm以內的4個病灶旁肝組織組Cox1表達量之間的差異并沒有統計學意義。在最近一項研究中，Baraquin等[13]利用PCR檢測了HAE患者外周血中游離的泡狀棘球蚴DNA片段，定性檢測結果呈陽性，但兩個目標基因（核基因U1 snRNA和線粒體基因Nad5）在患者的外周血中含量很少。本研究檢測的Cox1基因與該研究檢測的Nad5基因同為泡狀棘球蚴的線粒體基因，因此泡狀棘球蚴的Cox1基因可能同樣存在于HAE患者的外周血中，這在一定程度上解釋了為何本研究檢測的Cox1基因在病灶旁肝組織內仍有表達。在以往腫瘤組織的研究[14]中，胞外囊泡被認為是循環游離DNA的來源。Ancarola等[15]發現絳蟲同樣能分泌胞外囊泡，遺憾的是研究者們并未檢測囊泡中是否含該蟲體的特異性基因片段。本研究在包蟲病灶旁肝組織中檢測到的Cox1基因很有可能跟腫瘤患者體內的循環游離DNA類似，由胞外囊泡攜帶并隨血液循環播散所致。
3.2 肝組織的纖維化程度
同PCR檢測的取材標準一樣，該研究選取病灶及病灶旁2 cm以內的肝組織作為評價纖維化程度的研究對象。因此本研究采集病灶及病灶旁肝組織行Masson染色后400倍鏡下的視野，參照Horai等[16]的方法，利用圖像軟件Image-Pro Plus計算視野中的纖維化面積來代表肝臟纖維化的程度，經統計分析后發現，病灶部分的纖維化面積大于病灶旁肝組織區域，然而距病灶2 cm以內的4個病灶旁肝組織組的纖維化面積比較差異沒有統計學意義。病灶旁肝組織纖維化定量分析的結果與病灶旁肝組織鏡下纖維化呈彌漫狀分布的表現是相符合的。陽丹才讓等[17]收集了HAE病灶邊緣帶的肝組織及距病灶5 cm以外的正常肝組織，經Masson染色后采用半定量的纖維化評分系統比較兩者之間的纖維化程度的結果表明，病灶邊緣帶的肝組織纖維化程度高于距病灶5 cm以外的正常肝組織。這與本研究的研究結果不太一致，原因可能是兩項研究的取材標準不一樣。本研究收集的標本是病灶邊緣至距離病灶邊緣2 cm范圍內的肝組織，而陽丹才讓等研究者收集的標本是距病灶5 cm以外的肝組織。
3.3 Cox1表達量與肝纖維化程度的相關性
最后本研究對病灶和病灶旁肝組織的纖維化面積和Cox1表達量做了相關性分析，結果顯示無論是病灶組還是病灶旁2 cm以內的4個肝組織組，兩者之間均存在正相關關系。各組纖維化的面積與Cox1表達量兩者之間相關，由于病灶部分是泡狀棘球蚴感染后最初在肝臟定植的區域，因此不論纖維化程度還是Cox1的表達量都較病灶旁肝組織高。病灶旁各肝組織組之間纖維化程度差異沒有統計學意義的原因可能是由于病灶中的蟲體分泌的細胞因子或者抗原等隨血液流動在肝組織中均勻分布而引起的。有研究[9]表明Th1型免疫反應是泡狀棘球蚴在宿主體內產生不可逆纖維化的主要原因，Th1型細胞因子促進炎癥細胞募集在泡狀棘球蚴周圍，參與炎癥反應，導致致密的肉芽腫，最后發展為肝纖維化。Wang等[18]的研究表明，轉化生長因子-β對泡狀棘球蚴在機體中引發肝纖維化的過程發揮重要作用。然而本研究中觀察到的病灶旁肝組織中的纖維化是否同樣由上述因素引起，還需要將來進一步的研究來證實。
綜上所述，無論是泡狀棘球蚴Cox1表達量還是肝組織的纖維化程度，HAE病灶均高于病灶旁2 cm以內的肝組織，而病灶旁2 cm以內的肝組織之間的差異并沒有統計學意義。基于本研究在病灶旁肝組織中間隔0.5 cm的取材標準，筆者團隊認為HAE手術切除的范圍在距離病灶0.5 cm 處可能較為合適。盡管以上這兩項指標只是作為泡狀棘球蚴在肝臟中浸潤范圍的間接證據，但是這些證據也能夠為手術切除范圍提供一定的參考。本研究的不足之處在于缺乏術后HAE患者的長期隨訪結果以證實該研究的結論。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，作者之間無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊令鵬主要參與統計分析和文章撰寫；邱逸聞、楊先偉和沈舒參與病例資料收集；王文濤主要參與研究設計和指導。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會的審批［批文編號：2018年審（362）號］。
包蟲病是一種嚴重的人畜共患性疾病[1]，目前我國是包蟲病流行最為嚴重的國家。泡型肝包蟲病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）又稱作肝泡狀棘球蚴病。泡狀棘球蚴在肝內生長速度緩慢、潛伏時間長，病程進展隱匿[2]，其生長方式類似于腫瘤呈浸潤性生長，因此HAE的首選治療為手術切除[2-3]。然而即使是根治性的手術切除，在術后長期隨訪中還是存在復發[4]。HAE病灶無明顯包膜，與肝組織分界不清，手術切除既要將病灶完整切除以保證術后不復發，又要保留足夠多的正常肝組織供機體代謝，因此手術切除的范圍顯得尤為重要。Brunetti等[2]編寫的專家共識推薦的手術切緣是2 cm，即肝切除的斷面到病灶邊緣肉眼下至少要達到2 cm距離。對于晚期HAE患者，遵從2 cm的手術切緣在臨床實際中是很困難的。有研究[5]表明，切緣小于1 cm的R1切除，只要輔以阿苯達唑的長期治療也能到達與R0切除相近的生存率。但目前仍然缺乏前瞻性的隨機對照試驗來明確手術根治性切除的安全切緣，以保證術后HAE患者不再復發。
盡管有研究報道并比較了HAE根治性切除和姑息性切除術后患者的預后情況，但其中很少有研究描述其根治性切除的手術切緣。Cox1基因位于泡狀棘球蚴的線粒體中，目前已廣泛應用于包蟲的鑒別診斷以及亞種分析[6-7]。Liu等[8]利用Cox1基因對86份絳蟲感染的動物樣本進行細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲以及石渠棘球絳蟲感染的鑒別診斷，Cox1基因診斷的特異度高達100%。泡狀棘球蚴感染人體定植于肝臟后會引起局部肝組織變性、壞死以及肝纖維化[9]。泡狀棘球蚴生長浸潤的直接證據即泡狀棘球蚴蟲體本身，然而病灶旁正常的肝組織中并沒有觀察到泡狀棘球蚴的存在[10]。因此本研究收集HAE患者術后標本，利用PCR定量檢測肝組織中泡狀棘球蚴特異性基因Cox1的表達量，以及利用病理切片定量評價肝組織纖維化的程度來初步探索泡狀棘球蚴在肝臟中的浸潤范圍，從而為HAE根治性切除的范圍提供一定的理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本收集與分組
前瞻性收集2019年1月至2019年6月期間在四川大學華西醫院接受手術治療的20例HAE患者的術后組織標本。納入標準：① 病史、術前血清學、影像學及術后病理均支持HAE的診斷；② 肝內單發病灶；③ 初次接受HAE根治性肝切除術。排除標準：① 合并肝血管瘤、肝內原發性惡性腫瘤等其他肝臟占位性疾病者；② 肝內多發病灶；③ 術前發現有肺、腦等遠處臟器轉移。每例患者收集同時含有病灶與病灶旁肝組織的交界標本共3塊，將其中1塊放入10%甲醛溶液中固定24 h以上；另外2塊組織以交界處為起點，沿正常肝組織方向，距離病灶由近及遠間隔0.5 cm將病灶旁肝組織塊分割成4個小塊，依次分為0～0.5 cm肝組織組（0 cm<距離≤0.5 cm）、0.5～1.0 cm肝組織組（0.5 cm<距離≤1.0 cm）、1.0～1.5 cm肝組織組（1.0 cm<距離≤1.5 cm）和1.5～2.0 cm肝組織組（1.5 cm<距離≤2.0 cm），剩下的病灶組織為病灶組，見圖1。將切割后的組織塊分裝后放入液氮中冷凍保存。本研究已通過四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準 ［批文編號：2018年審（362）號］，所有患者均知情且簽署了知情同意書。
圖1
示病灶組織取材及分組示意圖
L代表病灶組，A代表0～0.5 cm肝組織組，B代表0.5～1.0 cm肝組織組，C代表1.0～1.5 cm肝組織組，D代表1.5～2.0 cm肝組織組
1.2 主要試劑
Masson染色試劑盒及蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購自碧云天公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生化公司；引物由成都擎科生物有限公司合成；PCR試劑盒購自上海東洋紡生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 組織病理學染色
固定好的組織經脫水、浸蠟、透明后包埋、切片，分別行HE染色和Masson染色。操作均按試劑盒說明書進行。
1.3.2 鏡下圖像采集與肝纖維化分析
分別在病灶組、0～0.5 cm肝組織組、0.5～1.0 cm肝組織組、1.0～1.5 cm肝組織組和1.5～2.0 cm肝組織組切片中隨機采集5張400倍鏡下Masson染色不重復的視野，然后利用Image-Pro Plus 6.0軟件計算每個區域視野下藍色的膠原纖維面積來代表肝纖維化程度，面積大小用像素密度來表示，最后計算其平均值。
1.3.3 定量PCR檢測Cox1的絕對表達量
將冷凍保存的每一塊肝臟組織標本剪碎混勻，分別取出50 mg組織放入研缽中進行充分研磨，用DNA提取試劑盒參照說明書提取肝臟組織總的DNA，應用NanoDrop 2000紫外/可見分光光度計檢測DNA濃度及純度，最后將樣品冷凍保存。Cox1基因引物由成都擎科生物有限公司合成：正向引物為5′-TTTTGGCTGCTGCTATTACTATG-3′，反向引物為5′-GATCACCACCACCTAACGGA-3′。目標基因片段PCR擴增40個循環后，檢測有無非特異擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。標準品制備：將上述PCR產物純化后與pMD19-T載體連接。將連接產物轉染感受態大腸桿菌，在無抗Luria-Bertani（LB）液體的培養基內培養1 h，然后在含氨芐西林的LB平板上進行篩選，挑取陽性克隆，采用質粒提取試劑盒提取質粒（操作按試劑盒說明書進行），經PCR鑒定后，陽性克隆送往成都擎科生物有限公司測序。之后用核酸測定儀測定陽性質粒的A260值。計算質粒拷貝數（copies/μL）=6.02×1 023（copies/moL）×質粒的質量濃度（g/μL）/質粒分子量（g/moL）。繪制標準曲線：取A260/A280介于1.8～2.0的陽性質粒作為標準品，將其10倍稀釋，分別稀釋成1×10–6～1×10–2 copies/μL的5個梯度作為模板，進行熒光定量PCR，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數（Ct）為縱坐標，陽性模板數的對數為橫坐標，即可繪出標準曲線，計算Cox1基因的表達量。
1.4 統計學方法
所有統計分析均使用GraphPad Prism 8.0完成。對計量資料采用K-S法檢驗其正態性，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用配伍設計的方差分析。計量資料之間的關系采用Pearson相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝臟組織的纖維化程度
病灶部分可見大量粗大、雜亂的纖維組織，其間夾雜有大小不等的囊泡；病灶旁肝臟內纖維組織較少，呈彌漫性分布在正常肝細胞之間，且主要集中于匯管區及中央靜脈周圍（圖2a～2e）。
圖2
示病灶和病灶旁肝組織的纖維化程度（Masson染色 ×400）、5 組肝組織中的纖維化面積和 Cox1 表達量比較及兩者之間的關系散點圖
a～e：分別為0～0.5 cm肝組織組（a）、0.5～1.0 cm肝組織組（b）、1.0～1.5 cm肝組織組（c）、1.5～2.0 cm肝組織組（d）、病灶組（e）的Masson染色結果；f、g：5 組肝組織的纖維化面積（f）和Cox1表達量（g）比較，*表示
利用Image-Pro Plus軟件分別計算病灶與病灶旁肝組織鏡下的纖維化面積，結果示病灶的纖維化面積大于病灶旁肝組織（P<0.000 1），說明病灶的纖維化程度高于病灶旁肝組織；另外對病灶旁肝組織的纖維化面積進行比較，結果表明4個病灶旁肝組織組之間的纖維化面積比較差異沒有統計學意義（P>0.05），見圖2f。
2.2 Cox1表達量的絕對定量分析
標準曲線的相關系數為99.73%，擴增效率為0.866，線性關系式為y=–3.776 3x+44.043，相關參數符合絕對定量要求。采用實時熒光定量PCR方法對20例HAE患者的病灶及其病灶旁肝組織的Cox1表達量進行絕對定量分析的結果顯示，Cox1表達量在病灶組織中高于病灶旁肝組織（P<0.000 1）；對于病灶旁肝組織，4個組的Cox1表達量的差異無統計學意義（P>0.05），圖2g。
2.3 Cox1表達量與鏡下纖維化面積的相關性
各組的Cox1表達量與其纖維化面積均呈正相關關系（圖2h～2l）。病灶組：r=0.6872，P=0.0008；0～0.5 cm肝組織組：r=0.5762，P=0.0078；0.5～1.0 cm肝組織組：r=0.4871，P=0.0294；1.0～1.5 cm肝組織組：r=0.5849，P=0.0068；1.5～2.0 cm肝組織組：r=0.7180，P=0.0004。
3 討論
泡狀棘球蚴定植于肝臟后類似于惡性腫瘤向外浸潤性的生長方式決定了HAE患者首選治療方法為根治性切除術，即手術操作需要將包蟲病灶完全切除才能達到根治目的。溫浩[11]認為，在HAE病灶周邊存在決定病灶不斷向外周肝組織侵犯的“浸潤帶”，術中只要切除“浸潤帶”就能達到根治，因此提出1 cm的切除范圍。而Uchino等[12]在切緣至少為2 cm的患者中未發現復發，因此主張術中的切除范圍應至少達到2 cm。然而對于晚期包蟲病患者，當病灶侵犯了肝內血管、下腔靜脈時遵從以上兩個手術切緣在臨床實際中是極其困難的。因此本研究收集了 20例HAE患者術后的標本，定量檢測肝組織中泡狀棘球蚴Cox1的表達量以及通過定量評價肝組織纖維化的程度來初步探索泡狀棘球蚴在肝臟中的浸潤范圍，為HAE根治性切除的范圍提供一定的理論依據。
3.1 肝組織中的Cox1表達量
目前國外研究者[4]認為HAE的手術切緣至少要達到2 cm才能避免術后復發，然而這一標準要求過于嚴格，大量包蟲病患者在就診時疾病已經進展到中晚期，這部分患者難以達到2 cm手術切緣的要求。因此為了探究一個更為合理的切緣，本研究以2 cm作為一個界點，選擇病灶及病灶旁2 cm以內的肝組織作為研究對象。泡狀棘球蚴在肝臟定植后向外周呈現緩慢浸潤式的生長，其病灶呈類圓形樣向外周增大，常理上Cox1基因在病灶旁肝組織中應該有一個明顯的逐級遞減的趨勢。本研究的檢測結果顯示病灶中Cox1的表達量遠遠高于病灶旁肝組織，然而2 cm以內的4個病灶旁肝組織組Cox1表達量之間的差異并沒有統計學意義。在最近一項研究中，Baraquin等[13]利用PCR檢測了HAE患者外周血中游離的泡狀棘球蚴DNA片段，定性檢測結果呈陽性，但兩個目標基因（核基因U1 snRNA和線粒體基因Nad5）在患者的外周血中含量很少。本研究檢測的Cox1基因與該研究檢測的Nad5基因同為泡狀棘球蚴的線粒體基因，因此泡狀棘球蚴的Cox1基因可能同樣存在于HAE患者的外周血中，這在一定程度上解釋了為何本研究檢測的Cox1基因在病灶旁肝組織內仍有表達。在以往腫瘤組織的研究[14]中，胞外囊泡被認為是循環游離DNA的來源。Ancarola等[15]發現絳蟲同樣能分泌胞外囊泡，遺憾的是研究者們并未檢測囊泡中是否含該蟲體的特異性基因片段。本研究在包蟲病灶旁肝組織中檢測到的Cox1基因很有可能跟腫瘤患者體內的循環游離DNA類似，由胞外囊泡攜帶并隨血液循環播散所致。
3.2 肝組織的纖維化程度
同PCR檢測的取材標準一樣，該研究選取病灶及病灶旁2 cm以內的肝組織作為評價纖維化程度的研究對象。因此本研究采集病灶及病灶旁肝組織行Masson染色后400倍鏡下的視野，參照Horai等[16]的方法，利用圖像軟件Image-Pro Plus計算視野中的纖維化面積來代表肝臟纖維化的程度，經統計分析后發現，病灶部分的纖維化面積大于病灶旁肝組織區域，然而距病灶2 cm以內的4個病灶旁肝組織組的纖維化面積比較差異沒有統計學意義。病灶旁肝組織纖維化定量分析的結果與病灶旁肝組織鏡下纖維化呈彌漫狀分布的表現是相符合的。陽丹才讓等[17]收集了HAE病灶邊緣帶的肝組織及距病灶5 cm以外的正常肝組織，經Masson染色后采用半定量的纖維化評分系統比較兩者之間的纖維化程度的結果表明，病灶邊緣帶的肝組織纖維化程度高于距病灶5 cm以外的正常肝組織。這與本研究的研究結果不太一致，原因可能是兩項研究的取材標準不一樣。本研究收集的標本是病灶邊緣至距離病灶邊緣2 cm范圍內的肝組織，而陽丹才讓等研究者收集的標本是距病灶5 cm以外的肝組織。
3.3 Cox1表達量與肝纖維化程度的相關性
最后本研究對病灶和病灶旁肝組織的纖維化面積和Cox1表達量做了相關性分析，結果顯示無論是病灶組還是病灶旁2 cm以內的4個肝組織組，兩者之間均存在正相關關系。各組纖維化的面積與Cox1表達量兩者之間相關，由于病灶部分是泡狀棘球蚴感染后最初在肝臟定植的區域，因此不論纖維化程度還是Cox1的表達量都較病灶旁肝組織高。病灶旁各肝組織組之間纖維化程度差異沒有統計學意義的原因可能是由于病灶中的蟲體分泌的細胞因子或者抗原等隨血液流動在肝組織中均勻分布而引起的。有研究[9]表明Th1型免疫反應是泡狀棘球蚴在宿主體內產生不可逆纖維化的主要原因，Th1型細胞因子促進炎癥細胞募集在泡狀棘球蚴周圍，參與炎癥反應，導致致密的肉芽腫，最后發展為肝纖維化。Wang等[18]的研究表明，轉化生長因子-β對泡狀棘球蚴在機體中引發肝纖維化的過程發揮重要作用。然而本研究中觀察到的病灶旁肝組織中的纖維化是否同樣由上述因素引起，還需要將來進一步的研究來證實。
綜上所述，無論是泡狀棘球蚴Cox1表達量還是肝組織的纖維化程度，HAE病灶均高于病灶旁2 cm以內的肝組織，而病灶旁2 cm以內的肝組織之間的差異并沒有統計學意義。基于本研究在病灶旁肝組織中間隔0.5 cm的取材標準，筆者團隊認為HAE手術切除的范圍在距離病灶0.5 cm 處可能較為合適。盡管以上這兩項指標只是作為泡狀棘球蚴在肝臟中浸潤范圍的間接證據，但是這些證據也能夠為手術切除范圍提供一定的參考。本研究的不足之處在于缺乏術后HAE患者的長期隨訪結果以證實該研究的結論。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，作者之間無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊令鵬主要參與統計分析和文章撰寫；邱逸聞、楊先偉和沈舒參與病例資料收集；王文濤主要參與研究設計和指導。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會的審批［批文編號：2018年審（362）號］。
