引用本文： 呂濤, 徐西, 宋九林, 嚴律南, 文天夫, 吳泓, 朱濤, 蔣利, 楊儉, 張偉義, 陳攀羽, 彭偉, 楊家印. 供體紅細胞輸血在DCD肝移植中應用的技術改進和效果. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 1-5. doi: 10.7507/1007-9424.202111073 復制
新型冠狀病毒肺炎疫情期間，各種原因造成的血庫備血不足[1]對外科手術的正常實施造成了不同程度的影響。實際上，備血不足在以往也時常發生，而且公民逝世后捐獻（donation after citizen death，DCD）肝移植由于手術時間的不確定性、受體術前凝血功能差等原因受到缺血的影響就更大，若不解決這一問題，有可能會造成肝移植手術因備血不足而延遲甚至取消，浪費寶貴的供肝資源。本移植團隊在新型冠狀病毒肺炎疫情期間，開展了供體紅細胞輸血在DCD肝移植中應用的Ⅰ期臨床試驗[2]，其結果表明，利用供體紅細胞輸血可以有效安全地減少DCD肝移植的血庫用血。但由于采集到的紅細胞血量較少（平均僅為 500 mL），并不能完全解決DCD肝移植手術對庫存血的依賴。因此，本移植團隊改進了供體血液采集及處理方法，明顯增加了供體紅細胞采集量，現將改進方法及經驗報道如下。
1 對象與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2020年5月至2021年1月期間四川大學華西醫院移植團隊對供體血液采集及處理方法改進前即Ⅰ期臨床試驗以及2021年9月至2021年11月期間供體血液采集及處理方法改進后的供體的臨床病理資料。供體的納入和排除標準見Ⅰ期臨床試驗[2]中的描述。
1.2 方法
1.2.1 Ⅰ期臨床試驗中供體紅細胞收集及處理方法
供體血液采集在器官獲取手術中、保存液灌注前進行。① 先于腹主動脈置管平面進行下腔靜脈置管，利用自體血回收機（P3000，北京京精醫療設備有限公司）快速地采集供體血液，一旦供體出現血流動力學不穩定或血氧飽和度下降等情況時立即停止采集血液，然后進入冷灌注流程。② 完成血液采集后，利用自體血回收系統進行5 600 r/min離心，盡可能地去除游離的血紅蛋白（Hb）、白細胞、血漿、血小板、抗凝液等物質。③ 完成離心后的紅細胞懸液進行洗滌（每250 mL紅細胞懸液用1 000 mL林格液），然后轉移至血液保存袋中于4 ℃環境保存，每30 min搖晃1次。供受體血液在肝移植術前常規進行交叉配血試驗。在受體手術中，如果出現大量失血等輸血指征時將供體紅細胞懸液輸入到受體體內（為進一步去除白細胞，輸血管道中安置了白細胞濾器）。
1.2.2 供體紅細胞收集及處理改進技術及措施
供體血液收集及處理過程同樣在器官獲取手術中進行。在以下幾個步驟進行了改進：① 在腹主動脈增加向足側方向的插管，收集下肢血液（采集血液過程中灌注林格液3 000 mL）；② 器官灌注過程中不剪開供體右心房，灌注液及血液完全經腔靜脈置管回流至采集罐中；③ 在心臟停跳后持續心臟按壓，使血液充分回流；④ 在灌注后繼續采集血液和灌注液，直至清亮后停止。經處理后檢測其電解質及各項生化指標。
1.3 檢測指標
收集Ⅰ期臨床試驗中供體及技術改進后供體的術前Hb含量、白細胞計數、血液采集量、回收后獲得的濃縮紅細胞及濃縮紅細胞中Hb含量，同時分析紅細胞懸液的電解質如鈉離子、氯離子、鉀離子及乳酸濃度。還收集了Ⅰ期臨床試驗中100袋庫存紅細胞懸液的電解質及乳酸濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件對數據進行分析。采用夏皮羅-威爾克檢驗法對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布數據以均數±標準差（
±s）表示并用獨立樣本均數比較的t檢驗，偏態分布數據用中位數（M）和上下四分位數（P25，P75）表示并用曼-惠特尼U檢驗；計數資料采用頻數表示并采用Fisher確切概率法檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
在Ⅰ期臨床試驗中共26例DCD供體，改進技術后6例DCD供體，二者的資料比較結果見表1。從表1可見，與Ⅰ期臨床試驗的數據比較，改進技術之后血液采集量更多（P<0.05），經過自體回收機過濾、離心、洗滌之后得到濃縮紅細胞懸液量更多（P<0.05），獲得紅細胞懸液量/kg體質量更多（P<0.05）。采用改進技術后的6例DCD供體的詳細數據見表2。
表1
Ⅰ期臨床試驗即技術改進前和技術改進后供體的資料比較
表2
技術改進后的6例供體基本資料以及所獲得紅細胞懸液的詳細數據
另外，本研究將經過技術改進后所得到的紅細胞懸液成分與100袋庫存紅細胞懸液成分進行比較，結果見表3。從表3可見，與庫存紅細胞懸液成分比較，經過技術改進后得到的紅細胞懸液的pH值、鈉離子濃度、氯離子濃度均更高（P<0.05）且鉀離子濃度均<1 mmol/L，無一例乳酸濃度>15 mmol/L。
表3
技術改進后供體的紅細胞懸液成分與庫存紅細胞懸液成分比較
3 討論
新型冠狀病毒肺炎疫情期間，本移植團隊通過Ⅰ期臨床試驗納入了26例DCD肝移植受體進行了供體紅細胞輸血，沒有出現輸血和感染相關的并發癥。通過供體紅細胞的輸入，有效地減少了DCD肝移植手術對庫存血的依賴，一定程度上保障了疫情期間DCD肝移植的正常進行[2]。
雖然供體特異性輸血（donor specific transfusion，DST）首先報道于1973年[3]，但尚無在DCD肝移植中應用DST的報道，也無以緩解血液供應不足為方向的研究。以往的DST研究[4-6]輸入的成分多為供體全血，但由于DCD供體血液里的細胞因子等小分子物質對受體的影響尚不清楚，存在潛在風險，而且血漿替代品如人血白蛋白、凝血酶原復合物、纖維蛋白酶原可以一定程度上緩解血漿的供應不足，因此，本研究團隊將DCD供體血液中的血漿成分去除掉，只使用供體紅細胞輸血進行Ⅰ期臨床試驗。
為了保障輸入的安全性，本移植團隊對供體設定了嚴格的納入標準[2]：① 捐獻者年齡>18歲；② 供體家屬同意血液捐獻；③ 捐獻者血液培養結果為陰性；④ 捐獻者痰培養陰性或痰培養陽性但臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查均無感染存在的證據（陽性菌為多重耐藥菌除外）；⑤ 捐獻者巨細胞病毒核酸檢測結果為陰性；⑥ 捐獻者無輸血傳播的感染包括艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒感染；⑦ 捐獻者血液標本的宏基因二代測序檢查未發現細菌、真菌、病毒、寄生蟲的感染；⑧ 捐獻者重癥監護病房（intensive care unit，ICU）住院時間不超過7 d。在改進前，收集到的供體全血經過洗滌、離心和過濾后，供體紅細胞血液中的Hb濃度平均為186.30 g/L，基本去除了白細胞成分。不管改進前還是改進后，本移植團隊獲得的供體紅細胞懸液均較庫存紅細胞懸液的生化及電解質更接近生理狀態，其鈉離子濃度基本處于正常范圍，鉀離子能夠得到有效清除且乳酸濃度較低；而庫存的紅細胞懸液中，隨著存儲時間增長，血液里的葡萄糖被消耗、2,3-二磷酸甘油酸以及三磷酸腺苷減少以及乳酸堆積[7-8]。
需要注意，使用供體血液存在增加供體來源感染的可能，并且供體血液在采集、處理、輸血過程中都可能存在被污染的風險。因此，本研究團隊在Ⅰ期臨床試驗中采取了多種方法來降低受體發生術后感染的風險，尤其是對供體篩查是最為重要的。對于DCD供體，由于血腦屏障被破壞、外科手術史、免疫系統遭受重大打擊[9]、腸道菌群移位、心肺復蘇、長時間的ICU停留、一系列的有創操作（氣管插管、中心靜脈置管等）、血管活性藥物的使用、體外生命支持以及其他危險因素增加了器官獲取前發生感染以及移植術后感染的風險。本移植團隊的經驗是，在對供體的篩查中，首先，確保供體在遭受危及生命的疾病或創傷前是符合我國獻血者健康檢查要求的正常人群[10]；其次，由于細菌、真菌、病毒感染是DCD肝移植術后常見的并發癥[11]，因此排除了確診細菌、真菌、病毒感染的供體，還使用了宏基因二代測序技術排除了潛在感染的供體包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等，其對感染的篩查具有靈敏度高、特異性高、覆蓋面廣、檢測能力強等特點[12]；再次，供體ICU總住院時長超過7 d者也被排除，因為有研究者[13]發現，隨著ICU住院時長的增加供體發生醫院感染的幾率會相應增加。除了對供體的嚴格篩查之外，在血液收集、處理、輸血過程中嚴格遵守無菌操作原則也是防止感染的關鍵步驟；同時一些研究[14-15]證實了自體血回輸機聯合白細胞濾器能夠有效地清除血液中的細菌。雖然通過以上步驟仍不能保證完全消除掉供體來源性感染的風險，但從本移植團隊實施的肝移植輸血患者中沒有發生任何危及生命的感染，并且所有的術后感染事件都沒有證據表明是來源于供體；此外，在Ⅰ期臨床試驗研究[2]中，輸血和未輸血患者術后1個月內感染的發生率沒有明顯差異。
在Ⅰ期臨床試驗中收集到的供體紅細胞血液量平均為500 mL，雖然減少了對庫存血的依賴，但還未完全解決肝移植手術對紅細胞懸液的需求，仍有77%的受體同時使用了庫存紅細胞懸液。供體采集血液量受供體體質量、術前Hb、采集方法等因素影響。分析本研究團隊前期收集血液量較少的主要原因有：① 灌注前收集供體全血，為避免器官灌注不足及組織缺氧，一旦供體出現血壓或氧飽和度下降就停止采血；② 腹主動脈插管時會結扎足側端，下肢血液無法回流及收集。因此，為收集到更大量的供體血液量，本移植團隊采取了改進措施，結果較以往的方法明顯增加了采集血液量，而且各項生化、電解質指標也未見異常（在灌注前采集血液的原因之一就是對HTK等器官保存液中的電解質成分的顧慮）；而且收集到的含有保存液的供體全血經過離心、洗滌等處理后，所含的包括鉀離子等電解質濃度均<1 mmol/L，不會影響供體紅細胞的輸入；此外，不剪開供體右心房，使血液完全經過腔靜脈置管回收，可以防止血液丟失及污染。
雖然本研究中改進采集技術后進行的例數還較少，但可以看到，改進后明顯增加了供體紅細胞血液的采集量，基本可以做到完成肝移植手術不輸入庫存紅細胞懸液。本研究團隊的前期Ⅰ期臨床試驗研究和后續的改良技術為解決時常發生的血庫供應不足提供了一定的經驗和方法，也為DCD肝移植的正常開展提供了保障。前期Ⅰ期臨床試驗研究中發現的供體血液輸入對肝移植受體術后的免疫保護作用也有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊家印、朱濤、吳泓、文天夫、嚴律南、呂濤、徐西對論文設計和指導；彭偉、蔣利、楊儉、陳攀羽、張偉義、宋九林收集數據；呂濤、徐西論文撰寫。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理審查委員會的倫理審批［批文編號：2020年審（166）號］。
新型冠狀病毒肺炎疫情期間，各種原因造成的血庫備血不足[1]對外科手術的正常實施造成了不同程度的影響。實際上，備血不足在以往也時常發生，而且公民逝世后捐獻（donation after citizen death，DCD）肝移植由于手術時間的不確定性、受體術前凝血功能差等原因受到缺血的影響就更大，若不解決這一問題，有可能會造成肝移植手術因備血不足而延遲甚至取消，浪費寶貴的供肝資源。本移植團隊在新型冠狀病毒肺炎疫情期間，開展了供體紅細胞輸血在DCD肝移植中應用的Ⅰ期臨床試驗[2]，其結果表明，利用供體紅細胞輸血可以有效安全地減少DCD肝移植的血庫用血。但由于采集到的紅細胞血量較少（平均僅為 500 mL），并不能完全解決DCD肝移植手術對庫存血的依賴。因此，本移植團隊改進了供體血液采集及處理方法，明顯增加了供體紅細胞采集量，現將改進方法及經驗報道如下。
1 對象與方法
1.1 研究對象
回顧性收集2020年5月至2021年1月期間四川大學華西醫院移植團隊對供體血液采集及處理方法改進前即Ⅰ期臨床試驗以及2021年9月至2021年11月期間供體血液采集及處理方法改進后的供體的臨床病理資料。供體的納入和排除標準見Ⅰ期臨床試驗[2]中的描述。
1.2 方法
1.2.1 Ⅰ期臨床試驗中供體紅細胞收集及處理方法
供體血液采集在器官獲取手術中、保存液灌注前進行。① 先于腹主動脈置管平面進行下腔靜脈置管，利用自體血回收機（P3000，北京京精醫療設備有限公司）快速地采集供體血液，一旦供體出現血流動力學不穩定或血氧飽和度下降等情況時立即停止采集血液，然后進入冷灌注流程。② 完成血液采集后，利用自體血回收系統進行5 600 r/min離心，盡可能地去除游離的血紅蛋白（Hb）、白細胞、血漿、血小板、抗凝液等物質。③ 完成離心后的紅細胞懸液進行洗滌（每250 mL紅細胞懸液用1 000 mL林格液），然后轉移至血液保存袋中于4 ℃環境保存，每30 min搖晃1次。供受體血液在肝移植術前常規進行交叉配血試驗。在受體手術中，如果出現大量失血等輸血指征時將供體紅細胞懸液輸入到受體體內（為進一步去除白細胞，輸血管道中安置了白細胞濾器）。
1.2.2 供體紅細胞收集及處理改進技術及措施
供體血液收集及處理過程同樣在器官獲取手術中進行。在以下幾個步驟進行了改進：① 在腹主動脈增加向足側方向的插管，收集下肢血液（采集血液過程中灌注林格液3 000 mL）；② 器官灌注過程中不剪開供體右心房，灌注液及血液完全經腔靜脈置管回流至采集罐中；③ 在心臟停跳后持續心臟按壓，使血液充分回流；④ 在灌注后繼續采集血液和灌注液，直至清亮后停止。經處理后檢測其電解質及各項生化指標。
1.3 檢測指標
收集Ⅰ期臨床試驗中供體及技術改進后供體的術前Hb含量、白細胞計數、血液采集量、回收后獲得的濃縮紅細胞及濃縮紅細胞中Hb含量，同時分析紅細胞懸液的電解質如鈉離子、氯離子、鉀離子及乳酸濃度。還收集了Ⅰ期臨床試驗中100袋庫存紅細胞懸液的電解質及乳酸濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS統計軟件對數據進行分析。采用夏皮羅-威爾克檢驗法對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布數據以均數±標準差（±s）表示并用獨立樣本均數比較的t檢驗，偏態分布數據用中位數（M）和上下四分位數（P25，P75）表示并用曼-惠特尼U檢驗；計數資料采用頻數表示并采用Fisher確切概率法檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
在Ⅰ期臨床試驗中共26例DCD供體，改進技術后6例DCD供體，二者的資料比較結果見表1。從表1可見，與Ⅰ期臨床試驗的數據比較，改進技術之后血液采集量更多（P<0.05），經過自體回收機過濾、離心、洗滌之后得到濃縮紅細胞懸液量更多（P<0.05），獲得紅細胞懸液量/kg體質量更多（P<0.05）。采用改進技術后的6例DCD供體的詳細數據見表2。
表1
Ⅰ期臨床試驗即技術改進前和技術改進后供體的資料比較
表2
技術改進后的6例供體基本資料以及所獲得紅細胞懸液的詳細數據
另外，本研究將經過技術改進后所得到的紅細胞懸液成分與100袋庫存紅細胞懸液成分進行比較，結果見表3。從表3可見，與庫存紅細胞懸液成分比較，經過技術改進后得到的紅細胞懸液的pH值、鈉離子濃度、氯離子濃度均更高（P<0.05）且鉀離子濃度均<1 mmol/L，無一例乳酸濃度>15 mmol/L。
表3
技術改進后供體的紅細胞懸液成分與庫存紅細胞懸液成分比較
3 討論
新型冠狀病毒肺炎疫情期間，本移植團隊通過Ⅰ期臨床試驗納入了26例DCD肝移植受體進行了供體紅細胞輸血，沒有出現輸血和感染相關的并發癥。通過供體紅細胞的輸入，有效地減少了DCD肝移植手術對庫存血的依賴，一定程度上保障了疫情期間DCD肝移植的正常進行[2]。
雖然供體特異性輸血（donor specific transfusion，DST）首先報道于1973年[3]，但尚無在DCD肝移植中應用DST的報道，也無以緩解血液供應不足為方向的研究。以往的DST研究[4-6]輸入的成分多為供體全血，但由于DCD供體血液里的細胞因子等小分子物質對受體的影響尚不清楚，存在潛在風險，而且血漿替代品如人血白蛋白、凝血酶原復合物、纖維蛋白酶原可以一定程度上緩解血漿的供應不足，因此，本研究團隊將DCD供體血液中的血漿成分去除掉，只使用供體紅細胞輸血進行Ⅰ期臨床試驗。
為了保障輸入的安全性，本移植團隊對供體設定了嚴格的納入標準[2]：① 捐獻者年齡>18歲；② 供體家屬同意血液捐獻；③ 捐獻者血液培養結果為陰性；④ 捐獻者痰培養陰性或痰培養陽性但臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查均無感染存在的證據（陽性菌為多重耐藥菌除外）；⑤ 捐獻者巨細胞病毒核酸檢測結果為陰性；⑥ 捐獻者無輸血傳播的感染包括艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒感染；⑦ 捐獻者血液標本的宏基因二代測序檢查未發現細菌、真菌、病毒、寄生蟲的感染；⑧ 捐獻者重癥監護病房（intensive care unit，ICU）住院時間不超過7 d。在改進前，收集到的供體全血經過洗滌、離心和過濾后，供體紅細胞血液中的Hb濃度平均為186.30 g/L，基本去除了白細胞成分。不管改進前還是改進后，本移植團隊獲得的供體紅細胞懸液均較庫存紅細胞懸液的生化及電解質更接近生理狀態，其鈉離子濃度基本處于正常范圍，鉀離子能夠得到有效清除且乳酸濃度較低；而庫存的紅細胞懸液中，隨著存儲時間增長，血液里的葡萄糖被消耗、2,3-二磷酸甘油酸以及三磷酸腺苷減少以及乳酸堆積[7-8]。
需要注意，使用供體血液存在增加供體來源感染的可能，并且供體血液在采集、處理、輸血過程中都可能存在被污染的風險。因此，本研究團隊在Ⅰ期臨床試驗中采取了多種方法來降低受體發生術后感染的風險，尤其是對供體篩查是最為重要的。對于DCD供體，由于血腦屏障被破壞、外科手術史、免疫系統遭受重大打擊[9]、腸道菌群移位、心肺復蘇、長時間的ICU停留、一系列的有創操作（氣管插管、中心靜脈置管等）、血管活性藥物的使用、體外生命支持以及其他危險因素增加了器官獲取前發生感染以及移植術后感染的風險。本移植團隊的經驗是，在對供體的篩查中，首先，確保供體在遭受危及生命的疾病或創傷前是符合我國獻血者健康檢查要求的正常人群[10]；其次，由于細菌、真菌、病毒感染是DCD肝移植術后常見的并發癥[11]，因此排除了確診細菌、真菌、病毒感染的供體，還使用了宏基因二代測序技術排除了潛在感染的供體包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等，其對感染的篩查具有靈敏度高、特異性高、覆蓋面廣、檢測能力強等特點[12]；再次，供體ICU總住院時長超過7 d者也被排除，因為有研究者[13]發現，隨著ICU住院時長的增加供體發生醫院感染的幾率會相應增加。除了對供體的嚴格篩查之外，在血液收集、處理、輸血過程中嚴格遵守無菌操作原則也是防止感染的關鍵步驟；同時一些研究[14-15]證實了自體血回輸機聯合白細胞濾器能夠有效地清除血液中的細菌。雖然通過以上步驟仍不能保證完全消除掉供體來源性感染的風險，但從本移植團隊實施的肝移植輸血患者中沒有發生任何危及生命的感染，并且所有的術后感染事件都沒有證據表明是來源于供體；此外，在Ⅰ期臨床試驗研究[2]中，輸血和未輸血患者術后1個月內感染的發生率沒有明顯差異。
在Ⅰ期臨床試驗中收集到的供體紅細胞血液量平均為500 mL，雖然減少了對庫存血的依賴，但還未完全解決肝移植手術對紅細胞懸液的需求，仍有77%的受體同時使用了庫存紅細胞懸液。供體采集血液量受供體體質量、術前Hb、采集方法等因素影響。分析本研究團隊前期收集血液量較少的主要原因有：① 灌注前收集供體全血，為避免器官灌注不足及組織缺氧，一旦供體出現血壓或氧飽和度下降就停止采血；② 腹主動脈插管時會結扎足側端，下肢血液無法回流及收集。因此，為收集到更大量的供體血液量，本移植團隊采取了改進措施，結果較以往的方法明顯增加了采集血液量，而且各項生化、電解質指標也未見異常（在灌注前采集血液的原因之一就是對HTK等器官保存液中的電解質成分的顧慮）；而且收集到的含有保存液的供體全血經過離心、洗滌等處理后，所含的包括鉀離子等電解質濃度均<1 mmol/L，不會影響供體紅細胞的輸入；此外，不剪開供體右心房，使血液完全經過腔靜脈置管回收，可以防止血液丟失及污染。
雖然本研究中改進采集技術后進行的例數還較少，但可以看到，改進后明顯增加了供體紅細胞血液的采集量，基本可以做到完成肝移植手術不輸入庫存紅細胞懸液。本研究團隊的前期Ⅰ期臨床試驗研究和后續的改良技術為解決時常發生的血庫供應不足提供了一定的經驗和方法，也為DCD肝移植的正常開展提供了保障。前期Ⅰ期臨床試驗研究中發現的供體血液輸入對肝移植受體術后的免疫保護作用也有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊家印、朱濤、吳泓、文天夫、嚴律南、呂濤、徐西對論文設計和指導；彭偉、蔣利、楊儉、陳攀羽、張偉義、宋九林收集數據；呂濤、徐西論文撰寫。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理審查委員會的倫理審批［批文編號：2020年審（166）號］。
