引用本文： 桂亮, 李擁軍. 基因治療性血管生成在下肢缺血性疾病中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(8): 1083-1089. doi: 10.7507/1007-9424.202111071 復制
隨著我國人口老齡化不斷加速，外周動脈疾病（peripheral arterial disease，PAD）發病率逐年升高，60歲以上人群中發病率為19.8%[1]，50歲以上的糖尿病人群中其發病率高達24.1%[2]；此外，約10%的PAD患者甚至進一步發展為嚴重的下肢缺血（critical limb ischemia，CLI），臨床表現為靜息痛（持續2周以上）、潰瘍或者壞疽。CLI患者的生活質量指數與晚期癌癥患者相似，且在最初診斷后5年內，其病死率超過50%[3]。傳統外科手術或血管腔內治療是目前CLI患者的臨床首選治療方法，但是仍有約30%的患者因嚴重的并發癥不適合行手術或腔內治療[4]。所以，通過非手術治療改善CLI患者肢體血流灌注與相關臨床癥狀，降低截肢率和病死率，是當前亟需解決的臨床問題[5]。
1 治療性血管生成
Isner等[6]在1999年首次提出治療性血管生成（therapeutic angiogenesis，TA）的概念，即一種全新的治療性手段，通過應用細胞因子或成血管細胞轉入缺血組織，轉化局部微環境來提供血管生成的環境以促進缺血組織毛細血管網絡生成和側支循環的建立，包括血管生成、動脈形成與血管發生。近10年來，有研究[5, 7]表明，TA能夠有效誘使CLI組織內的血管新生與側支循環建立，從而改善缺血區域的血流灌注，為CLI的治療帶來新的思路與策略。
1.1 血管生成
血管生成是指從已經存在的毛細血管芽生出新的以毛細血管為主的血管系統（直徑8～12 μm），延伸并擴展原有毛細血管網的過程[8]； 常見于缺血組織、傷口愈合、腫瘤及心肌梗死后，缺血缺氧是其主要誘因。 組織內缺氧激活缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），通過復雜的鏈級反應導致血管生成[9]；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是此過程中最重要的細胞因子，其在毛細血管床的初始形成期發揮主導性作用[10]。
1.2 動脈形成
動脈形成發生于動脈水平，指已存在的血管通過結構重塑以擴大管腔直徑，形成直徑20～100 μm、富含成熟中膜的新側支動脈[11]。研究[9]表明，1條側支動脈的建立能使遠端缺血區域內的血流灌注增加20～30倍，效果遠優于單純毛細血管網的增加。有效建立新的側支動脈是TA的主要目標。已知血管剪切壓力改變和炎癥反應是其主要誘因[12]。剪切壓力增加能激活內皮細胞釋放細胞因子以募集單核細胞，進而引發炎癥反應，這種炎癥環境恰好是血管側支化信號傳遞的重要因素之一。
1.3 血管發生
血管發生是指內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化為血管內皮細胞形成原始血管的過程。過去該過程被認為僅發生于胚胎期[13]。有研究[14]報道在成人血循環中成功分離出EPCs，從而證實成年機體內存在EPCs分化為原始血管的過程。
2 細胞因子與基因治療
血管生成需要多種功能性細胞因子參與。目前，國內外關于VEGF、HIF-1α、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）的研究最為廣泛。基礎研究和Ⅰ期臨床試驗結果證實了直接使用細胞因子的促血管生長作用[15]。但大型對照研究顯示其不能有效改善CLI患者的臨床癥狀。而且，直接使用功能性細胞因子往往難以達到有效治療濃度，且細胞因子價格昂貴、半衰期短，需頻繁使用[16]。此外，最佳劑量、給藥濃度、持續給藥時間及給藥方式也是細胞因子療法尚未明確與克服的難題。 基因治療可避免上述弊端，即運用載體將外源性核酸序列遞送至缺血組織的靶細胞，致目的基因在局部持續表達，合成所需的細胞因子。鑒于基因治療的諸多優勢，其已成為CLI性疾病的研究熱點之一。有關基因TA治療PAD的臨床試驗總結見表1。
表1
基因TA治療PAD患者的臨床試驗總結
2.1 VEGF
VEGF是目前研究最廣泛的血管生成因子，共包含A、B、C、D、E、F和胎盤生長因子 7個家族成員；其中，VEGF-A的功能性最強、含量最為豐富，是最常見的研究對象，包含VEGF-121、VEGF-145、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和VEGF-206共6個亞型[28]。目前為止，研究人員主要針對VEGF-165開展相關基礎實驗與臨床研究。 M?kinen等[18]研究報道，通過動脈內注射腺病毒或質粒攜帶的VEGF-165基因后，數字減影血管造影證實兩種方法均可致缺血部位的側支顯著增多，但臨床效果與對照組比較無明顯差異；此外，腺病毒組患者體內的抗腺病毒抗體增加了61%。2006年，Kusumanto等[20]報道，對54例由糖尿病引發的嚴重CLI 患者肌肉注射VEGF-165裸質粒，結果顯示VEGF-165裸質粒能夠改善患者的皮膚潰瘍與ABI（潰瘍改善率方面試驗組與安慰劑組對比： 25.9% 比 0%，P=0.01），但無法有效降低截肢率（試驗組與安慰劑組對比： 13.6% 比 22.2%，P>0.05）。Ehrbar等[29]報道了一種新型VEGF121基因遞送系統，其能夠長期低劑量釋放VEGF，有效誘導并改善血管形成。迄今為止，PAD 患者的 VEGF 基因治療在 Ⅲ期臨床試驗中未能顯示出受益的證據。另外，接受VEGF基因治療的患者中，約60%發生劑量依賴性下肢水腫。值得注意的是，尚無證據明確證實VEGF與血管生成間的直接關系。與此說法相反的是，配體的濃度決定著其是起促血管生成作用還是抗血管生成作用[30]。另外，相關計算模型表明，VEGF及其受體的基因表達及活動度與其濃度存在相關性[31]。
2.2 HGF
HGF是一種多功能性細胞因子，其能夠在抑制炎癥、水腫和細胞衰老的同時發揮促血管生成的作用[32-33]。 而且，HGF能夠同時誘導內皮細胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移，但是僅促進ECs分裂增殖而不引起VSMCs增殖，從而防止內膜增生導致的管腔狹窄、閉塞。 國內外學者進行的大量基礎研究與臨床試驗證實了HGF基因治療的安全性與有效性。 2001年，Taniyama等[34]通過建立糖尿病大鼠后肢缺血模型，并肌肉注射給予人HGF質粒，結果顯示HGF基因治療能夠顯著升高缺血區域內毛細血管密度。Morishita等[35]開展了Ⅰ期臨床試驗，對 6例CLI患者給予肌肉注射HGF質粒，所有受試者臨床癥狀明顯改善，且均未出現與基因轉染相關的不良反應如水腫、血管瘤和腫瘤形成。隨后，Morishita等[24]進一步開展Ⅱa期臨床試驗，結果顯示HGF質粒能夠有效加速CLI患者的潰瘍愈合，缺血性潰瘍最大徑試驗前后對比為（3.08±1.54） cm 比 （2.32±1.88）cm， P=0.007，并緩解靜息痛。2015年，Cui等[36]招募21例CLI受試者進行表達HGF的裸質粒DNA的Ⅰ期臨床試驗，結果同樣肯定了HGF基因治療的安全性與有效性。此外， 2010年Shigematsu等[27]開展了一項多中心、隨機、雙盲與安慰劑對照的Ⅲ期臨床試驗，以期評估多點肌肉注射HGF基因質粒治療CLI的安全性與有效性，該試驗共納入44例CLI患者，最終研究結果表明，相較于對照組，HGF質粒治療組患者的皮膚潰瘍面積明顯縮小、靜息痛顯著緩解，差異均具有統計學意義（靜息痛緩解率試驗組與安慰劑組對比為70.4% 比30.8%，P=0.014）；而且試驗組患者的生活質量也得到了較大的提高。此外，尚無研究顯示HGF基因治療會引起下肢水腫和存在其他不良副作用。憑借生物學功能多樣性的優勢，在眾多細胞因子的基因治療中，HGF基因治療目前最有希望成功進行臨床轉化。在日本，HGF基因治療已經被批準用于無法進行血運重建的下肢嚴重缺血患者。在國內，北京諾思蘭德生物技術股份有限公司開發的基因治療藥物pCK-HGF-X7，也正在由北京協和醫院牽頭，在包括本中心在內的全國17家研究單位共同參與下開展針對CLI的Ⅲ期臨床試驗。
2.3 FGF
研究[37]表明，組織缺血后局部內源性FGF表達量增加，促進血管再生以適應缺血的變化，但增加的量不足以完全改善組織缺血狀態。FGF有23個亞型，但只有FGF-1已被用于外周動脈疾病的研究。基礎研究和早期臨床研究均顯示了FGF-1裸質粒-NV1FGF在缺血區誘導功能性動脈的積極作用[38]。 Comerota等[21]進行的Ⅰ期臨床試驗共納入51例組織壞死和靜息痛的CLI患者，他們接受了肌肉注射NV1FGF治療。結果顯示，NV1FGF 耐受性良好，患者在 ABI、跛行、經皮組織氧分壓和潰瘍大小方面均有顯著改善（P<0.001）。因此，NV1FGF對終末期肢體缺血患者的治療可能有效。2008年，Nikol 等[22]共招募了125例無法進行手術血運重建的CLI患者，隨機分配至NV1FGF組與安慰劑對照組，NV1FGF組患者在第1天、第15天、第30天和第45天接受4次NV1FGF的肌肉注射（每次4 mg，總共16 mg），其研究結果顯示，對CLI患者肌肉注射NV1FGF質粒無法促進潰瘍愈合，但使用NV1FGF能顯著降低所有截肢（P=0.015）和大截肢（P=0.015）的風險，而且NV1FGF能夠降低CLI患者的死亡風險。基于上述研究，研究人員又開展了Ⅲ期臨床研究—TAMARIS試驗[23]，共納入525例無法進行手術行血運重建的CLI患者，但TAMARIS試驗沒能提供任何證據表明NV1FGF可有效減少CLI患者的截肢率或死亡率。
2.4 HIF-1α
HIF-1α 是一種誘導性轉錄調節因子，通過對VEGF、促血管生成素等多種血管生長因子基因的編碼調控，在胞內氧穩態調節中起重要作用[39]。在缺氧條件下，HIF-1α表達并對多種轉錄因子進行調節，來控制血管生成。 動物實驗[40]表明，HIF-1α能夠有效增加毛細血管密度與側支血管的數量。 2011年，Creager等[41]報道了唯一一項HIF-1α基因治療間歇性跛行患者的Ⅱ期臨床試驗，結果顯示HIF-1α基因治療并不能改善患者的最大步行距離。
3 新型非病毒類基因載體
基因治療需要安全高效的基因載體來保護核酸分子，提高其體內穩定性并實現高效轉染，最大限度地發揮目的基因的治療作用。基因載體通常分為病毒和非病毒兩類。憑借高轉染效率和長半衰期，病毒成為了常用的基因治療載體，但病毒載體導致的細胞毒性、免疫原性和致癌作用嚴重限制了它們在臨床的應用[42-43]。2020 年 1 月 6 日，Science 期刊在基于大型成年犬 A 型血友病基因治療的一篇報道中再次指出，腺相關病毒作為基因載體存在潛在致癌性[44]。裸質粒作為最常用的非病毒類載體，雖然有著良好的生物安全性，但較低的基因轉染效率也大大限制了其的臨床應用[45]。所以，開發安全可靠、具有高基因轉染效率的非病毒類基因遞送載體，是當前基因治療需要克服的一大難點。下面，筆者就對當下主要的新型非病毒類基因遞送載體進行歸納與總結。
3.1 陽離子脂質體
陽離子脂質是帶正電荷的兩親分子，由3個基本的化學官能域組成：親水頭基、疏水結構域和連接鍵，連接陽離子頭基和疏水尾結構域[46]。通過靜電與疏水相互作用，帶正電的脂質體極性頭部能夠高效結合帶負電荷的核酸磷酸基團而形成陽離子脂質體-DNA復合物，從而有效防止核酸被血液中的核酸酶降解[47]。脂質體有著良好的生物降解性，免疫原性低，但是其潛在的細胞毒性不容忽視。近年來，國內外研究者通過結構修飾和表面改性來盡可能地減少陽離子脂質體的不良反應，例如在脂質體外修飾聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），可以減少它們與帶負電荷的細胞表面的相互作用，以提高其在血液循環中作為載體的穩定性及作用時間[48]。2017年，Fisher等[49]報道將攜帶小分子干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）的細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）修飾的中性PEG化的脂質體通過注射的方法來治療心血管疾病，研究結果顯示， CPPs修飾的中性PEG化的脂質體兼具低細胞毒性與高siRNA轉染效率。上述研究結果均表明，結構修飾能夠有效提高脂質體作為基因載體的治療效果，其有望成為潛在的血管性疾病基因治療的納米載體之一。
3.2 陽離子聚合物
作為非病毒類基因治療載體之一，陽離子聚合物載體如聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）、聚氨基胺和聚氨基酯，具有較好的臨床應用前景[50]。在生物pH環境下，陽離子聚合物能夠與DNA結合形成復合物，并將DNA壓縮到一個較小的尺寸。陽離子聚合物特有的正電性使得靶細胞能夠對基因納米粒進行有效的細胞吞噬，但其易與生物體內的負電結合而不利于體內轉運；同時，還存有潛在的細胞毒性。憑借較小的粒徑，陽離子聚合物的改性相對容易進行。對于陽離子聚合物基因載體的改造，可以對其進行結構修飾，主要策略集中在對伯胺、仲胺和叔胺基的修飾；另一方面可以對其進行靶向修飾，例如采用生物活性基團特異性配體來修飾基因載體。通過對伯胺、仲胺和叔胺基的修飾或采用生物活性基團特異性配體對陽離子聚合物進行修飾，能夠有效降低其細胞毒性[51]。此外，通過引入陰性成分或者降解性基團，可在降低陽離子聚合物潛在細胞毒性的基礎上，有效提高其基因轉染效率，從而提高基因納米粒的生物利用度[52]。Liu等[53]研究發現，經羧甲基殼聚糖改性后的PEI（carboxymethyl chitosan-PEI，CMCS-PEI）對DNA有著較強的絡合作用；體外結果表明，與傳統PEI相比，CMCS-PEI有著更好的生物相容性和基因轉染效率。
3.3 聚合物膠束
聚合物膠束是一類由兩親性表面活性劑分子構成的球形聚集體。在水溶液中分散時， 其親水性“頭部”位于表面， 疏水性“尾部”位于內核。聚合物膠束具有很好的穩定性和較高的載藥率，且可實現藥物的可控釋放。聚合物膠束最重要的特性之一，是能夠增加難溶性藥物的溶解度和生物利用率，水溶性差的藥物可被包載在膠束的疏水核中。聚合物膠束多為由兩親性的嵌段共聚物組成的自組裝顆粒，如聚乙二醇-b-聚乳酸、 聚乙二醇-b-聚ε-己內酯等。良好的生物相容性與生物可降解性是聚合物膠束的優點，但是也有著細胞攝取率低、體內穩定性差的缺點。通過受體介導、化學改性或物理改性，能夠改變聚合物膠束的穩定性、釋放曲線與基因包載能力。Huo等[54] 嘗試運用狂犬病病毒糖蛋白肽標記的PEG化的聚天冬氨酸組成的聚離子膠束衍生物—聚乙二醇化聚天冬氨酰肼（pegylated polyasparthydrazide，PAHy）作為siRNA遞送載體，研究結果顯示，相較于未修飾的膠束，PAHy有著更高的細胞吞噬與基因轉染效率；動物實驗結果也證實了其良好的腦靶向性。
3.4 金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）
AuNPs 是指直徑為1～200 nm的金單質聚合體。AuNPs有良好的分散性與形態可控性，表面修飾易于進行，適合作為基因遞送載體。但其高化學穩定性使得其容易在細胞內累積，進而產生細胞毒性。研究人員通過對AuNPs進行聚合物表面修飾，提高AuNPs的水溶性，減少聚集，進而降低其細胞毒性。一般地， AuNPs的基因遞送方式主要是與帶正電荷的合成高分子結合成復合物載體而進行基因遞送，或將DNA硫醇化使其能夠靶向運輸至細胞質。Encabo-Berzosa等[55]研究報道， PEG修飾的聚乙酰亞胺-金納米粒有著高基因轉染效率與低細胞毒性的特點。Tian等[56]將PEG修飾的AuNPs作為基因遞送載體，結果表明，此基因納米粒主要分布于梗死區域，其能夠有效減小心肌梗死范圍，并在一定程度上提高心肌收縮力。
3.5 硅納米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）
已知的是，單純的SiNPs無法進行基因包載，大部分研究者采用氨基硅烷修飾后再進行基因遞送。通過表面改性后，SiNPs可顯示出不同的細胞毒性和生物分布，陽性SiNPs因與細胞膜作用強烈而表現為高細胞毒性[57]，中性SiNPs則顯示出良好的被動靶向能力。Sun等[58]合成了含大小介孔的、有核-殼結構的二氧化硅/有機硅納米系統進行siRNA與阿霉素共遞送，結果表明從有機二氧化硅殼釋放的siRNA通過降低癌細胞的多重耐藥性，增強了二氧化硅核心后釋放阿霉素的治療效果。
4 結論與展望
綜上所述，大量基礎研究與臨床試驗的結果均表明，基因TA治療已經取得了很大的進展，HGF基因治療在日本也已經成功應用于臨床，但仍有部分問題未得到解決：① 仍然需要更大樣本量的循證醫學證據來明確基因療法的安全性與遠期療效； ② 仍然缺少完全安全可靠且具有高轉染效率的基因遞送載體；③ 體內血管生成涉及多種細胞因子的協同作用，但現有研究往往局限于單因子或者雙因子，仍需要深入探究多種細胞因子間的協同作用。此外，較少的研究表明基因治療結合干細胞治療的效果優于單獨基因治療和單獨干細胞治療，有可能成為CLI患者最佳的無創治療方法，具有良好的研究價值與應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李擁軍負責該論文的選題、設計研究方案及框架，并在論文的創作過程提供了修改意見；桂亮負責查閱文獻、撰寫論文初稿、修改稿件以及在論文創作過程中進行修改。
隨著我國人口老齡化不斷加速，外周動脈疾病（peripheral arterial disease，PAD）發病率逐年升高，60歲以上人群中發病率為19.8%[1]，50歲以上的糖尿病人群中其發病率高達24.1%[2]；此外，約10%的PAD患者甚至進一步發展為嚴重的下肢缺血（critical limb ischemia，CLI），臨床表現為靜息痛（持續2周以上）、潰瘍或者壞疽。CLI患者的生活質量指數與晚期癌癥患者相似，且在最初診斷后5年內，其病死率超過50%[3]。傳統外科手術或血管腔內治療是目前CLI患者的臨床首選治療方法，但是仍有約30%的患者因嚴重的并發癥不適合行手術或腔內治療[4]。所以，通過非手術治療改善CLI患者肢體血流灌注與相關臨床癥狀，降低截肢率和病死率，是當前亟需解決的臨床問題[5]。
1 治療性血管生成
Isner等[6]在1999年首次提出治療性血管生成（therapeutic angiogenesis，TA）的概念，即一種全新的治療性手段，通過應用細胞因子或成血管細胞轉入缺血組織，轉化局部微環境來提供血管生成的環境以促進缺血組織毛細血管網絡生成和側支循環的建立，包括血管生成、動脈形成與血管發生。近10年來，有研究[5, 7]表明，TA能夠有效誘使CLI組織內的血管新生與側支循環建立，從而改善缺血區域的血流灌注，為CLI的治療帶來新的思路與策略。
1.1 血管生成
血管生成是指從已經存在的毛細血管芽生出新的以毛細血管為主的血管系統（直徑8～12 μm），延伸并擴展原有毛細血管網的過程[8]； 常見于缺血組織、傷口愈合、腫瘤及心肌梗死后，缺血缺氧是其主要誘因。 組織內缺氧激活缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），通過復雜的鏈級反應導致血管生成[9]；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是此過程中最重要的細胞因子，其在毛細血管床的初始形成期發揮主導性作用[10]。
1.2 動脈形成
動脈形成發生于動脈水平，指已存在的血管通過結構重塑以擴大管腔直徑，形成直徑20～100 μm、富含成熟中膜的新側支動脈[11]。研究[9]表明，1條側支動脈的建立能使遠端缺血區域內的血流灌注增加20～30倍，效果遠優于單純毛細血管網的增加。有效建立新的側支動脈是TA的主要目標。已知血管剪切壓力改變和炎癥反應是其主要誘因[12]。剪切壓力增加能激活內皮細胞釋放細胞因子以募集單核細胞，進而引發炎癥反應，這種炎癥環境恰好是血管側支化信號傳遞的重要因素之一。
1.3 血管發生
血管發生是指內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化為血管內皮細胞形成原始血管的過程。過去該過程被認為僅發生于胚胎期[13]。有研究[14]報道在成人血循環中成功分離出EPCs，從而證實成年機體內存在EPCs分化為原始血管的過程。
2 細胞因子與基因治療
血管生成需要多種功能性細胞因子參與。目前，國內外關于VEGF、HIF-1α、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）的研究最為廣泛。基礎研究和Ⅰ期臨床試驗結果證實了直接使用細胞因子的促血管生長作用[15]。但大型對照研究顯示其不能有效改善CLI患者的臨床癥狀。而且，直接使用功能性細胞因子往往難以達到有效治療濃度，且細胞因子價格昂貴、半衰期短，需頻繁使用[16]。此外，最佳劑量、給藥濃度、持續給藥時間及給藥方式也是細胞因子療法尚未明確與克服的難題。 基因治療可避免上述弊端，即運用載體將外源性核酸序列遞送至缺血組織的靶細胞，致目的基因在局部持續表達，合成所需的細胞因子。鑒于基因治療的諸多優勢，其已成為CLI性疾病的研究熱點之一。有關基因TA治療PAD的臨床試驗總結見表1。
表1
基因TA治療PAD患者的臨床試驗總結
2.1 VEGF
VEGF是目前研究最廣泛的血管生成因子，共包含A、B、C、D、E、F和胎盤生長因子 7個家族成員；其中，VEGF-A的功能性最強、含量最為豐富，是最常見的研究對象，包含VEGF-121、VEGF-145、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和VEGF-206共6個亞型[28]。目前為止，研究人員主要針對VEGF-165開展相關基礎實驗與臨床研究。 M?kinen等[18]研究報道，通過動脈內注射腺病毒或質粒攜帶的VEGF-165基因后，數字減影血管造影證實兩種方法均可致缺血部位的側支顯著增多，但臨床效果與對照組比較無明顯差異；此外，腺病毒組患者體內的抗腺病毒抗體增加了61%。2006年，Kusumanto等[20]報道，對54例由糖尿病引發的嚴重CLI 患者肌肉注射VEGF-165裸質粒，結果顯示VEGF-165裸質粒能夠改善患者的皮膚潰瘍與ABI（潰瘍改善率方面試驗組與安慰劑組對比： 25.9% 比 0%，P=0.01），但無法有效降低截肢率（試驗組與安慰劑組對比： 13.6% 比 22.2%，P>0.05）。Ehrbar等[29]報道了一種新型VEGF121基因遞送系統，其能夠長期低劑量釋放VEGF，有效誘導并改善血管形成。迄今為止，PAD 患者的 VEGF 基因治療在 Ⅲ期臨床試驗中未能顯示出受益的證據。另外，接受VEGF基因治療的患者中，約60%發生劑量依賴性下肢水腫。值得注意的是，尚無證據明確證實VEGF與血管生成間的直接關系。與此說法相反的是，配體的濃度決定著其是起促血管生成作用還是抗血管生成作用[30]。另外，相關計算模型表明，VEGF及其受體的基因表達及活動度與其濃度存在相關性[31]。
2.2 HGF
HGF是一種多功能性細胞因子，其能夠在抑制炎癥、水腫和細胞衰老的同時發揮促血管生成的作用[32-33]。 而且，HGF能夠同時誘導內皮細胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）遷移，但是僅促進ECs分裂增殖而不引起VSMCs增殖，從而防止內膜增生導致的管腔狹窄、閉塞。 國內外學者進行的大量基礎研究與臨床試驗證實了HGF基因治療的安全性與有效性。 2001年，Taniyama等[34]通過建立糖尿病大鼠后肢缺血模型，并肌肉注射給予人HGF質粒，結果顯示HGF基因治療能夠顯著升高缺血區域內毛細血管密度。Morishita等[35]開展了Ⅰ期臨床試驗，對 6例CLI患者給予肌肉注射HGF質粒，所有受試者臨床癥狀明顯改善，且均未出現與基因轉染相關的不良反應如水腫、血管瘤和腫瘤形成。隨后，Morishita等[24]進一步開展Ⅱa期臨床試驗，結果顯示HGF質粒能夠有效加速CLI患者的潰瘍愈合，缺血性潰瘍最大徑試驗前后對比為（3.08±1.54） cm 比 （2.32±1.88）cm， P=0.007，并緩解靜息痛。2015年，Cui等[36]招募21例CLI受試者進行表達HGF的裸質粒DNA的Ⅰ期臨床試驗，結果同樣肯定了HGF基因治療的安全性與有效性。此外， 2010年Shigematsu等[27]開展了一項多中心、隨機、雙盲與安慰劑對照的Ⅲ期臨床試驗，以期評估多點肌肉注射HGF基因質粒治療CLI的安全性與有效性，該試驗共納入44例CLI患者，最終研究結果表明，相較于對照組，HGF質粒治療組患者的皮膚潰瘍面積明顯縮小、靜息痛顯著緩解，差異均具有統計學意義（靜息痛緩解率試驗組與安慰劑組對比為70.4% 比30.8%，P=0.014）；而且試驗組患者的生活質量也得到了較大的提高。此外，尚無研究顯示HGF基因治療會引起下肢水腫和存在其他不良副作用。憑借生物學功能多樣性的優勢，在眾多細胞因子的基因治療中，HGF基因治療目前最有希望成功進行臨床轉化。在日本，HGF基因治療已經被批準用于無法進行血運重建的下肢嚴重缺血患者。在國內，北京諾思蘭德生物技術股份有限公司開發的基因治療藥物pCK-HGF-X7，也正在由北京協和醫院牽頭，在包括本中心在內的全國17家研究單位共同參與下開展針對CLI的Ⅲ期臨床試驗。
2.3 FGF
研究[37]表明，組織缺血后局部內源性FGF表達量增加，促進血管再生以適應缺血的變化，但增加的量不足以完全改善組織缺血狀態。FGF有23個亞型，但只有FGF-1已被用于外周動脈疾病的研究。基礎研究和早期臨床研究均顯示了FGF-1裸質粒-NV1FGF在缺血區誘導功能性動脈的積極作用[38]。 Comerota等[21]進行的Ⅰ期臨床試驗共納入51例組織壞死和靜息痛的CLI患者，他們接受了肌肉注射NV1FGF治療。結果顯示，NV1FGF 耐受性良好，患者在 ABI、跛行、經皮組織氧分壓和潰瘍大小方面均有顯著改善（P<0.001）。因此，NV1FGF對終末期肢體缺血患者的治療可能有效。2008年，Nikol 等[22]共招募了125例無法進行手術血運重建的CLI患者，隨機分配至NV1FGF組與安慰劑對照組，NV1FGF組患者在第1天、第15天、第30天和第45天接受4次NV1FGF的肌肉注射（每次4 mg，總共16 mg），其研究結果顯示，對CLI患者肌肉注射NV1FGF質粒無法促進潰瘍愈合，但使用NV1FGF能顯著降低所有截肢（P=0.015）和大截肢（P=0.015）的風險，而且NV1FGF能夠降低CLI患者的死亡風險。基于上述研究，研究人員又開展了Ⅲ期臨床研究—TAMARIS試驗[23]，共納入525例無法進行手術行血運重建的CLI患者，但TAMARIS試驗沒能提供任何證據表明NV1FGF可有效減少CLI患者的截肢率或死亡率。
2.4 HIF-1α
HIF-1α 是一種誘導性轉錄調節因子，通過對VEGF、促血管生成素等多種血管生長因子基因的編碼調控，在胞內氧穩態調節中起重要作用[39]。在缺氧條件下，HIF-1α表達并對多種轉錄因子進行調節，來控制血管生成。 動物實驗[40]表明，HIF-1α能夠有效增加毛細血管密度與側支血管的數量。 2011年，Creager等[41]報道了唯一一項HIF-1α基因治療間歇性跛行患者的Ⅱ期臨床試驗，結果顯示HIF-1α基因治療并不能改善患者的最大步行距離。
3 新型非病毒類基因載體
基因治療需要安全高效的基因載體來保護核酸分子，提高其體內穩定性并實現高效轉染，最大限度地發揮目的基因的治療作用。基因載體通常分為病毒和非病毒兩類。憑借高轉染效率和長半衰期，病毒成為了常用的基因治療載體，但病毒載體導致的細胞毒性、免疫原性和致癌作用嚴重限制了它們在臨床的應用[42-43]。2020 年 1 月 6 日，Science 期刊在基于大型成年犬 A 型血友病基因治療的一篇報道中再次指出，腺相關病毒作為基因載體存在潛在致癌性[44]。裸質粒作為最常用的非病毒類載體，雖然有著良好的生物安全性，但較低的基因轉染效率也大大限制了其的臨床應用[45]。所以，開發安全可靠、具有高基因轉染效率的非病毒類基因遞送載體，是當前基因治療需要克服的一大難點。下面，筆者就對當下主要的新型非病毒類基因遞送載體進行歸納與總結。
3.1 陽離子脂質體
陽離子脂質是帶正電荷的兩親分子，由3個基本的化學官能域組成：親水頭基、疏水結構域和連接鍵，連接陽離子頭基和疏水尾結構域[46]。通過靜電與疏水相互作用，帶正電的脂質體極性頭部能夠高效結合帶負電荷的核酸磷酸基團而形成陽離子脂質體-DNA復合物，從而有效防止核酸被血液中的核酸酶降解[47]。脂質體有著良好的生物降解性，免疫原性低，但是其潛在的細胞毒性不容忽視。近年來，國內外研究者通過結構修飾和表面改性來盡可能地減少陽離子脂質體的不良反應，例如在脂質體外修飾聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），可以減少它們與帶負電荷的細胞表面的相互作用，以提高其在血液循環中作為載體的穩定性及作用時間[48]。2017年，Fisher等[49]報道將攜帶小分子干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）的細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）修飾的中性PEG化的脂質體通過注射的方法來治療心血管疾病，研究結果顯示， CPPs修飾的中性PEG化的脂質體兼具低細胞毒性與高siRNA轉染效率。上述研究結果均表明，結構修飾能夠有效提高脂質體作為基因載體的治療效果，其有望成為潛在的血管性疾病基因治療的納米載體之一。
3.2 陽離子聚合物
作為非病毒類基因治療載體之一，陽離子聚合物載體如聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）、聚氨基胺和聚氨基酯，具有較好的臨床應用前景[50]。在生物pH環境下，陽離子聚合物能夠與DNA結合形成復合物，并將DNA壓縮到一個較小的尺寸。陽離子聚合物特有的正電性使得靶細胞能夠對基因納米粒進行有效的細胞吞噬，但其易與生物體內的負電結合而不利于體內轉運；同時，還存有潛在的細胞毒性。憑借較小的粒徑，陽離子聚合物的改性相對容易進行。對于陽離子聚合物基因載體的改造，可以對其進行結構修飾，主要策略集中在對伯胺、仲胺和叔胺基的修飾；另一方面可以對其進行靶向修飾，例如采用生物活性基團特異性配體來修飾基因載體。通過對伯胺、仲胺和叔胺基的修飾或采用生物活性基團特異性配體對陽離子聚合物進行修飾，能夠有效降低其細胞毒性[51]。此外，通過引入陰性成分或者降解性基團，可在降低陽離子聚合物潛在細胞毒性的基礎上，有效提高其基因轉染效率，從而提高基因納米粒的生物利用度[52]。Liu等[53]研究發現，經羧甲基殼聚糖改性后的PEI（carboxymethyl chitosan-PEI，CMCS-PEI）對DNA有著較強的絡合作用；體外結果表明，與傳統PEI相比，CMCS-PEI有著更好的生物相容性和基因轉染效率。
3.3 聚合物膠束
聚合物膠束是一類由兩親性表面活性劑分子構成的球形聚集體。在水溶液中分散時， 其親水性“頭部”位于表面， 疏水性“尾部”位于內核。聚合物膠束具有很好的穩定性和較高的載藥率，且可實現藥物的可控釋放。聚合物膠束最重要的特性之一，是能夠增加難溶性藥物的溶解度和生物利用率，水溶性差的藥物可被包載在膠束的疏水核中。聚合物膠束多為由兩親性的嵌段共聚物組成的自組裝顆粒，如聚乙二醇-b-聚乳酸、 聚乙二醇-b-聚ε-己內酯等。良好的生物相容性與生物可降解性是聚合物膠束的優點，但是也有著細胞攝取率低、體內穩定性差的缺點。通過受體介導、化學改性或物理改性，能夠改變聚合物膠束的穩定性、釋放曲線與基因包載能力。Huo等[54] 嘗試運用狂犬病病毒糖蛋白肽標記的PEG化的聚天冬氨酸組成的聚離子膠束衍生物—聚乙二醇化聚天冬氨酰肼（pegylated polyasparthydrazide，PAHy）作為siRNA遞送載體，研究結果顯示，相較于未修飾的膠束，PAHy有著更高的細胞吞噬與基因轉染效率；動物實驗結果也證實了其良好的腦靶向性。
3.4 金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）
AuNPs 是指直徑為1～200 nm的金單質聚合體。AuNPs有良好的分散性與形態可控性，表面修飾易于進行，適合作為基因遞送載體。但其高化學穩定性使得其容易在細胞內累積，進而產生細胞毒性。研究人員通過對AuNPs進行聚合物表面修飾，提高AuNPs的水溶性，減少聚集，進而降低其細胞毒性。一般地， AuNPs的基因遞送方式主要是與帶正電荷的合成高分子結合成復合物載體而進行基因遞送，或將DNA硫醇化使其能夠靶向運輸至細胞質。Encabo-Berzosa等[55]研究報道， PEG修飾的聚乙酰亞胺-金納米粒有著高基因轉染效率與低細胞毒性的特點。Tian等[56]將PEG修飾的AuNPs作為基因遞送載體，結果表明，此基因納米粒主要分布于梗死區域，其能夠有效減小心肌梗死范圍，并在一定程度上提高心肌收縮力。
3.5 硅納米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）
已知的是，單純的SiNPs無法進行基因包載，大部分研究者采用氨基硅烷修飾后再進行基因遞送。通過表面改性后，SiNPs可顯示出不同的細胞毒性和生物分布，陽性SiNPs因與細胞膜作用強烈而表現為高細胞毒性[57]，中性SiNPs則顯示出良好的被動靶向能力。Sun等[58]合成了含大小介孔的、有核-殼結構的二氧化硅/有機硅納米系統進行siRNA與阿霉素共遞送，結果表明從有機二氧化硅殼釋放的siRNA通過降低癌細胞的多重耐藥性，增強了二氧化硅核心后釋放阿霉素的治療效果。
4 結論與展望
綜上所述，大量基礎研究與臨床試驗的結果均表明，基因TA治療已經取得了很大的進展，HGF基因治療在日本也已經成功應用于臨床，但仍有部分問題未得到解決：① 仍然需要更大樣本量的循證醫學證據來明確基因療法的安全性與遠期療效； ② 仍然缺少完全安全可靠且具有高轉染效率的基因遞送載體；③ 體內血管生成涉及多種細胞因子的協同作用，但現有研究往往局限于單因子或者雙因子，仍需要深入探究多種細胞因子間的協同作用。此外，較少的研究表明基因治療結合干細胞治療的效果優于單獨基因治療和單獨干細胞治療，有可能成為CLI患者最佳的無創治療方法，具有良好的研究價值與應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李擁軍負責該論文的選題、設計研究方案及框架，并在論文的創作過程提供了修改意見；桂亮負責查閱文獻、撰寫論文初稿、修改稿件以及在論文創作過程中進行修改。
