引用本文： 盧戰輝, 白陽秋, 孫趁意, 張曉菲. 海參多糖調控JAK2/STAT3/survivin通路對肝癌細胞增殖和凋亡的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(7): 875-880. doi: 10.7507/1007-9424.202109046 復制
肝癌是常見高發性惡性腫瘤之一[1]。目前手術治療仍是最有效的根治肝癌的方法[2-3]，但并不是所有肝癌患者都有機會接受手術治療。對于由于各種原因無法手術治療的肝癌患者可選擇化學藥物治療，可在一定程度上控制疾病的發展，但其嚴重副作用不可忽視[4]。隨著中醫的快速發展，越來越多的中醫藥在防治腫瘤發生及發展中具有良好的作用，可以減少或減輕副作用，還可在一定程度上增強患者的體質[5]。海參是一種食用性海洋動物，富含豐富的營養物質如膠原蛋白、維生素、皂苷、多糖等[6]。已有研究[7]表明，海參中的活性物質在人體抗癌過程中具有非常重要的作用，如從海參中分離的三萜糖苷，可有效抑制肝癌細胞HepG2的黏附、遷移、侵襲等過程，同時對HepG2細胞的增殖有明顯的抑制作用。但關于海參多糖在抗癌作用機制中的研究還較少，尤其在肝癌中更少。已有研究[8]證明，通過體外沉默STAT3可阻斷JAK2/STAT3信號通路，進而降低其下游靶標基因survivin的表達，同時也可抑制肝癌細胞的增殖。因此，本研究旨在探討海參多糖對肝癌細胞增殖、凋亡的影響并探討其對JAK2/STAT3/survivin通路的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料
人肝癌HepG2細胞購自上海北諾生物科技有限公司（貨號：ATCC0361，美國ATCC），鄭州市金水區總醫院凍存；海參多糖購自四川維克奇生物有限公司（貨號：wkq-08920，高效液相色譜法檢測其純度≥90%）；MTT、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）均購自美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；總RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自武漢純度生物科技有限公司（貨號分別為CD-13433-ML、CD-13559-ML）；一抗兔抗人磷酸化（phosphorylated，p）-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-survivin、survivin抗體均購自美國eBioscience公司。20只4~6周齡BALB/c裸鼠（18~25 g）購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號為SCXK（京）2019-0014；抗原修復溶液（貨號：p0081）購自上海Beyotime公司；過氧化物酶阻滯劑（貨號：BF06060）購自北京Biodragon公司；CO2培養箱購自上海Heal Force（型號：HF151）；流式細胞儀購自美國NovoCyte（型號：NovoCyt）；全自動酶標儀購自美國Thermofisher（型號：5119000）；熒光定量PCR儀、全自動凝膠成像分析系統均購自美國BIO-RAD公司（型號分別為1855200、1708271）；電子天平購自中國SOPTOP（型號：AE1202）；光學顯微鏡、切片機購自德國Leica公司（型號分別為DM4M、RM2235）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及干預
人肝癌HepG2細胞維持培養在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，在5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養直到細胞貼壁生長超過80%，先使用胰蛋白酶洗滌消化，再使用DMEM培養基洗滌3次（800 r/min離心3 min，r=10 cm），棄上清，收集細胞，進行傳代培養，培養至第3代細胞才可繼續實驗。細胞生長至對數生長期時分裝于24孔培養板中，每孔中含有106個細胞。持續觀察細胞的生長情況直至貼壁生長后，各孔中分別加入0、50、100、200 μg/mL[6]的海參多糖溶液（0 μg/mL海參多糖溶液時細胞使用含100 μL的PBS培養），每個濃度設4個復孔。持續培養36 h。
1.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況
不同濃度海參多糖處理細胞后培養12 h、24 h、36 h時依次加入20 μL MTT溶液在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養4 h后小心地去除上清，然后每孔依次加入200 μL 二甲基亞砜溶液在37 ℃的培養箱孵育20 min，隨后于570 nm波長處測定細胞吸光度（absorbance，A）值，將0 μg/mL海參多糖處理細胞的A值作為對照組，計算另外3個濃度處理后的細胞（簡稱“處理組”）在各個時間點的增殖抑制率，其計算公式為“增殖抑制率=（1–A處理組/A對照組）×100%”。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況
調整細胞濃度為106個/mL后接種于80 mm培養皿中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養36 h后終止培養收集細胞，加入PBS洗滌后獲得細胞懸浮液。隨后依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶溶液，充分混勻后避光反應，30 min 后在流式細胞儀中檢測不同濃度海參多糖處理36 h時的細胞凋亡情況。細胞凋亡率=早期細胞凋亡率（右下象限）+晚期細胞凋亡率（右上象限）。
1.2.4 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達水平
收集經不同濃度海參多糖處理36 h后的細胞，使用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。各基因的引物序列見表1。采用qRT-PCR法檢測每個PCR反應管內熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數，即Ct值，以2–ΔΔCt計算基因的相對表達量，以β-actin為內參基因，其中ΔCt=Ct目的基因–Ct內參基因、ΔΔCt=ΔCt處理組–ΔCt對照組。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法檢測細胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化的蛋白表達
收集經不同濃度海參多糖處理36 h后的細胞，按照試劑盒方法進行細胞總蛋白提取，使用BCA法進行總蛋白定量，取20 μL蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將蛋白膠小心轉移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，依次在牛奶中添加對應的一抗，4 ℃孵育10 h，TBST沖洗。依次加入二抗（辣根過氧化物酶標記），室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。最后在膜上加入增強化學發光液，將聚偏二氟乙烯膜充分覆蓋后，拍照觀測蛋白條帶，使用Image J軟件進行灰度值分析。
1.2.6 裸鼠異種種植
將經不同濃度（0、50、100、200 μg/mL）海參多糖處理后狀態良好的肝癌HepG2細胞使用PBS重懸（5×106個/mL）后與基質膠1∶1混合，吸取50 μL混懸液于裸鼠皮下注射，每個濃度5只裸鼠。每5 d監測1次裸鼠實體瘤的生長情況，20 d后每3 d監測1次腫瘤生長情況，于第35天時通過CO2窒息對小鼠實施安樂死，同時采用天平稱取腫瘤組織的質量、游標卡尺測量腫瘤組織的體積，隨后將腫瘤組織在10%甲醛中固定24 h后通過石蠟包埋。腫瘤體積（mm3）=腫瘤組織的長徑×短徑2/2。
1.2.7 免疫組織化學染色方法檢測腫瘤組織中磷酸化JAK2、STAT3、survivin的蛋白表達情況
將1.2.6中的石蠟包埋的裸鼠腫瘤組織通過切片機切成4 μm厚的切片，依次與抗原修復液、內源性過氧化物阻滯劑孵育，隨后在室溫下與5%的胎牛血清孵育1 h后，將組織切片與一抗低溫過夜孵育，隔天使用二抗孵育30 min后，加入3,3′ -二氨基聯苯胺處理后使用蘇木精染色，最后在顯微鏡下觀察結果。以PBS代替一抗為陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照。含棕色顆粒的細胞為陽性細胞，以陽性細胞占總細胞的比例來量化和評估不同組中的蛋白表達情況。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行統計學分析。數據經過檢驗符合正態分布者以均數±標準差（
±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖情況
不同濃度海參多糖處理后12 h、24 h、36 h時細胞增殖抑制率結果見圖1。在相同時間點，不同濃度間總體比較差異均有統計學意義（12 h：F=13.409、P=0.002；24 h：F=13.954、P=0.002；36 h：F=16.192、P=0.001），在觀察濃度范圍內，隨著海參多糖濃度增加而增殖抑制率增高（P<0.05）。在相同濃度，3個時間點的細胞增殖抑制率總體比較差異也均有統計學意義（50 μg/mL：F=13.538、P=0.002；100 μg/mL：F=14.106、P=0.002；200 μg/mL：F=19.481、P=0.001），在觀察時間范圍內，隨著時間的延長而增殖抑制率增高（P<0.05）。
圖1
示經不同濃度海參多糖處理后細胞的增殖情況
與相同時間點內50 μg/mL濃度比較，*
2.2 細胞凋亡率結果
流式細胞技術分析結果見圖2a~2d，可見在0 μg/mL海參多糖濃度時并未出現大量的細胞凋亡，其他濃度海參多糖處理后出現不同程度的細胞凋亡。定量分析結果（圖2e）顯示，不同濃度海參多糖處理后的細胞凋亡率總體比較差異有統計學意義（F=117.110，P<0.001），在觀察濃度范圍內，隨著海參多糖濃度的增加而細胞凋亡率增高（P<0.05）。
圖2
示經不同濃度海參多糖處理后細胞的凋亡情況及細胞中JAK2、STAT3、survivin表達情況
a~d：分別為流式細胞技術檢測0、50、100、200 μg/mL濃度處理后的細胞凋亡結果；e：細胞凋亡率；f：mRNA半定量表達結果；g：蛋白表達定性結果（1~4分別表示0、50、100、200 μg/mL濃度）；h：蛋白表達半定量結果。與0 μg/mL濃度比較，*
2.3 細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA和蛋白水平情況
① qRT-PCR法檢測不同濃度海參多糖處理后細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達半定量結果見圖2f，均未發現3個指標在不同濃度間總體比較差異有統計學意義（P>0.05）。② Western blot法檢測不同濃度海參多糖處理后細胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化蛋白表達的定性結果見圖2g，半定量結果見圖2h，不同濃度海參多糖處理后細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和p-survivin/survivin蛋白水平比值總體比較差異有統計學意義（P<0.05），在觀察濃度范圍內均隨著海參多糖濃度的增加而各蛋白表達降低（P<0.05）。
2.4 海參多糖處理后對裸鼠體內腫瘤的影響
不同濃度（0、50、100及200 μg/mL）海參多糖處理后的肝癌HepG2細胞種植于裸鼠后腫瘤的生長情況見圖3a，隨著海參多糖濃度的增高而裸鼠腫瘤組織的質量（圖3b）和體積（圖3c）均減輕或減小（P<0.05）。同時免疫組織化學染色結果顯示，處理組（50、100、200 μg/mL）中p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表達陽性率均低于對照組（P<0.05）且隨著海參多糖濃度的增高而降低，見圖3d、3e。
圖3
示不同濃度海參多糖處理后對裸鼠體內腫瘤的影響
a：腫瘤大體觀；b：腫瘤組織質量；c：腫瘤組織體積；d：蛋白表達陽性率；e：蛋白表達的定性結果（免疫組織化學方法 × 200）。與0 μg/mL濃度比較，*
3 討論
肝癌的發生及發展是由機體多方面因素共同導致的結果，如癌基因激活或抑癌基因失活、肝細胞結構發生異常、肝癌信號因子被激活同時凋亡途徑被抑制、肝細胞異常增殖、血管內皮生長因子被激發[9]等，但其確切機制仍未明確。由于肝癌發生的隱匿性，多數患者確診時即為中晚期，大部分肝癌患者失去了手術治療的機會[10]，又因其具有高復發率和高轉移率[11]，因此，化學藥物治療是其常采用的方法之一，但其具有較強的副作用，在殺死腫瘤細胞的同時損傷正常細胞，進而使機體產生耐藥性[12]。有臨床實踐[13]表明，在西醫治療方案的同時配合中醫治療能明顯地提高化學藥物治療的效用。
海參具有提高人體免疫力、抗癌等作用[14]，尤其是海參提取物在抗癌過程中具有重要作用，可參與調控癌細胞生長、增殖等多個生物學過程[15]，如在海參中提取的三萜糖苷類物質不僅可以顯著降低HepG2細胞活力，還可誘導細胞凋亡[16]。有研究[6]報道，海參多糖可能通過抑制核因子-κB信號通路中基質金屬蛋白酶-9和血管內皮生長因子的表達進而抑制人腎癌細胞的生長、遷移和侵襲過程。目前關于海參多糖在肝癌細胞中作用的研究較少。本研究在前人研究[6-7]的基礎上選擇海參多糖的處理濃度和觀測時間，經分析發現，海參多糖可以有效抑制肝癌HepG2細胞的增殖且在觀察濃度和時間范圍內隨著時間延長和濃度的增加其增殖抑制率也隨之升高（P<0.05）；且在動物模型體內，海參多糖可有效抑制腫瘤組織生長且隨著濃度增加其抑制效果也隨之更明顯；對培養36 h后的細胞經不同濃度海參多糖處理后可見其凋亡率隨著濃度增加而升高（P<0.05）。以上研究結果提示，海參多糖對肝癌細胞增殖有抑制作用，能促進細胞凋亡且呈現濃度劑量依賴性趨勢。
已有研究[17]證明，JAK2/STAT3通路是機體惡性腫瘤細胞增殖、凋亡的經典調控傳導通路；魏薇等[18]報道，鉤吻總堿可通過抑制人舌癌細胞株JAK2、STAT3和survivin蛋白的磷酸化，進而影響JAK2/STAT3/survivin信號通路發揮作用，達到抑制細胞增殖及促進細胞凋亡的目的。本研究中發現，不同濃度海參多糖處理HepG2細胞36 h時，HepG2細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達量無明顯變化，但p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-survivin/survivin比值在不同濃度間總體比較差異有統計學意義且隨海參多糖濃度增加而降低，在動物體內，海參多糖可顯著下調p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表達陽性率且隨著海參多糖濃度增加隨之降低。以上結果說明，海參多糖可能是通過誘導JAK2/STAT3/survivin途徑相關蛋白磷酸化參與HepG2細胞增殖、凋亡過程，且海參多糖可在一定程度上抑制JAK2、STAT3和survivin的磷酸化表達，進而達到抑制HepG2細胞增殖、促進凋亡的目的。
綜上，海參多糖可抑制人HepG2細胞增殖，促進HepG2細胞凋亡，且隨著濃度增加其效用也隨之增加，并推斷此過程可能是通過調控JAK2/STAT3/survivin通路、抑制JAK2、STAT3和survivin蛋白磷酸化而發揮作用。此研究還需要進一步研究，因本研究尚存在一定不足，首先，本研究并未選擇其他觀測時間點和海參多糖濃度，若再觀察幾個時間點或濃度，結果是否會出現不同變化趨勢還未可知；其次，本研究僅是初步觀察了海參多糖在動物模型體內對腫瘤組織生長的影響，未深入探究體內海參多糖的具體作用機制；此外，本研究并未對海參多糖的藥效學進行深入探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益，不存在研究者與公開研究成果有關的利益沖突。
作者貢獻聲明：盧戰輝負責提出研究選題、設計研究方案、獲取研究經費、技術或材料支持和指導性支持；白陽秋和孫趁意負責實施研究過程、資料采集整理、分析數據、整理文獻和設計文章框架；孫趁意和張曉菲負責起草文章、修訂文章、終審文章。
倫理聲明：本研究動物實驗符合動物倫理要求。
肝癌是常見高發性惡性腫瘤之一[1]。目前手術治療仍是最有效的根治肝癌的方法[2-3]，但并不是所有肝癌患者都有機會接受手術治療。對于由于各種原因無法手術治療的肝癌患者可選擇化學藥物治療，可在一定程度上控制疾病的發展，但其嚴重副作用不可忽視[4]。隨著中醫的快速發展，越來越多的中醫藥在防治腫瘤發生及發展中具有良好的作用，可以減少或減輕副作用，還可在一定程度上增強患者的體質[5]。海參是一種食用性海洋動物，富含豐富的營養物質如膠原蛋白、維生素、皂苷、多糖等[6]。已有研究[7]表明，海參中的活性物質在人體抗癌過程中具有非常重要的作用，如從海參中分離的三萜糖苷，可有效抑制肝癌細胞HepG2的黏附、遷移、侵襲等過程，同時對HepG2細胞的增殖有明顯的抑制作用。但關于海參多糖在抗癌作用機制中的研究還較少，尤其在肝癌中更少。已有研究[8]證明，通過體外沉默STAT3可阻斷JAK2/STAT3信號通路，進而降低其下游靶標基因survivin的表達，同時也可抑制肝癌細胞的增殖。因此，本研究旨在探討海參多糖對肝癌細胞增殖、凋亡的影響并探討其對JAK2/STAT3/survivin通路的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料
人肝癌HepG2細胞購自上海北諾生物科技有限公司（貨號：ATCC0361，美國ATCC），鄭州市金水區總醫院凍存；海參多糖購自四川維克奇生物有限公司（貨號：wkq-08920，高效液相色譜法檢測其純度≥90%）；MTT、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）均購自美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；總RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自武漢純度生物科技有限公司（貨號分別為CD-13433-ML、CD-13559-ML）；一抗兔抗人磷酸化（phosphorylated，p）-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-survivin、survivin抗體均購自美國eBioscience公司。20只4~6周齡BALB/c裸鼠（18~25 g）購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號為SCXK（京）2019-0014；抗原修復溶液（貨號：p0081）購自上海Beyotime公司；過氧化物酶阻滯劑（貨號：BF06060）購自北京Biodragon公司；CO2培養箱購自上海Heal Force（型號：HF151）；流式細胞儀購自美國NovoCyte（型號：NovoCyt）；全自動酶標儀購自美國Thermofisher（型號：5119000）；熒光定量PCR儀、全自動凝膠成像分析系統均購自美國BIO-RAD公司（型號分別為1855200、1708271）；電子天平購自中國SOPTOP（型號：AE1202）；光學顯微鏡、切片機購自德國Leica公司（型號分別為DM4M、RM2235）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及干預
人肝癌HepG2細胞維持培養在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，在5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養直到細胞貼壁生長超過80%，先使用胰蛋白酶洗滌消化，再使用DMEM培養基洗滌3次（800 r/min離心3 min，r=10 cm），棄上清，收集細胞，進行傳代培養，培養至第3代細胞才可繼續實驗。細胞生長至對數生長期時分裝于24孔培養板中，每孔中含有106個細胞。持續觀察細胞的生長情況直至貼壁生長后，各孔中分別加入0、50、100、200 μg/mL[6]的海參多糖溶液（0 μg/mL海參多糖溶液時細胞使用含100 μL的PBS培養），每個濃度設4個復孔。持續培養36 h。
1.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況
不同濃度海參多糖處理細胞后培養12 h、24 h、36 h時依次加入20 μL MTT溶液在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養4 h后小心地去除上清，然后每孔依次加入200 μL 二甲基亞砜溶液在37 ℃的培養箱孵育20 min，隨后于570 nm波長處測定細胞吸光度（absorbance，A）值，將0 μg/mL海參多糖處理細胞的A值作為對照組，計算另外3個濃度處理后的細胞（簡稱“處理組”）在各個時間點的增殖抑制率，其計算公式為“增殖抑制率=（1–A處理組/A對照組）×100%”。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況
調整細胞濃度為106個/mL后接種于80 mm培養皿中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養36 h后終止培養收集細胞，加入PBS洗滌后獲得細胞懸浮液。隨后依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶溶液，充分混勻后避光反應，30 min 后在流式細胞儀中檢測不同濃度海參多糖處理36 h時的細胞凋亡情況。細胞凋亡率=早期細胞凋亡率（右下象限）+晚期細胞凋亡率（右上象限）。
1.2.4 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達水平
收集經不同濃度海參多糖處理36 h后的細胞，使用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。各基因的引物序列見表1。采用qRT-PCR法檢測每個PCR反應管內熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數，即Ct值，以2–ΔΔCt計算基因的相對表達量，以β-actin為內參基因，其中ΔCt=Ct目的基因–Ct內參基因、ΔΔCt=ΔCt處理組–ΔCt對照組。
表1
引物序列
1.2.5 Western blot法檢測細胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化的蛋白表達
收集經不同濃度海參多糖處理36 h后的細胞，按照試劑盒方法進行細胞總蛋白提取，使用BCA法進行總蛋白定量，取20 μL蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將蛋白膠小心轉移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，依次在牛奶中添加對應的一抗，4 ℃孵育10 h，TBST沖洗。依次加入二抗（辣根過氧化物酶標記），室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。最后在膜上加入增強化學發光液，將聚偏二氟乙烯膜充分覆蓋后，拍照觀測蛋白條帶，使用Image J軟件進行灰度值分析。
1.2.6 裸鼠異種種植
將經不同濃度（0、50、100、200 μg/mL）海參多糖處理后狀態良好的肝癌HepG2細胞使用PBS重懸（5×106個/mL）后與基質膠1∶1混合，吸取50 μL混懸液于裸鼠皮下注射，每個濃度5只裸鼠。每5 d監測1次裸鼠實體瘤的生長情況，20 d后每3 d監測1次腫瘤生長情況，于第35天時通過CO2窒息對小鼠實施安樂死，同時采用天平稱取腫瘤組織的質量、游標卡尺測量腫瘤組織的體積，隨后將腫瘤組織在10%甲醛中固定24 h后通過石蠟包埋。腫瘤體積（mm3）=腫瘤組織的長徑×短徑2/2。
1.2.7 免疫組織化學染色方法檢測腫瘤組織中磷酸化JAK2、STAT3、survivin的蛋白表達情況
將1.2.6中的石蠟包埋的裸鼠腫瘤組織通過切片機切成4 μm厚的切片，依次與抗原修復液、內源性過氧化物阻滯劑孵育，隨后在室溫下與5%的胎牛血清孵育1 h后，將組織切片與一抗低溫過夜孵育，隔天使用二抗孵育30 min后，加入3,3′ -二氨基聯苯胺處理后使用蘇木精染色，最后在顯微鏡下觀察結果。以PBS代替一抗為陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照。含棕色顆粒的細胞為陽性細胞，以陽性細胞占總細胞的比例來量化和評估不同組中的蛋白表達情況。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行統計學分析。數據經過檢驗符合正態分布者以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖情況
不同濃度海參多糖處理后12 h、24 h、36 h時細胞增殖抑制率結果見圖1。在相同時間點，不同濃度間總體比較差異均有統計學意義（12 h：F=13.409、P=0.002；24 h：F=13.954、P=0.002；36 h：F=16.192、P=0.001），在觀察濃度范圍內，隨著海參多糖濃度增加而增殖抑制率增高（P<0.05）。在相同濃度，3個時間點的細胞增殖抑制率總體比較差異也均有統計學意義（50 μg/mL：F=13.538、P=0.002；100 μg/mL：F=14.106、P=0.002；200 μg/mL：F=19.481、P=0.001），在觀察時間范圍內，隨著時間的延長而增殖抑制率增高（P<0.05）。
圖1
示經不同濃度海參多糖處理后細胞的增殖情況
與相同時間點內50 μg/mL濃度比較，*
2.2 細胞凋亡率結果
流式細胞技術分析結果見圖2a~2d，可見在0 μg/mL海參多糖濃度時并未出現大量的細胞凋亡，其他濃度海參多糖處理后出現不同程度的細胞凋亡。定量分析結果（圖2e）顯示，不同濃度海參多糖處理后的細胞凋亡率總體比較差異有統計學意義（F=117.110，P<0.001），在觀察濃度范圍內，隨著海參多糖濃度的增加而細胞凋亡率增高（P<0.05）。
圖2
示經不同濃度海參多糖處理后細胞的凋亡情況及細胞中JAK2、STAT3、survivin表達情況
a~d：分別為流式細胞技術檢測0、50、100、200 μg/mL濃度處理后的細胞凋亡結果；e：細胞凋亡率；f：mRNA半定量表達結果；g：蛋白表達定性結果（1~4分別表示0、50、100、200 μg/mL濃度）；h：蛋白表達半定量結果。與0 μg/mL濃度比較，*
2.3 細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA和蛋白水平情況
① qRT-PCR法檢測不同濃度海參多糖處理后細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達半定量結果見圖2f，均未發現3個指標在不同濃度間總體比較差異有統計學意義（P>0.05）。② Western blot法檢測不同濃度海參多糖處理后細胞中JAK2、STAT3、survivin及其磷酸化蛋白表達的定性結果見圖2g，半定量結果見圖2h，不同濃度海參多糖處理后細胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和p-survivin/survivin蛋白水平比值總體比較差異有統計學意義（P<0.05），在觀察濃度范圍內均隨著海參多糖濃度的增加而各蛋白表達降低（P<0.05）。
2.4 海參多糖處理后對裸鼠體內腫瘤的影響
不同濃度（0、50、100及200 μg/mL）海參多糖處理后的肝癌HepG2細胞種植于裸鼠后腫瘤的生長情況見圖3a，隨著海參多糖濃度的增高而裸鼠腫瘤組織的質量（圖3b）和體積（圖3c）均減輕或減小（P<0.05）。同時免疫組織化學染色結果顯示，處理組（50、100、200 μg/mL）中p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表達陽性率均低于對照組（P<0.05）且隨著海參多糖濃度的增高而降低，見圖3d、3e。
圖3
示不同濃度海參多糖處理后對裸鼠體內腫瘤的影響
a：腫瘤大體觀；b：腫瘤組織質量；c：腫瘤組織體積；d：蛋白表達陽性率；e：蛋白表達的定性結果（免疫組織化學方法 × 200）。與0 μg/mL濃度比較，*
3 討論
肝癌的發生及發展是由機體多方面因素共同導致的結果，如癌基因激活或抑癌基因失活、肝細胞結構發生異常、肝癌信號因子被激活同時凋亡途徑被抑制、肝細胞異常增殖、血管內皮生長因子被激發[9]等，但其確切機制仍未明確。由于肝癌發生的隱匿性，多數患者確診時即為中晚期，大部分肝癌患者失去了手術治療的機會[10]，又因其具有高復發率和高轉移率[11]，因此，化學藥物治療是其常采用的方法之一，但其具有較強的副作用，在殺死腫瘤細胞的同時損傷正常細胞，進而使機體產生耐藥性[12]。有臨床實踐[13]表明，在西醫治療方案的同時配合中醫治療能明顯地提高化學藥物治療的效用。
海參具有提高人體免疫力、抗癌等作用[14]，尤其是海參提取物在抗癌過程中具有重要作用，可參與調控癌細胞生長、增殖等多個生物學過程[15]，如在海參中提取的三萜糖苷類物質不僅可以顯著降低HepG2細胞活力，還可誘導細胞凋亡[16]。有研究[6]報道，海參多糖可能通過抑制核因子-κB信號通路中基質金屬蛋白酶-9和血管內皮生長因子的表達進而抑制人腎癌細胞的生長、遷移和侵襲過程。目前關于海參多糖在肝癌細胞中作用的研究較少。本研究在前人研究[6-7]的基礎上選擇海參多糖的處理濃度和觀測時間，經分析發現，海參多糖可以有效抑制肝癌HepG2細胞的增殖且在觀察濃度和時間范圍內隨著時間延長和濃度的增加其增殖抑制率也隨之升高（P<0.05）；且在動物模型體內，海參多糖可有效抑制腫瘤組織生長且隨著濃度增加其抑制效果也隨之更明顯；對培養36 h后的細胞經不同濃度海參多糖處理后可見其凋亡率隨著濃度增加而升高（P<0.05）。以上研究結果提示，海參多糖對肝癌細胞增殖有抑制作用，能促進細胞凋亡且呈現濃度劑量依賴性趨勢。
已有研究[17]證明，JAK2/STAT3通路是機體惡性腫瘤細胞增殖、凋亡的經典調控傳導通路；魏薇等[18]報道，鉤吻總堿可通過抑制人舌癌細胞株JAK2、STAT3和survivin蛋白的磷酸化，進而影響JAK2/STAT3/survivin信號通路發揮作用，達到抑制細胞增殖及促進細胞凋亡的目的。本研究中發現，不同濃度海參多糖處理HepG2細胞36 h時，HepG2細胞中JAK2、STAT3和survivin mRNA表達量無明顯變化，但p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-survivin/survivin比值在不同濃度間總體比較差異有統計學意義且隨海參多糖濃度增加而降低，在動物體內，海參多糖可顯著下調p-JAK2、p-STAT3及p-survivin蛋白表達陽性率且隨著海參多糖濃度增加隨之降低。以上結果說明，海參多糖可能是通過誘導JAK2/STAT3/survivin途徑相關蛋白磷酸化參與HepG2細胞增殖、凋亡過程，且海參多糖可在一定程度上抑制JAK2、STAT3和survivin的磷酸化表達，進而達到抑制HepG2細胞增殖、促進凋亡的目的。
綜上，海參多糖可抑制人HepG2細胞增殖，促進HepG2細胞凋亡，且隨著濃度增加其效用也隨之增加，并推斷此過程可能是通過調控JAK2/STAT3/survivin通路、抑制JAK2、STAT3和survivin蛋白磷酸化而發揮作用。此研究還需要進一步研究，因本研究尚存在一定不足，首先，本研究并未選擇其他觀測時間點和海參多糖濃度，若再觀察幾個時間點或濃度，結果是否會出現不同變化趨勢還未可知；其次，本研究僅是初步觀察了海參多糖在動物模型體內對腫瘤組織生長的影響，未深入探究體內海參多糖的具體作用機制；此外，本研究并未對海參多糖的藥效學進行深入探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益，不存在研究者與公開研究成果有關的利益沖突。
作者貢獻聲明：盧戰輝負責提出研究選題、設計研究方案、獲取研究經費、技術或材料支持和指導性支持；白陽秋和孫趁意負責實施研究過程、資料采集整理、分析數據、整理文獻和設計文章框架；孫趁意和張曉菲負責起草文章、修訂文章、終審文章。
倫理聲明：本研究動物實驗符合動物倫理要求。
