引用本文： 姜敏, 趙玉軍. 異常上調的CNIH4和TOMM40L基因可能與肝細胞癌預后相關. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(7): 904-909. doi: 10.7507/1007-9424.202109022 復制
肝癌是消化道常見惡性腫瘤，每年有數以萬計的肝癌新發病例，其中2020年全球新發肝癌病例905 677例，占新發36種腫瘤病例的4.7%，排第6位；中國新發肝癌病例410 038例，占全球肝癌新發病例的45.27%[1]。2020年肝癌全球死亡病例830 180例，占腫瘤死亡的8.3%，排第3位；中國死亡病例391 152例，占全球肝癌死亡病例的比例高達47.12%[1-2]。我國是世界上乙型肝炎負擔最重的國家[3]，80%以上肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者合并有乙型肝炎病毒感染，多數患者就診時即有肝硬化、肝內轉移、肝功能儲備不足等情況。為避免單科治療的局限性，目前HCC診療多采用多學科協作方式，對于能切除的HCC，手術是患者獲得長期生存最主要及最有效的方式，手術方式為肝部分切除或肝移植[4]。對于無法手術患者，若腫瘤直徑≤5 cm，射頻或微波消融可作為這些患者的治療方式[5]。但仍有一部分患者既不能耐受手術又不適宜消融，考慮HCC為富血供腫瘤，常通過動脈系統栓塞、化療等治療腫瘤[6]。在晚期HCC患者中，分子靶向治療可以延長生存期[7]。一項研究[8]表明，接受索拉非尼治療的患者較接受安慰劑治療的患者生存期延長近3個月。但也有接受索拉非尼一線治療失敗后采用雷莫蘆單抗二線療法，雷莫蘆單抗組與安慰劑組相比生存期有顯著延長[9]。即便如此，HCC的5年生存期仍有待提高，其發生發展機制仍未闡明，仍待進一步探索。
很多腫瘤的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）已被證實對于腫瘤的功能非常重要[10]，過表達或沉默可導致腫瘤生長能力的改變。數據庫的使用方便我們對DEGs進行篩選。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是一個具有里程碑意義的癌癥基因組學計劃，其對33種癌癥類型、超過20 000多例原發性癌組織及其匹配正常樣本進行了分子表征。美國國家生物技術信息中心的基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫是一個國際公共存儲庫，這些數據庫為深入研究腫瘤基因以及尋找腫瘤生物標志物和預后指標提供了數據。本研究從GEO數據庫中選擇了5個HCC數據集，鑒定了DEGs，并對其功能進行了生物信息學分析。
1 材料與方法
1.1 篩選DEGs
在GEO數據庫（
1.2 繪制韋恩圖
采用在線生物信息學和進化基因組學工具（
1.3 基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析
采用在線數據路元景觀基因注釋和分析資源（
1.4 繪制互作蛋白網絡
利用Cytospace3.8.3[11]及String（
1.5 TCGA分析HCC中CNIH4、TOMM40L的mRNA表達水平及其對預后的影響
利用GEPIA2（
1.6 CNIH4和TOMM40L mRNA 在 HCC 組織中的表達
收集2020年3月至2021年6月期間筆者所在醫院的8例新鮮HCC臨床樣本，樣本均取得廣東省第二人民醫院醫學倫理委員會批準及患者本人知情同意。樣本組織在離體30 min內采集且凍存于液氮中，避免反復凍融導致RNA降解。組織樣品使用福際RNA提取試劑盒提取總RNA，經瓊脂糖膠跑膠驗證RNA無降解后，取1 μg RNA用TAKARA反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，用Thermo試劑盒檢測CNIH4、TOMM40L mRNA表達水平。所有操作均按試劑盒說明書進行。CNIH4：Fw，TCAACTTACCTGTTGCCACTTG；Re，TCTGTTGGATCAAACACTCCCA。TOMM40L：FW，TGGCGAGTATCGGGGAGATG；Re，CTCCCTTAGTCCACAGCCAC。GAPDH：Fw，CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT；Re，AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC。其中Fw為正向引物，Re為反向引物，前述引物方向均為5′ 到3′。
2 結果
2.1 DEGs篩選結果
GEO數據庫選擇GSE121248、GSE36376、GSE46408、GSE74656、GSE84005共5個數據集，共包括HCC 359例，正常肝組織279例。其中GSE121248包含HCC 70例，正常肝組織37例；GSE36376包含HCC 240例，正常肝組織193例；GSE46408包含HCC 6例及其配對正常肝組織6例；GSE74656包含HCC 5例及其配對正常肝組織5例；GSE84005包含HCC 38例及配對正常肝組織38例，分析結果及圖見圖1a～1e。5個數據集的火山圖顯示，CNIH4和TOMM40L基因在HCC組織中表達上調。
圖1
示各個數據集的DEGs火山圖和各個數據集共同DEGs韋恩圖
a：GSE121248；b：GSE36376；c：GSE74656；d：GSE46408；e：GSE84005；f：上調基因的韋恩圖；g：下調基因的韋恩圖
2.2 共同上調及下調DEGs
5個數據集的共上調及共下調DEGs情況見圖1f、1g及表1，其中共上調基因25個，共下調基因21個。本研究對上調基因進一步篩選發現，CNIH4、TOMM40L較少報道，故本研究選擇該2個基因進行進一步研究。
表1
示5個數據集的共上調及共下調DEGs
2.3 GO及KEGG分析結果
GO及KEGG分析示DEGs主要與分解代謝、細胞分裂、DNA復制、修復等有關（圖2a和2b）。
圖2
示DEGs的GO分析及KEGG分析、CNIH4與TOMM40L 基因的互作蛋白網絡
a：GO分析；b：KEGG分析；c：CNIH4基因的互作蛋白網絡；d：TOMM40L基因的互作蛋白網絡
2.4 互作蛋白網絡
CNIH4、TOMM40L基因的主要互作蛋白見圖2c、2d和表2，該2個基因主要與線粒體蛋白復合體、高爾基體囊泡的外殼蛋白包膜、囊體運輸中的囊泡受體家族相互作用、膽固醇代謝等相關。
表2
CNIH4、TOMM40L基因的互作蛋白
2.5 TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達差異
采用GEPIA2分析TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達情況，結果HCC組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達水平均較正常組織上調（P<0.01）。生存分析結果顯示，CNIH4及TOMM40L mRNA高表達組的生存情況較低表達組差（P<0.05），見圖3a～3d。
圖3
TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達差異及不同表達狀態患者的生存情況比較，以及HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA表達的臨床驗證
a、b：TCGA數據庫中 HCC 組織和正常組織的CNIH4 mRNA（a）及TOMM40L mRNA（b）表達情況，其中HCC組 369 例，正常組織組 50 例，*
2.6 臨床驗證
HCC組織和癌旁組織中CNIH4及TOMM40L mRNA表達經臨床標本驗證，RT-PCR結果顯示該2種基因均在HCC組織中較其在癌旁組織中表達增強（圖3e）。
3 討論
肝癌位于2020年新發腫瘤第6位，腫瘤相關死亡第3位，嚴重影響人類的健康[1-2]。肝癌的分子機制復雜、起病隱匿、癥狀輕，多數患者就診時已出現腹痛、腹水、黃疸等癥狀，確診時已屬中晚期，治療效果往往欠佳，即使目前昂貴的分子靶向藥物治療對延長HCC患者生存期及提高生活質量的效果也有限。因而迫切需要開發能早期預測HCC、用于隨訪甚至能治療HCC的生物標志物。越來越多學者通過生物信息學分析單細胞測序、DNA甲基化等數據以尋找關鍵基因[13-15]，部分基因已通過實驗得到證實，能影響HCC患者的總生存期及復發轉移[16-17]。
Cornichon家族由CNIH1到CNIH4組成，其保留了所有 CNIH 同源物的基本拓撲結構，但 CNIH2 和 CNIH3 在細胞外環中包含額外的獨特序列，這些序列在 CNIH1 和 CNIH4 中不存在[18]。CNIH是調節 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isoxazole receptor，AMPAR）離子通道功能和蛋白質運輸的輔助亞基，從CNIH1 到 CNIH4，都與人腦中的谷氨酸離子型受體AMPA型亞基2 共純化，這個結果為 CNIH1 和 CNIH4 參與人腦 AMPAR 功能提供了證據[19]。CNIH4的過表達和敲低表達均導致G蛋白偶聯受體的細胞內滯留，表明這種內質網駐留蛋白在G蛋白偶聯受體輸出中起重要作用。CNIH4作為一個貨物分類受體，招募G蛋白偶聯受體進入外殼蛋白囊泡[20]。CNIH4對結腸癌的無病生存具有預測價值，跨膜 p24 轉運蛋白 9通過與CNIH4、轉化因子α和GL家族鋅指1一起建立正反饋回路，從而促進結腸癌轉移[21]。
TOMM40L屬于TOM40家族成員，TOMM40L可能和潛在的通道形成蛋白與蛋白質前體進入線粒體有關。與正常上皮卵巢細胞相比，TOM40在卵巢癌中過度表達，高表達TOM40的卵巢癌患者的預后比表達低水平TOM40的卵巢癌患者更差[22]。TOM40 調節線粒體活性，提高細胞內三磷酸腺苷水平和氧化還原狀態，促進卵巢癌的生長[22]。TOMM40L單倍型增加輕度認知障礙轉化為阿爾茨海默病的風險[23]。孤兒核受體TR3通過 TOM40 和 TOM70 通道蛋白進入線粒體內膜，通過滲透性轉換孔復合物腺嘌呤核苷酸轉位酶1-電壓依賴性陰離子通道 1（ANT1-VDAC1）耗散線粒體膜電位和誘導自噬。這個過程導致過度的線粒體清除和不可逆的細胞死亡，它暗示了一種通過激活線粒體信號通路來治療黑色素瘤的新方法[24]。胰腺癌化療藥物吉西他濱耐藥細胞株測序結果表明，TOMM40L的表達上調具有時間依賴性，其可能為以后診斷和治療的候選標志物[25]。
本研究利用在線公共數據庫進行分析，結果提示CNIH4與TOMM40L在HCC組織中表達上調，且高表達患者的預后更差；新鮮HCC組織及其癌旁組織經半定量PCR檢測，結果與公共數據庫結果一致，CNIH4與TOMM40L可能為HCC的診斷和治療提供有效的診斷及分子靶向治療標志物。但本研究是基于公共數據庫的生物信息學分析，后續還需要分子生物學方法和細胞實驗數據來進一步驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：姜敏參與了該課題設計及在線數據庫分析，趙玉軍參與了課題設計、臨床樣本收集及分析。
倫理聲明：本研究已通過廣東省第二人民醫院的倫理審核批準（批文編號：20200113-16-02）。
肝癌是消化道常見惡性腫瘤，每年有數以萬計的肝癌新發病例，其中2020年全球新發肝癌病例905 677例，占新發36種腫瘤病例的4.7%，排第6位；中國新發肝癌病例410 038例，占全球肝癌新發病例的45.27%[1]。2020年肝癌全球死亡病例830 180例，占腫瘤死亡的8.3%，排第3位；中國死亡病例391 152例，占全球肝癌死亡病例的比例高達47.12%[1-2]。我國是世界上乙型肝炎負擔最重的國家[3]，80%以上肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者合并有乙型肝炎病毒感染，多數患者就診時即有肝硬化、肝內轉移、肝功能儲備不足等情況。為避免單科治療的局限性，目前HCC診療多采用多學科協作方式，對于能切除的HCC，手術是患者獲得長期生存最主要及最有效的方式，手術方式為肝部分切除或肝移植[4]。對于無法手術患者，若腫瘤直徑≤5 cm，射頻或微波消融可作為這些患者的治療方式[5]。但仍有一部分患者既不能耐受手術又不適宜消融，考慮HCC為富血供腫瘤，常通過動脈系統栓塞、化療等治療腫瘤[6]。在晚期HCC患者中，分子靶向治療可以延長生存期[7]。一項研究[8]表明，接受索拉非尼治療的患者較接受安慰劑治療的患者生存期延長近3個月。但也有接受索拉非尼一線治療失敗后采用雷莫蘆單抗二線療法，雷莫蘆單抗組與安慰劑組相比生存期有顯著延長[9]。即便如此，HCC的5年生存期仍有待提高，其發生發展機制仍未闡明，仍待進一步探索。
很多腫瘤的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）已被證實對于腫瘤的功能非常重要[10]，過表達或沉默可導致腫瘤生長能力的改變。數據庫的使用方便我們對DEGs進行篩選。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是一個具有里程碑意義的癌癥基因組學計劃，其對33種癌癥類型、超過20 000多例原發性癌組織及其匹配正常樣本進行了分子表征。美國國家生物技術信息中心的基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫是一個國際公共存儲庫，這些數據庫為深入研究腫瘤基因以及尋找腫瘤生物標志物和預后指標提供了數據。本研究從GEO數據庫中選擇了5個HCC數據集，鑒定了DEGs，并對其功能進行了生物信息學分析。
1 材料與方法
1.1 篩選DEGs
在GEO數據庫（
1.2 繪制韋恩圖
采用在線生物信息學和進化基因組學工具（
1.3 基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析
采用在線數據路元景觀基因注釋和分析資源（
1.4 繪制互作蛋白網絡
利用Cytospace3.8.3[11]及String（
1.5 TCGA分析HCC中CNIH4、TOMM40L的mRNA表達水平及其對預后的影響
利用GEPIA2（
1.6 CNIH4和TOMM40L mRNA 在 HCC 組織中的表達
收集2020年3月至2021年6月期間筆者所在醫院的8例新鮮HCC臨床樣本，樣本均取得廣東省第二人民醫院醫學倫理委員會批準及患者本人知情同意。樣本組織在離體30 min內采集且凍存于液氮中，避免反復凍融導致RNA降解。組織樣品使用福際RNA提取試劑盒提取總RNA，經瓊脂糖膠跑膠驗證RNA無降解后，取1 μg RNA用TAKARA反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，用Thermo試劑盒檢測CNIH4、TOMM40L mRNA表達水平。所有操作均按試劑盒說明書進行。CNIH4：Fw，TCAACTTACCTGTTGCCACTTG；Re，TCTGTTGGATCAAACACTCCCA。TOMM40L：FW，TGGCGAGTATCGGGGAGATG；Re，CTCCCTTAGTCCACAGCCAC。GAPDH：Fw，CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT；Re，AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC。其中Fw為正向引物，Re為反向引物，前述引物方向均為5′ 到3′。
2 結果
2.1 DEGs篩選結果
GEO數據庫選擇GSE121248、GSE36376、GSE46408、GSE74656、GSE84005共5個數據集，共包括HCC 359例，正常肝組織279例。其中GSE121248包含HCC 70例，正常肝組織37例；GSE36376包含HCC 240例，正常肝組織193例；GSE46408包含HCC 6例及其配對正常肝組織6例；GSE74656包含HCC 5例及其配對正常肝組織5例；GSE84005包含HCC 38例及配對正常肝組織38例，分析結果及圖見圖1a～1e。5個數據集的火山圖顯示，CNIH4和TOMM40L基因在HCC組織中表達上調。
圖1
示各個數據集的DEGs火山圖和各個數據集共同DEGs韋恩圖
a：GSE121248；b：GSE36376；c：GSE74656；d：GSE46408；e：GSE84005；f：上調基因的韋恩圖；g：下調基因的韋恩圖
2.2 共同上調及下調DEGs
5個數據集的共上調及共下調DEGs情況見圖1f、1g及表1，其中共上調基因25個，共下調基因21個。本研究對上調基因進一步篩選發現，CNIH4、TOMM40L較少報道，故本研究選擇該2個基因進行進一步研究。
表1
示5個數據集的共上調及共下調DEGs
2.3 GO及KEGG分析結果
GO及KEGG分析示DEGs主要與分解代謝、細胞分裂、DNA復制、修復等有關（圖2a和2b）。
圖2
示DEGs的GO分析及KEGG分析、CNIH4與TOMM40L 基因的互作蛋白網絡
a：GO分析；b：KEGG分析；c：CNIH4基因的互作蛋白網絡；d：TOMM40L基因的互作蛋白網絡
2.4 互作蛋白網絡
CNIH4、TOMM40L基因的主要互作蛋白見圖2c、2d和表2，該2個基因主要與線粒體蛋白復合體、高爾基體囊泡的外殼蛋白包膜、囊體運輸中的囊泡受體家族相互作用、膽固醇代謝等相關。
表2
CNIH4、TOMM40L基因的互作蛋白
2.5 TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達差異
采用GEPIA2分析TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達情況，結果HCC組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達水平均較正常組織上調（P<0.01）。生存分析結果顯示，CNIH4及TOMM40L mRNA高表達組的生存情況較低表達組差（P<0.05），見圖3a～3d。
圖3
TCGA數據庫中HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA的表達差異及不同表達狀態患者的生存情況比較，以及HCC組織和正常組織中CNIH4及TOMM40L mRNA表達的臨床驗證
a、b：TCGA數據庫中 HCC 組織和正常組織的CNIH4 mRNA（a）及TOMM40L mRNA（b）表達情況，其中HCC組 369 例，正常組織組 50 例，*
2.6 臨床驗證
HCC組織和癌旁組織中CNIH4及TOMM40L mRNA表達經臨床標本驗證，RT-PCR結果顯示該2種基因均在HCC組織中較其在癌旁組織中表達增強（圖3e）。
3 討論
肝癌位于2020年新發腫瘤第6位，腫瘤相關死亡第3位，嚴重影響人類的健康[1-2]。肝癌的分子機制復雜、起病隱匿、癥狀輕，多數患者就診時已出現腹痛、腹水、黃疸等癥狀，確診時已屬中晚期，治療效果往往欠佳，即使目前昂貴的分子靶向藥物治療對延長HCC患者生存期及提高生活質量的效果也有限。因而迫切需要開發能早期預測HCC、用于隨訪甚至能治療HCC的生物標志物。越來越多學者通過生物信息學分析單細胞測序、DNA甲基化等數據以尋找關鍵基因[13-15]，部分基因已通過實驗得到證實，能影響HCC患者的總生存期及復發轉移[16-17]。
Cornichon家族由CNIH1到CNIH4組成，其保留了所有 CNIH 同源物的基本拓撲結構，但 CNIH2 和 CNIH3 在細胞外環中包含額外的獨特序列，這些序列在 CNIH1 和 CNIH4 中不存在[18]。CNIH是調節 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isoxazole receptor，AMPAR）離子通道功能和蛋白質運輸的輔助亞基，從CNIH1 到 CNIH4，都與人腦中的谷氨酸離子型受體AMPA型亞基2 共純化，這個結果為 CNIH1 和 CNIH4 參與人腦 AMPAR 功能提供了證據[19]。CNIH4的過表達和敲低表達均導致G蛋白偶聯受體的細胞內滯留，表明這種內質網駐留蛋白在G蛋白偶聯受體輸出中起重要作用。CNIH4作為一個貨物分類受體，招募G蛋白偶聯受體進入外殼蛋白囊泡[20]。CNIH4對結腸癌的無病生存具有預測價值，跨膜 p24 轉運蛋白 9通過與CNIH4、轉化因子α和GL家族鋅指1一起建立正反饋回路，從而促進結腸癌轉移[21]。
TOMM40L屬于TOM40家族成員，TOMM40L可能和潛在的通道形成蛋白與蛋白質前體進入線粒體有關。與正常上皮卵巢細胞相比，TOM40在卵巢癌中過度表達，高表達TOM40的卵巢癌患者的預后比表達低水平TOM40的卵巢癌患者更差[22]。TOM40 調節線粒體活性，提高細胞內三磷酸腺苷水平和氧化還原狀態，促進卵巢癌的生長[22]。TOMM40L單倍型增加輕度認知障礙轉化為阿爾茨海默病的風險[23]。孤兒核受體TR3通過 TOM40 和 TOM70 通道蛋白進入線粒體內膜，通過滲透性轉換孔復合物腺嘌呤核苷酸轉位酶1-電壓依賴性陰離子通道 1（ANT1-VDAC1）耗散線粒體膜電位和誘導自噬。這個過程導致過度的線粒體清除和不可逆的細胞死亡，它暗示了一種通過激活線粒體信號通路來治療黑色素瘤的新方法[24]。胰腺癌化療藥物吉西他濱耐藥細胞株測序結果表明，TOMM40L的表達上調具有時間依賴性，其可能為以后診斷和治療的候選標志物[25]。
本研究利用在線公共數據庫進行分析，結果提示CNIH4與TOMM40L在HCC組織中表達上調，且高表達患者的預后更差；新鮮HCC組織及其癌旁組織經半定量PCR檢測，結果與公共數據庫結果一致，CNIH4與TOMM40L可能為HCC的診斷和治療提供有效的診斷及分子靶向治療標志物。但本研究是基于公共數據庫的生物信息學分析，后續還需要分子生物學方法和細胞實驗數據來進一步驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：姜敏參與了該課題設計及在線數據庫分析，趙玉軍參與了課題設計、臨床樣本收集及分析。
倫理聲明：本研究已通過廣東省第二人民醫院的倫理審核批準（批文編號：20200113-16-02）。
