引用本文： 馮國英, 陳凱, 楊旭, 陶杰, 史政榮. 肝細胞癌患者免疫功能和炎癥因子水平與體外高通量藥物敏感度的相關性研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(6): 748-755. doi: 10.7507/1007-9424.202109009 復制
肝細胞癌（以下簡稱“肝癌” ）是世界第6大常見癌及第4大惡性腫瘤死亡病因[1]。由于肝癌早期起病隱匿、癥狀不典型，超過一半的患者確診時已處于疾病中晚期，腫瘤多發、瘤體過大或伴轉移使其喪失了手術治療機會[2]。局部治療和全身治療目前廣泛應用于中晚期肝癌[3]，其單獨或聯合使用如經肝動脈化學治療（簡稱化療）栓塞聯合索拉非尼[4]或其聯合阿帕替尼[5]、肝動脈灌注化療聯合索拉非尼[6]等在臨床上取得了一些成效，但中晚期肝癌患者從中獲得的收益仍不樂觀。肝癌細胞的天然耐藥性、多種耐藥相關蛋白高表達及肝癌極高的異質性共同促進了肝癌細胞耐藥[7-9]，導致肝癌對多種全身治療藥物的反應不佳。肝癌作為一種免疫原性腫瘤，與病毒感染及感染所致的炎癥環境密切相關，慢性炎癥因子相關的免疫抑制和多種免疫細胞共存并在一系列復雜通路中的相互作用是導致腫瘤產生的重要原因[10-11]。
高通量藥物敏感度篩選是以臨床患者肝癌病理標本為基礎，對此進行原代癌細胞培養，從體外藥物敏感度試驗的結果中篩選對患者治療可能有益的用藥方案。已有研究[12]證明，將高通量藥物敏感度篩選用于協助選擇肝癌患者術后輔助化療藥物相對于經驗性使用化療藥物更具安全性與可靠性，但將這種治療模式廣泛應用于臨床仍有距離。本研究通過高通量藥物敏感度篩選將數種細胞毒性藥物、靶向藥物及聯合用藥方案的抑制率與對應的肝癌患者外周血淋巴細胞和炎癥因子水平相結合并進行分析，以尋找二者可能存在的相關性，以期為當前臨床治療的藥物選擇提供參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究回顧性納入2019年12月至2021年6月期間于重慶醫科大學附屬第一醫院肝臟中心接受手術治療的肝癌患者。納入標準：① 年齡18～75歲；② 術后病理學檢查診斷為肝癌；③ 肝癌標本成功完成原代培養和藥物敏感度檢測；④ 患者治療期間接受了機體免疫功能和炎癥因子兩項檢測中的至少一項。排除標準：① 年齡<18歲或>75歲的患者；② 非肝癌或肝癌合并其他惡性腫瘤、免疫相關疾病等；③ 伴腫瘤破裂或各類原發或繼發感染的患者；④ 無法獲得足夠樣本進行原代腫瘤細胞培養；⑤ 肝癌組織由于取樣、運輸、培養過程等因素造成標本污染而無法獲得原代肝癌細胞；⑥ 培養失敗等原因無法獲取藥物敏感度檢測結果；⑦ 拒絕研究的患者。
1.2 倫理與知情同意
本研究符合1975年修訂的《赫爾辛基宣言》的倫理準則，已經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準并在中國臨床試驗中心（
1.3 高通量藥物敏感度試驗流程
1.3.1 標本的處理
術中獲取的肝癌標本置于運輸液（美天旎，貨號130-100-008）中，于4 ℃冷藏條件下運送，送樣時間不超過48 h，整個處理及運輸過程保證樣本處于無菌狀態。使用消化酶消化法，搖床上37 ℃、300 r/min孵育消化得到腫瘤原代細胞。為最大程度保持與臨床患者體內腫瘤一致性，只對腫瘤原代細胞進行1次體外擴增。消化完成后，組織懸液過100 μm濾網用5 mL清洗液沖洗濾網（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）后棄上清液，紅細胞裂解液重懸細胞，輕柔混勻，4 ℃裂解（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min），裂解期間拿出顛倒混勻1次，裂解紅細胞結束。棄上清液，加入5 mL清洗液重懸細胞（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min），輕柔混勻。棄上清液，加入1 mL肝癌細胞專用完全培養基（合肥中科普瑞昇生物醫藥科技有限公司，貨號#00-G0007-CM）重懸細胞，輕柔混勻。取10 μL細胞于血細胞計數板上，鏡下觀察，通過臺盼藍染色計數并計算原代細胞活性。以1×105個/mL的密度將計數后的原代細胞加入細胞樣品箱中，制作384孔細胞培養板，進行短時間（6～12 h）培養。
1.3.2 高通量藥物敏感度試驗
將原代肝癌細胞分為試驗組與對照組分別接種到藥物篩選板上，試驗組使用受試藥物，所有藥物均使用二甲基亞砜溶解稀釋；對照組僅予以二甲基亞砜處理。采用自動工作平臺JANUS@automated workstation（Pekin Elmer Inc，Wellesley，MA，USA）進行加藥，每孔0.1 μL。給藥后置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育72 h，再加入10 μL CellTiter-Glo細胞增殖熒光檢測試劑，靜置10 min后使用Envision Plate Reader（Perkin Elmer Inc，Wellesley，MA，USA）計數。細胞增殖抑制率計算方法：抑制率（%）=（1–試驗組腫瘤細胞存活數目/對照組腫瘤細胞存活數目）×100%。
1.4 受試藥物和藥物敏感度分析
本研究中所涉及的藥物包含NCCN指南推薦的肝癌治療藥物（表1），藥物劑量符合臨床使用標準，同時加用抗腫瘤的其他藥物作為備用，以期發現針對該測試患者精準有效的藥物。本研究中以100%血漿峰值濃度（依據患者對試驗藥物理論上可接受的最大血藥濃度，通過公式換算成體外細胞作用的濃度）作為篩選濃度，以評價藥物對癌細胞的細胞毒作用，代表臨床劑量下藥物的效果。抑制率越高，代表此患者的肝癌細胞對該藥的敏感度越高。將抑制率≥80%定義為高度敏感，50%≤抑制率<80%為中度敏感，25%≤抑制率<50%為低度敏感，抑制率<25%為不敏感[12]。將抑制率≥50%劃分為相對敏感組，<50%劃分為相對不敏感組。
表1
研究藥物的組成及劑量
1.5 肝癌患者外周血中相關指標檢測
所有肝癌患者的外周血標本均交由重慶醫科大學臨床分子檢測中心進行免疫功能及炎癥因子水平測定。免疫功能指標包括總淋巴細胞、總T淋巴細胞（CD3+）、輔助/誘導T淋巴細胞（CD4+）、抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞；炎癥因子指標包括白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-5、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-α、IFN-γ。
1.6 統計學方法
使用SPSS 24.0軟件（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）進行統計分析。計量資料采用偏度-峰度檢驗法進行正態分布檢驗，符合正態分布者用均數±標準差（
±s）表示，不符合正態分布者用中位數（median，M）和上下四分位數（P25，P75）表示。機體免疫功能和炎癥因子水平與藥物抑制率的相關性分析使用Spearman法。使用單因素logistic回歸模型評估相關性分析結果中P<0.05的免疫或炎癥指標與肝癌細胞對相應藥物體外藥物敏感度的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
本研究共納入74例肝癌患者行體外高通量藥物敏感度試驗。其中59例接受了機體免疫功能檢測，36例接受了炎癥因子檢測，至少完成1項檢測的病例共60例，其中男54例、女6例，年齡（57±11）歲，合并乙肝46例（76.7%）、合并肝硬化25例（41.7%），單發病灶53例、多發病灶7例，腫瘤最大直徑（53.32±32.15）mm。
2.2 體外高通量藥物敏感度和實驗室檢測結果
納入研究的74例肝癌患者中，27種單藥或聯合用藥的抑制率及肝癌細胞對藥物的體外敏感度結果見表2。體外抑制率方面，只有1種（硼替佐米）的體外抑制率>80%，即高度敏感；有4種（羅米地辛、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU、L-OHP+CPT-11+EPI、L-OHP+EPI）用藥方案的體外抑制率>50%，即中度敏感；余下22種用藥方案的體外抑制率均不理想，其中9種用藥方案體外抑制率的P75值均<25%。敏感度方面，共5種（硼替佐米、羅米地辛、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU、L-OHP+CPT-11+EPI、L-OHP+EPI）用藥方案的敏感度≥50%，瑞戈非尼和DDP用藥患者無敏感病例。
表2
74例肝癌患者體外高通量藥物敏感度篩選結果
2.3 免疫功能及炎癥因子水平結果
59例患者的機體免疫功能檢測結果（單位：個/μL）：總淋巴細胞數為1 525.56±572.56，CD3+ 細胞數為1 082.64±448.45，CD4+ 細胞數為685.05±298.31，CD8+ 細胞數為307.00（212.00，440.00），CD19+ 細胞數為185.00（109.00，284.00），NK細胞數為194.00（114.00，294.00）。
36例患者的炎癥因子檢測結果（單位：ng/L）：IL-1β水平為1.94（0.86，9.58），IL-5水平為1.30（0.77，7.68），IL-6水平為3.29（0.97，19.24），IL-8水平為2.92（0.98，10.86），TNF-α水平為1.57（0.56，3.61），IFN-α水平為0.30（0.83，2.77），IFN-γ水平為0.83（0.45，11.93）。
2.4 免疫功能及炎癥因子水平與體外高通量藥物敏感度結果的相關性檢驗結果
2.4.1 免疫功能與體外高通量藥物敏感度結果
結果見表3。從表3可見，僅發現NK細胞數與CPT-11和羥基喜樹堿對肝癌細胞體外抑制率有關（P<0.05）；未發現其他免疫功能指標與其他靶向藥物或細胞毒性藥物或聯合方案對肝癌細胞體外抑制率有關（P>0.05）。由于CPT-11和羥基喜樹堿這2種藥物的敏感度和平均抑制率均較低（分別為6.8%和17.84%與6.8%和18.54%），故未進行單因素logistic回歸進一步分析其影響。
表3
機體免疫功能指標與各用藥方案對肝癌細胞體外抑制率的相關性分析結果
2.4.2 炎癥因子水平與體外高通量藥物敏感度結果的相關性
結果見表4。從表4可見，IL-1β與L-OHP對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；IL-6與硼替佐米、索拉非尼、卡非佐米、吉西他濱、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU方案、L-OHP+CPT-11+EPI方案、L-OHP+EPI方案對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；TNF-α與卡博替尼、阿帕替尼、卡非佐米、ADM和EPI對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；IFN-γ與PIAF方案對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；未發現其他炎癥因子與其他靶向藥物或細胞毒性藥物或聯合方案對肝癌細胞的抑制率有關（P>0.05）。進一步分析其影響時（由于硼替佐米、阿帕替尼和卡博替尼3種藥物中相對敏感與相對不敏感病例比例懸殊，其敏感度分別為95.9%、1.4%和2.7%，故不對這3種藥物進行單因素logistic回歸分析），僅發現TNF-α水平與EPI對肝癌細胞的抑制率有關（P=0.029），未發現其他炎癥因子與肝癌細胞對相應藥物抑制率有關（P>0.05），見表5。
表4
炎癥因子水平與各用藥方案對肝癌細胞體外抑制率的相關性分析結果
表5
炎癥因子與肝癌細胞對相應藥物敏感度關系的單因素logistic回歸分析結果
3 討論
盡管肝移植和肝切除是治療肝癌最為有效的手段，但肝源的缺乏和相對偏低的具有手術機會的患者比例讓研究者們把目光也投向了非根治性手術治療、全身治療和轉化治療。雖然傳統的介入治療和目前研究較多的靶向治療及免疫治療都已應用于臨床，但由于肝癌的耐藥性與高度異質性，這些治療所帶來的生存獲益并不理想。隨著化療藥物、靶向藥物和免疫藥物種類的多樣化，晚期肝癌患者的治療選擇必然由使用何種治療向使用哪種藥物的方向更加精細化。目前對于晚期肝癌患者的治療如何達到個性化、針對化的研究尚處于摸索階段，本研究便是從免疫功能和炎癥因子方向尋找可以用于指導臨床藥物使用的評估指標，為后面更加成熟的臨床試驗提供方向。
從本研究的結果看，在已用于臨床的細胞毒性藥物中，單一藥物對肝癌細胞的體外抑制效果普遍不佳（除吉西他濱和EPI外，其他藥物的平均抑制率均<25%），而聯合用藥相較于單一藥物則有明顯的提升，這也與以往評估不同的細胞毒性藥物（如ADM[13]、DDP[14]、多西他賽[15]、CPT-11[16]和5-FU[17]）用于治療晚期肝癌的臨床研究結果相符，并且這些研究中發現，單一細胞毒性藥物治療后的客觀緩解率僅為0%～10%，生存獲益欠佳。臨床上對于各類腫瘤的化療通常也是以多藥化療方案進行的。
本研究發現，除索拉非尼外，目前臨床上獲得食品藥品監督管理局批準用于治療肝癌的其他靶向藥物如樂伐替尼、瑞戈非尼、卡博替尼、阿帕替尼等對肝癌細胞的體外抑制效果并不佳（平均抑制率均<25%）；還發現，納入研究的免疫功能相關指標與靶向藥物、細胞毒性藥物單藥（除外CPT-11和羥基喜樹堿）和聯合用藥方案的體外高通量藥物敏感度試驗結果沒有相關性。結合與本研究類似的迷你人源性腫瘤動物移植模型的研究[18]分析其可能有如下原因：① 體外藥物敏感度試驗中的腫瘤細胞沒有形成組織塊，沒有相應的瘤間質和新生血管，導致靶向藥物抗血管生成的重要抗腫瘤作用無法體現；② 體外環境下，免疫細胞在藥物敏感度試驗中的作用相對于體內被弱化，患者免疫水平的差距不能在體外試驗的腫瘤細胞中被完全呈現；③ 體外藥物敏感度試驗的觀察期較短（約1周），靶向藥物的作用較慢，盡管幾種靶向單藥如硼替佐米、羅米地辛、卡非佐米等的體外抑制效果表現突出，但由于沒有肝癌治療的應用與經驗作為參考且使用劑量并不成熟，而且體外藥物敏感度試驗并不能完全代表體內效果，所以本研究結果只能提示它們有治療肝癌的研究潛力，且其安全性與有效性仍需更多論證。
慢性炎癥的致癌作用目前已得到公認，而超過90%的肝癌發生都是在肝損傷和炎癥背景之下[19]。多種炎癥細胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等參與了肝臟慢性炎癥的過程。本研究中發現，共有7種單藥或聯合方案的腫瘤抑制率與IL-6相關、4種與TNF-α相關，提示IL-6和TNF-α可能在上述藥物作用過程中扮演著重要角色。有研究[20]證明，IL-6在慢性炎癥介導的肝癌發生中起到關鍵作用，慢性肝炎期間，活化的庫普弗細胞產生IL-6增強局部炎癥反應并誘導代償性肝細胞增殖，導致肝細胞的腫瘤轉化。而IL-6介導的STAT3激活是肝細胞修復和復制的主要驅動力，同時可促進肝癌發生，一旦肝癌發生，由庫普弗細胞旁分泌產生的IL-6即在肝癌進程中起主導作用[21]。TNF-α則是炎癥的中心介質，在慢性炎癥和惡性腫瘤的發展之間提供了分子聯系[22]，它主要由巨噬細胞產生，也由多種腫瘤細胞產生并促進腫瘤的侵襲和轉移[23-24]；它同時激活核因子-κB和c-Jun氨基末端激酶信號通路，這些通路具有促存活或細胞死亡功能，促進肝癌的發展[25-26]；同時，TNF-α還是促炎細胞因子，可刺激IL-6產生。
除硼替佐米外，IL-6水平與余下6種單藥或聯合方案的抑制率均呈負相關，可在一定程度上說明IL-6在肝癌發生發展中的重要作用，還有可能在肝癌耐藥機制中扮演著重要角色。但進一步建立的與IL-6相關的單因素logistic回歸模型分析并未發現有統計學意義，即不能通過IL-6水平預測相關藥物的體外抑制率，可能與入組例數較少有關，也可能與腫瘤細胞環境的改變相關。值得一提的是，與IL-6相關的3種聯合方案中，均有L-OHP和EPI參與組成，而IL-6與L-OHP和EPI單藥的抑制率卻并無相關性（P=0.899和P=0.063），且二者組成的3種聯合方案的敏感度同樣優于各自單藥，故L-OHP與EPI在治療肝癌是否存在協同效應有待進一步挖掘。本研究結果表明，TNF-α水平與EPI的抑制率呈負相關，且所構建的單因素logistic模型提示TNF-α水平可能可以預測EPI在體外對肝癌細胞的抑制率。EPI通過抑制超螺旋DNA的裂解和抑制DNA的轉錄與復制來抑制拓撲異構酶Ⅱα的活性，現已被用于治療晚期肝癌[27]，相對于其他蒽環類藥物如ADM，它可能會引起較少的副作用[28-29]，如肝功能異常、心臟毒性。本研究中EPI表現出較為突出的抑制率以及與TNF-α有一定的相關性，可為今后臨床晚期肝癌的治療提供部分參考，而其與L-OHP可能存在的協同性則有待進一步研究。
總之，從本研究結果發現，IL-6水平與索拉非尼、卡非佐米、吉西他濱及包含L-OHP和EPI的3種聯合方案對肝癌細胞的體外抑制率呈負相關、與硼替佐米的抑制率呈正相關，但未發現其在預測肝癌細胞在體外對相應藥物敏感度的價值；肝癌患者外周血中TNF-α水平與EPI對肝癌細胞的體外抑制率呈負相關且其在預測肝癌細胞在體外對EPI敏感度有一定的價值，同時雖然發現TNF-α水平與卡博替尼、阿帕替尼和卡非佐米對肝癌細胞的體外的抑制率呈負相關且與ADM對肝癌細胞的體外抑制率呈正相關，但未發現其在預測肝癌細胞在體外對相應藥物的敏感度的價值，有可能為今后的臨床用藥選擇及進一步研究提供參考。通過本研究的初步研究結果可以看到，本研究有一定的優勢，這是一項相對無害的試驗，通過對入組患者免疫功能及炎癥因子水平與各類藥物體外高通量藥物敏感度試驗的結果進行分析，找到了幾組可能具有相關性的組合，若能進一步證實則可為晚期肝癌患者的個性化用藥指導提供了幫助，但也應看到本研究依舊存在缺陷與不足：① 體外高通量藥物敏感度試驗的結果不能完全代表該藥物在體內的效果，缺少組織、器官的層面，使部分藥物無法起效而表現出低抑制率；② 在體外藥物敏感度試驗中具有突出表現的藥物并不代表在體內試驗中具有相同的效果，還需進行安全性及有效性測試后才可能獲得臨床試驗的機會；③ 本研究的測試藥物目錄也仍有改進的空間，如添加當下研究較多的靶向藥物聯合細胞毒性藥物如索拉非尼聯合ADM、索拉非尼聯合吉西他濱等以及免疫治療相關藥物，今后也可設計此類方案探究它們與相關指標是否存在相關性；④ 入組病例的數量仍有擴充的空間，隨著樣本量的增加，更明顯的相關性可能被觀察到，也使獲得的數據更具有說服力。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮國英參與研究并負責論文撰寫；陳凱參與研究并提供統計學指導；楊旭、陶杰負責收集患者臨床數據；史政榮參與研究設計并負責協調研究工作和論文審校。
倫理聲明：本研究通過了重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審批，批文編號：2019年科研倫理（2019-021）號。
志謝 感謝中科院合肥技術創新工程院精準靶向藥物工程中心、安徽省精準用藥技術工程實驗室、合肥中科普瑞昇生物醫藥科技有限公司對本研究的試驗及部分理論支持。
肝細胞癌（以下簡稱“肝癌” ）是世界第6大常見癌及第4大惡性腫瘤死亡病因[1]。由于肝癌早期起病隱匿、癥狀不典型，超過一半的患者確診時已處于疾病中晚期，腫瘤多發、瘤體過大或伴轉移使其喪失了手術治療機會[2]。局部治療和全身治療目前廣泛應用于中晚期肝癌[3]，其單獨或聯合使用如經肝動脈化學治療（簡稱化療）栓塞聯合索拉非尼[4]或其聯合阿帕替尼[5]、肝動脈灌注化療聯合索拉非尼[6]等在臨床上取得了一些成效，但中晚期肝癌患者從中獲得的收益仍不樂觀。肝癌細胞的天然耐藥性、多種耐藥相關蛋白高表達及肝癌極高的異質性共同促進了肝癌細胞耐藥[7-9]，導致肝癌對多種全身治療藥物的反應不佳。肝癌作為一種免疫原性腫瘤，與病毒感染及感染所致的炎癥環境密切相關，慢性炎癥因子相關的免疫抑制和多種免疫細胞共存并在一系列復雜通路中的相互作用是導致腫瘤產生的重要原因[10-11]。
高通量藥物敏感度篩選是以臨床患者肝癌病理標本為基礎，對此進行原代癌細胞培養，從體外藥物敏感度試驗的結果中篩選對患者治療可能有益的用藥方案。已有研究[12]證明，將高通量藥物敏感度篩選用于協助選擇肝癌患者術后輔助化療藥物相對于經驗性使用化療藥物更具安全性與可靠性，但將這種治療模式廣泛應用于臨床仍有距離。本研究通過高通量藥物敏感度篩選將數種細胞毒性藥物、靶向藥物及聯合用藥方案的抑制率與對應的肝癌患者外周血淋巴細胞和炎癥因子水平相結合并進行分析，以尋找二者可能存在的相關性，以期為當前臨床治療的藥物選擇提供參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究回顧性納入2019年12月至2021年6月期間于重慶醫科大學附屬第一醫院肝臟中心接受手術治療的肝癌患者。納入標準：① 年齡18～75歲；② 術后病理學檢查診斷為肝癌；③ 肝癌標本成功完成原代培養和藥物敏感度檢測；④ 患者治療期間接受了機體免疫功能和炎癥因子兩項檢測中的至少一項。排除標準：① 年齡<18歲或>75歲的患者；② 非肝癌或肝癌合并其他惡性腫瘤、免疫相關疾病等；③ 伴腫瘤破裂或各類原發或繼發感染的患者；④ 無法獲得足夠樣本進行原代腫瘤細胞培養；⑤ 肝癌組織由于取樣、運輸、培養過程等因素造成標本污染而無法獲得原代肝癌細胞；⑥ 培養失敗等原因無法獲取藥物敏感度檢測結果；⑦ 拒絕研究的患者。
1.2 倫理與知情同意
本研究符合1975年修訂的《赫爾辛基宣言》的倫理準則，已經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準并在中國臨床試驗中心（
1.3 高通量藥物敏感度試驗流程
1.3.1 標本的處理
術中獲取的肝癌標本置于運輸液（美天旎，貨號130-100-008）中，于4 ℃冷藏條件下運送，送樣時間不超過48 h，整個處理及運輸過程保證樣本處于無菌狀態。使用消化酶消化法，搖床上37 ℃、300 r/min孵育消化得到腫瘤原代細胞。為最大程度保持與臨床患者體內腫瘤一致性，只對腫瘤原代細胞進行1次體外擴增。消化完成后，組織懸液過100 μm濾網用5 mL清洗液沖洗濾網（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）后棄上清液，紅細胞裂解液重懸細胞，輕柔混勻，4 ℃裂解（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min），裂解期間拿出顛倒混勻1次，裂解紅細胞結束。棄上清液，加入5 mL清洗液重懸細胞（1 500 r/min，r=13.5 cm，5 min），輕柔混勻。棄上清液，加入1 mL肝癌細胞專用完全培養基（合肥中科普瑞昇生物醫藥科技有限公司，貨號#00-G0007-CM）重懸細胞，輕柔混勻。取10 μL細胞于血細胞計數板上，鏡下觀察，通過臺盼藍染色計數并計算原代細胞活性。以1×105個/mL的密度將計數后的原代細胞加入細胞樣品箱中，制作384孔細胞培養板，進行短時間（6～12 h）培養。
1.3.2 高通量藥物敏感度試驗
將原代肝癌細胞分為試驗組與對照組分別接種到藥物篩選板上，試驗組使用受試藥物，所有藥物均使用二甲基亞砜溶解稀釋；對照組僅予以二甲基亞砜處理。采用自動工作平臺JANUS@automated workstation（Pekin Elmer Inc，Wellesley，MA，USA）進行加藥，每孔0.1 μL。給藥后置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育72 h，再加入10 μL CellTiter-Glo細胞增殖熒光檢測試劑，靜置10 min后使用Envision Plate Reader（Perkin Elmer Inc，Wellesley，MA，USA）計數。細胞增殖抑制率計算方法：抑制率（%）=（1–試驗組腫瘤細胞存活數目/對照組腫瘤細胞存活數目）×100%。
1.4 受試藥物和藥物敏感度分析
本研究中所涉及的藥物包含NCCN指南推薦的肝癌治療藥物（表1），藥物劑量符合臨床使用標準，同時加用抗腫瘤的其他藥物作為備用，以期發現針對該測試患者精準有效的藥物。本研究中以100%血漿峰值濃度（依據患者對試驗藥物理論上可接受的最大血藥濃度，通過公式換算成體外細胞作用的濃度）作為篩選濃度，以評價藥物對癌細胞的細胞毒作用，代表臨床劑量下藥物的效果。抑制率越高，代表此患者的肝癌細胞對該藥的敏感度越高。將抑制率≥80%定義為高度敏感，50%≤抑制率<80%為中度敏感，25%≤抑制率<50%為低度敏感，抑制率<25%為不敏感[12]。將抑制率≥50%劃分為相對敏感組，<50%劃分為相對不敏感組。
表1
研究藥物的組成及劑量
1.5 肝癌患者外周血中相關指標檢測
所有肝癌患者的外周血標本均交由重慶醫科大學臨床分子檢測中心進行免疫功能及炎癥因子水平測定。免疫功能指標包括總淋巴細胞、總T淋巴細胞（CD3+）、輔助/誘導T淋巴細胞（CD4+）、抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞；炎癥因子指標包括白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-5、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-α、IFN-γ。
1.6 統計學方法
使用SPSS 24.0軟件（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）進行統計分析。計量資料采用偏度-峰度檢驗法進行正態分布檢驗，符合正態分布者用均數±標準差（±s）表示，不符合正態分布者用中位數（median，M）和上下四分位數（P25，P75）表示。機體免疫功能和炎癥因子水平與藥物抑制率的相關性分析使用Spearman法。使用單因素logistic回歸模型評估相關性分析結果中P<0.05的免疫或炎癥指標與肝癌細胞對相應藥物體外藥物敏感度的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
本研究共納入74例肝癌患者行體外高通量藥物敏感度試驗。其中59例接受了機體免疫功能檢測，36例接受了炎癥因子檢測，至少完成1項檢測的病例共60例，其中男54例、女6例，年齡（57±11）歲，合并乙肝46例（76.7%）、合并肝硬化25例（41.7%），單發病灶53例、多發病灶7例，腫瘤最大直徑（53.32±32.15）mm。
2.2 體外高通量藥物敏感度和實驗室檢測結果
納入研究的74例肝癌患者中，27種單藥或聯合用藥的抑制率及肝癌細胞對藥物的體外敏感度結果見表2。體外抑制率方面，只有1種（硼替佐米）的體外抑制率>80%，即高度敏感；有4種（羅米地辛、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU、L-OHP+CPT-11+EPI、L-OHP+EPI）用藥方案的體外抑制率>50%，即中度敏感；余下22種用藥方案的體外抑制率均不理想，其中9種用藥方案體外抑制率的P75值均<25%。敏感度方面，共5種（硼替佐米、羅米地辛、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU、L-OHP+CPT-11+EPI、L-OHP+EPI）用藥方案的敏感度≥50%，瑞戈非尼和DDP用藥患者無敏感病例。
表2
74例肝癌患者體外高通量藥物敏感度篩選結果
2.3 免疫功能及炎癥因子水平結果
59例患者的機體免疫功能檢測結果（單位：個/μL）：總淋巴細胞數為1 525.56±572.56，CD3+ 細胞數為1 082.64±448.45，CD4+ 細胞數為685.05±298.31，CD8+ 細胞數為307.00（212.00，440.00），CD19+ 細胞數為185.00（109.00，284.00），NK細胞數為194.00（114.00，294.00）。
36例患者的炎癥因子檢測結果（單位：ng/L）：IL-1β水平為1.94（0.86，9.58），IL-5水平為1.30（0.77，7.68），IL-6水平為3.29（0.97，19.24），IL-8水平為2.92（0.98，10.86），TNF-α水平為1.57（0.56，3.61），IFN-α水平為0.30（0.83，2.77），IFN-γ水平為0.83（0.45，11.93）。
2.4 免疫功能及炎癥因子水平與體外高通量藥物敏感度結果的相關性檢驗結果
2.4.1 免疫功能與體外高通量藥物敏感度結果
結果見表3。從表3可見，僅發現NK細胞數與CPT-11和羥基喜樹堿對肝癌細胞體外抑制率有關（P<0.05）；未發現其他免疫功能指標與其他靶向藥物或細胞毒性藥物或聯合方案對肝癌細胞體外抑制率有關（P>0.05）。由于CPT-11和羥基喜樹堿這2種藥物的敏感度和平均抑制率均較低（分別為6.8%和17.84%與6.8%和18.54%），故未進行單因素logistic回歸進一步分析其影響。
表3
機體免疫功能指標與各用藥方案對肝癌細胞體外抑制率的相關性分析結果
2.4.2 炎癥因子水平與體外高通量藥物敏感度結果的相關性
結果見表4。從表4可見，IL-1β與L-OHP對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；IL-6與硼替佐米、索拉非尼、卡非佐米、吉西他濱、L-OHP+EPI+CPT-11+5-FU方案、L-OHP+CPT-11+EPI方案、L-OHP+EPI方案對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；TNF-α與卡博替尼、阿帕替尼、卡非佐米、ADM和EPI對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；IFN-γ與PIAF方案對肝癌細胞的抑制率有關（P<0.05）；未發現其他炎癥因子與其他靶向藥物或細胞毒性藥物或聯合方案對肝癌細胞的抑制率有關（P>0.05）。進一步分析其影響時（由于硼替佐米、阿帕替尼和卡博替尼3種藥物中相對敏感與相對不敏感病例比例懸殊，其敏感度分別為95.9%、1.4%和2.7%，故不對這3種藥物進行單因素logistic回歸分析），僅發現TNF-α水平與EPI對肝癌細胞的抑制率有關（P=0.029），未發現其他炎癥因子與肝癌細胞對相應藥物抑制率有關（P>0.05），見表5。
表4
炎癥因子水平與各用藥方案對肝癌細胞體外抑制率的相關性分析結果
表5
炎癥因子與肝癌細胞對相應藥物敏感度關系的單因素logistic回歸分析結果
3 討論
盡管肝移植和肝切除是治療肝癌最為有效的手段，但肝源的缺乏和相對偏低的具有手術機會的患者比例讓研究者們把目光也投向了非根治性手術治療、全身治療和轉化治療。雖然傳統的介入治療和目前研究較多的靶向治療及免疫治療都已應用于臨床，但由于肝癌的耐藥性與高度異質性，這些治療所帶來的生存獲益并不理想。隨著化療藥物、靶向藥物和免疫藥物種類的多樣化，晚期肝癌患者的治療選擇必然由使用何種治療向使用哪種藥物的方向更加精細化。目前對于晚期肝癌患者的治療如何達到個性化、針對化的研究尚處于摸索階段，本研究便是從免疫功能和炎癥因子方向尋找可以用于指導臨床藥物使用的評估指標，為后面更加成熟的臨床試驗提供方向。
從本研究的結果看，在已用于臨床的細胞毒性藥物中，單一藥物對肝癌細胞的體外抑制效果普遍不佳（除吉西他濱和EPI外，其他藥物的平均抑制率均<25%），而聯合用藥相較于單一藥物則有明顯的提升，這也與以往評估不同的細胞毒性藥物（如ADM[13]、DDP[14]、多西他賽[15]、CPT-11[16]和5-FU[17]）用于治療晚期肝癌的臨床研究結果相符，并且這些研究中發現，單一細胞毒性藥物治療后的客觀緩解率僅為0%～10%，生存獲益欠佳。臨床上對于各類腫瘤的化療通常也是以多藥化療方案進行的。
本研究發現，除索拉非尼外，目前臨床上獲得食品藥品監督管理局批準用于治療肝癌的其他靶向藥物如樂伐替尼、瑞戈非尼、卡博替尼、阿帕替尼等對肝癌細胞的體外抑制效果并不佳（平均抑制率均<25%）；還發現，納入研究的免疫功能相關指標與靶向藥物、細胞毒性藥物單藥（除外CPT-11和羥基喜樹堿）和聯合用藥方案的體外高通量藥物敏感度試驗結果沒有相關性。結合與本研究類似的迷你人源性腫瘤動物移植模型的研究[18]分析其可能有如下原因：① 體外藥物敏感度試驗中的腫瘤細胞沒有形成組織塊，沒有相應的瘤間質和新生血管，導致靶向藥物抗血管生成的重要抗腫瘤作用無法體現；② 體外環境下，免疫細胞在藥物敏感度試驗中的作用相對于體內被弱化，患者免疫水平的差距不能在體外試驗的腫瘤細胞中被完全呈現；③ 體外藥物敏感度試驗的觀察期較短（約1周），靶向藥物的作用較慢，盡管幾種靶向單藥如硼替佐米、羅米地辛、卡非佐米等的體外抑制效果表現突出，但由于沒有肝癌治療的應用與經驗作為參考且使用劑量并不成熟，而且體外藥物敏感度試驗并不能完全代表體內效果，所以本研究結果只能提示它們有治療肝癌的研究潛力，且其安全性與有效性仍需更多論證。
慢性炎癥的致癌作用目前已得到公認，而超過90%的肝癌發生都是在肝損傷和炎癥背景之下[19]。多種炎癥細胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等參與了肝臟慢性炎癥的過程。本研究中發現，共有7種單藥或聯合方案的腫瘤抑制率與IL-6相關、4種與TNF-α相關，提示IL-6和TNF-α可能在上述藥物作用過程中扮演著重要角色。有研究[20]證明，IL-6在慢性炎癥介導的肝癌發生中起到關鍵作用，慢性肝炎期間，活化的庫普弗細胞產生IL-6增強局部炎癥反應并誘導代償性肝細胞增殖，導致肝細胞的腫瘤轉化。而IL-6介導的STAT3激活是肝細胞修復和復制的主要驅動力，同時可促進肝癌發生，一旦肝癌發生，由庫普弗細胞旁分泌產生的IL-6即在肝癌進程中起主導作用[21]。TNF-α則是炎癥的中心介質，在慢性炎癥和惡性腫瘤的發展之間提供了分子聯系[22]，它主要由巨噬細胞產生，也由多種腫瘤細胞產生并促進腫瘤的侵襲和轉移[23-24]；它同時激活核因子-κB和c-Jun氨基末端激酶信號通路，這些通路具有促存活或細胞死亡功能，促進肝癌的發展[25-26]；同時，TNF-α還是促炎細胞因子，可刺激IL-6產生。
除硼替佐米外，IL-6水平與余下6種單藥或聯合方案的抑制率均呈負相關，可在一定程度上說明IL-6在肝癌發生發展中的重要作用，還有可能在肝癌耐藥機制中扮演著重要角色。但進一步建立的與IL-6相關的單因素logistic回歸模型分析并未發現有統計學意義，即不能通過IL-6水平預測相關藥物的體外抑制率，可能與入組例數較少有關，也可能與腫瘤細胞環境的改變相關。值得一提的是，與IL-6相關的3種聯合方案中，均有L-OHP和EPI參與組成，而IL-6與L-OHP和EPI單藥的抑制率卻并無相關性（P=0.899和P=0.063），且二者組成的3種聯合方案的敏感度同樣優于各自單藥，故L-OHP與EPI在治療肝癌是否存在協同效應有待進一步挖掘。本研究結果表明，TNF-α水平與EPI的抑制率呈負相關，且所構建的單因素logistic模型提示TNF-α水平可能可以預測EPI在體外對肝癌細胞的抑制率。EPI通過抑制超螺旋DNA的裂解和抑制DNA的轉錄與復制來抑制拓撲異構酶Ⅱα的活性，現已被用于治療晚期肝癌[27]，相對于其他蒽環類藥物如ADM，它可能會引起較少的副作用[28-29]，如肝功能異常、心臟毒性。本研究中EPI表現出較為突出的抑制率以及與TNF-α有一定的相關性，可為今后臨床晚期肝癌的治療提供部分參考，而其與L-OHP可能存在的協同性則有待進一步研究。
總之，從本研究結果發現，IL-6水平與索拉非尼、卡非佐米、吉西他濱及包含L-OHP和EPI的3種聯合方案對肝癌細胞的體外抑制率呈負相關、與硼替佐米的抑制率呈正相關，但未發現其在預測肝癌細胞在體外對相應藥物敏感度的價值；肝癌患者外周血中TNF-α水平與EPI對肝癌細胞的體外抑制率呈負相關且其在預測肝癌細胞在體外對EPI敏感度有一定的價值，同時雖然發現TNF-α水平與卡博替尼、阿帕替尼和卡非佐米對肝癌細胞的體外的抑制率呈負相關且與ADM對肝癌細胞的體外抑制率呈正相關，但未發現其在預測肝癌細胞在體外對相應藥物的敏感度的價值，有可能為今后的臨床用藥選擇及進一步研究提供參考。通過本研究的初步研究結果可以看到，本研究有一定的優勢，這是一項相對無害的試驗，通過對入組患者免疫功能及炎癥因子水平與各類藥物體外高通量藥物敏感度試驗的結果進行分析，找到了幾組可能具有相關性的組合，若能進一步證實則可為晚期肝癌患者的個性化用藥指導提供了幫助，但也應看到本研究依舊存在缺陷與不足：① 體外高通量藥物敏感度試驗的結果不能完全代表該藥物在體內的效果，缺少組織、器官的層面，使部分藥物無法起效而表現出低抑制率；② 在體外藥物敏感度試驗中具有突出表現的藥物并不代表在體內試驗中具有相同的效果，還需進行安全性及有效性測試后才可能獲得臨床試驗的機會；③ 本研究的測試藥物目錄也仍有改進的空間，如添加當下研究較多的靶向藥物聯合細胞毒性藥物如索拉非尼聯合ADM、索拉非尼聯合吉西他濱等以及免疫治療相關藥物，今后也可設計此類方案探究它們與相關指標是否存在相關性；④ 入組病例的數量仍有擴充的空間，隨著樣本量的增加，更明顯的相關性可能被觀察到，也使獲得的數據更具有說服力。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮國英參與研究并負責論文撰寫；陳凱參與研究并提供統計學指導；楊旭、陶杰負責收集患者臨床數據；史政榮參與研究設計并負責協調研究工作和論文審校。
倫理聲明：本研究通過了重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審批，批文編號：2019年科研倫理（2019-021）號。
志謝 感謝中科院合肥技術創新工程院精準靶向藥物工程中心、安徽省精準用藥技術工程實驗室、合肥中科普瑞昇生物醫藥科技有限公司對本研究的試驗及部分理論支持。
