引用本文： 陳泰安, 楊發才, 何理, 熊永福, 李敬東. 循環腫瘤DNA在乙肝病毒性肝細胞癌中診斷價值的meta分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(6): 783-794. doi: 10.7507/1007-9424.202108085 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例約841 000例，居全球癌癥死亡第3位[1]。在中國，慢性乙肝病毒感染是最常見的原因。據統計，有20%～30%的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B， CHB）和肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者有發展為HCC的可能，且在感染30年后發生率將顯著增高[2]。目前，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是最常用于HCC的篩查、診斷以及治療后監測的血清學檢測指標，然而，其敏感度、假陰性率和假陽性率遠不能令人滿意[3]。大約30%的晚期HCC患者在確診時AFP水平未見明顯異常，但在急性肝炎、生殖腺胚胎源性腫瘤等非HCC患者中發現高水平的AFP（>200 μg/L） [4]。因此，迫切需要更高診斷效能的非侵入性且臨床適用的HCC篩查工具以優化HCC患者的診斷和預后評估。
隨著新分子技術的不斷發展，液體活檢這一新診斷概念在近幾年受到了極大的關注。這是一種在非實體生物組織（如血液、尿液、腦脊液等）中對循環腫瘤DNA/無細胞DNA、循環腫瘤細胞、循環miRNA、外泌體等進行收集和分析的診斷和監測方法[5]。其中，基于循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）的液體活檢分析在多種組織類型的早期癌癥篩查中顯示出令人鼓舞的前景[6-7]。Qu等[8]使用基于多個突變基因的ctDNA檢測技術在3 793例HBV感染群體中篩查早期HCC和非HCC患者，結果顯示敏感度為85%、特異度為93%，具有較高的診斷價值。
盡管有研究[9-11]顯示了ctDNA在HBV相關HCC方面的診斷價值，但結果差異很大。因此，筆者對所有符合納入標準的研究進行薈萃分析，以客觀評估ctDNA作為潛在生物學標志物在區分早期HCC與CHB/LC高危個體的能力，以期為技術改進和臨床應用提供循證依據。
1 資料與方法
1.1 文獻來源
1.1.1 入選標準
① 病例組為乙肝病毒性肝細胞癌（hepatitis B viral hepatocellular carcinoma，HBV-HCC）患者，且均經病理或影像學檢查確診，對照組為HBV感染和（或）HBV相關肝臟良性疾病患者；② 從血清或血漿中提取ctDNA；③ 能提取或計算出真陽性、假陽性、假陰性和真陰性的數據用于構建2×2列表；④ 研究樣本量大于20例；⑤ 語言為英文。
1.1.2 排除標準
① 個案報道、綜述、動物實驗或會議報告等文獻；② 無法從原始文獻中提取有效數據；③ 重復發表或無法獲取全文的文獻；④ 樣本來源于肝臟組織、尿液、細胞系或動物。
1.2 檢索策略及文獻質量評價
采用主題詞與自由詞相結合的檢索策略，以 “Circulating Tumor” “ctDNA” “DNA” “hepatocellular carcinoma” “HCC”和“Hepatitis B virus” 作為關鍵詞，檢索PubMed、Embase、Web of Science和Cochrane Library數據庫中關于ctDNA診斷HBV-HCC的隊列研究或病例對照研究，檢索年限為建庫至2021年4月26日，同時輔以手動檢索。嚴格按照流程進行文獻篩選，排除不符合要求的文獻，并標明原因。根據診斷性試驗研究質量評估量表（QUADAS-2）[12]，對所有納入文獻的偏倚風險和外部真實性問題通過4個關鍵指標（病例選擇、待評價實驗、金標準以及流程和進展情況）評估為“低風險”“高風險”和“風險不明確” 。所有研究均由兩位作者獨立評估和評級。意見不統一時經協商解決或由第3名研究者再次評估。以 PubMed 為例，具體檢索策略見框1。
圖k1
1.3 數據收集
由兩位研究者獨立對納入的研究進行數據提取后，共同審查并總結出最終結果。從符合條件的研究中提取以下信息：第一作者姓名、出版年、國家、樣本量、對照類型、樣本來源、實驗方法、DNA類型、敏感度、特異度、真陽性、真陰性、假陽性、假陰性、陽性似然比、陰性似然比和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under curve，AUC）指標。
1.4 統計學方法
本meta分析通過RevMan 5.3和Stata 14.0軟件完成。計算合并的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷比值比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（95% confidence interval，95%CI）作為評估指標。同時，生成合并的受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線并獲得對應的AUC值，以評估整體檢測的準確性，AUC值越接近1，診斷效能越高。同時繪制Fagan圖以驗證其臨床效能。 閾值效應采用SROC曲線和Spearman相關系數及其P值進行評估，若SROC曲線的散點呈手臂和肩膀樣分布，或當Spearman相關系數呈負值且P<0.05時，表明閾值效應存在；若存在閾值效應，則僅繪制SROC曲線進行匯總分析；若異質性是由非閾值效應引起的，則采用Q檢驗評估研究間異質性。如P≥0.05且I2≤50%，表明各研究結果間統計學異質性較低，采用固定效應模型；若P<0.05且I2>50%，表明各研究間存在明顯異質性，需采用隨機效應模型分析；并進行敏感性分析、meta回歸分析及亞組分析進一步探討異質性來源。最后，繪制Deek’s漏斗圖以檢測潛在的發表偏倚。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 文獻檢索流程
根據文獻檢索策略，本研究共檢索出相關文獻264篇，包括PubMed 55篇，Embase 80篇，Web of Science 99篇，Cochrane Library 30篇。其中有98篇重復文獻，26篇綜述、評價、摘要或動物實驗，71篇研究內容不吻合文獻，29篇文獻研究對象為非乙肝病毒性HCC，24篇文獻無敏感度和特異度等結局指標。最終，有16項研究納入分析（圖1）。
圖1
示文獻檢索流程圖
2.2 納入文獻的基本情況和質量評價
16項研究[8-11, 13-24]的基本情況如表1所示。共納入3 744例患者，其中1 852例為HBV-HCC患者，1 892例為無HCC的HBV患者。總共有12項研究[8, 10-11, 14-17, 19-20, 22-24]采用定性分析，3項研究[9, 13, 21]采用定量分析，1項研究 [18]結合定性和定量分析。此外，11項研究[9-11, 13, 15, 17, 19, 21-24]評估了AFP檢測對HCC的診斷準確性，8項研究[10-11, 15, 17, 19, 22-24]評估了ctDNA聯合AFP檢測在HCC中的診斷效能。根據診斷準確性研究質量評估量表（QUADAS-2）[12]對所有納入研究進行方法學質量評估（表2），除Tao（2020） [18]研究外，其余15篇文獻表現出中-高等質量，表明納入研究的整體質量是穩健的。
表1
納入文獻基本特征
表2
納入研究的文獻質量評價結果
2.3 閾值效應
通過SROC曲線和敏感度對數與（1–特異度）對數之間的Spearman相關系數評估閾值效應。結果表明，SROC曲線的形狀不像手臂和肩膀樣的形狀分布，在16項研究中，Spearman相關系數為0.174（P=0.254），表明不存在閾值效應。
2.4 ctDNA在HBV-HCC患者中的診斷價值
16項研究[8-11, 13-24] 分析了ctDNA在HBV-HCC患者中的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%， P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析。匯總結果顯示：敏感度為0.85 ［95%CI為（0.78，0.90）］、特異度為0.74 ［95%CI為（0.63，0.83）］、陽性似然比為3.29 ［95%CI為（2.30，4.70）］、陰性似然比為0.21 ［95%CI為（0.15，0.28）］、診斷OR為15.98 ［95%CI（10.65，23.99）］和AUC為0.87 ［95%CI為（0.84，0.90）］，見圖2和圖3。該結果提示，ctDNA具有很高的診斷準確性。
圖2
示ctDNA診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖3
示ctDNA診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.5 AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值
在所有納入研究中，有11項研究 [9-11, 13, 15, 17, 19, 21-24]分析了AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%，P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析，其結果顯示：敏感度為0.77 ［95%CI為（0.70，0.83）］、特異度為0.61 ［95%CI為（0.50，0.70）］、陽性似然比為1.95 ［95%CI為（1.53，2.50）］、陰性似然比為0.38 ［95%CI為（0.29，0.50）］、診斷OR為5.12 ［95%CI為（3.22，8.16）］和AUC為0.76 ［95%CI為（0.72，0.80）］，見圖4和圖5。該結果顯示， AFP的診斷準確性低于ctDNA。
圖4
示AFP診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖5
示AFP診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.6 ctDNA聯合AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值
共有8項研究 [10-11, 15, 17, 19, 22-24]分析了ctDNA聯合AFP的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%，P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析。其結果顯示：敏感度為0.86 ［95%CI為（0.80，0.90）］、特異度為0.79 ［95%為（0.68，0.87）］、陽性似然比為4.08 ［95%為（2.69，6.18）］、陰性似然比為0.18 ［95%CI（0.13，0.25）］、診斷OR為22.69 ［95%為（13.64，37.76）］和AUC為0.90 ［95%為（0.87，0.92）］，見圖6和圖7。其結果提示：ctDNA聯合AFP能以更高的靈敏度和特異度在CHB/LC高危人群中篩查出肝癌患者。
圖6
示ctDNA聯合AFP診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖7
示ctDNA聯合AFP診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.7 meta回歸分析
本研究使用log OR作為應變量，將地區、樣本量、樣本類型、檢測方式、檢測類型以及文獻質量作為協變量進行meta回歸分析。I2值為81.18%，表明異質性可以用81.18%的殘余變異來解釋；校正決定系數為17.58%，這可以由研究間異質性來解釋。本meta回歸分析結果顯示：研究間的異質性與地區（P=0.973）、樣本量(P=0.544)、樣本類型(P=0.217)、檢測方式(P=0.474)、檢測類型(P=0.656)以及文獻質量(P=0.208)均無相關性，未發現有統計學差異的協變量存在。具體見表3。
表3
ctDNA對HBV-HCC診斷價值的meta回歸分析結果
2.8 亞組分析
根據樣本量、樣本類型和檢測類型進行亞組分析。各亞組分析的合并敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷OR和AUC結果見表4。在HBV-HCC的診斷中，定性分析比定量分析具有更高的診斷價值：敏感度（0.88 比 0.81）、特異度（0.82比 0.61）、陽性似然比（4.91比 2.15）、陰性似然比（0.19比 0.26）、診斷OR（29.8比 8.26）和AUC（0.91比 0.82）。相較于血清，血漿來源樣本的敏感度更高（0.89 比 0.82），但特異度更低（0.72比 0.76）。樣本量≥100研究的診斷準確性略高于樣本量<100的研究，敏感度（0.86 比 0.84）、特異度（0.82比 0.82）和AUC（0.91比 0.90）。
表4
ctDNA對HBV-HCC診斷價值的亞組分析結果
2.9 敏感性分析結果
結果如圖8所示，分別剔除每項研究后均未發現明顯影響結果及異質性的因素。
圖8
敏感性分析結果
2.10 發表偏倚分析結果
ctDNA診斷價值匯總研究的Deek’s檢驗結果為t=0.46，P=0.67（圖9a），AFP診斷價值匯總研究的Deek’s檢驗結果為t=–0.04，P=0.97（圖9b），均未顯示出明顯的發表偏倚。
圖9
示ctDNA（a）和AFP（b）發表偏倚分析結果及ctDNA診斷HBV-HCC的Fagan圖（c）
2.11 ctDNA的診斷效能驗證結果
通過繪制Fagan圖計算驗后概率，如圖9c所示，若經基于ctDNA的液體活檢診斷為HBV-HCC時，確診為HCC的概率為77%；如若為陰性結果，則患有HBV-HCC的概率則為17%。提示ctDNA診斷HBV-HCC具有較高的準確率。
3 討論
在免疫治療新時代下，HCC患者的預后仍不理想，但以外科干預為主的綜合治療取得了一定的成績，早期HCC患者經積極根治性手術或肝移植后5年無復發生存率高達70%， HCC的不良預后和高病死率在很大程度上歸因于其低早期診斷率[13]。現已證實，絕大多數（96.2%） 的HCC患者都存在ctDNA突變[9]。基于ctDNA的液體活檢不僅具有檢測早期HCC的良好前景，更能提供來自所有原發性和轉移性腫瘤的遺傳和表觀遺傳信息并反映腫瘤異質性。為了評估ctDNA作為HBV-HCC循環生物標志物的適用性和準確性，筆者進行了該項meta分析，以提供全面和最新的分析。
本meta分析結果中，ctDNA診斷HBV-HCC的敏感度為0.85 ［95%CI為（0.78，0.90）］，特異度為0.74 ［95%CI為（0.63，0.83）］，在HBV-HCC患者中顯示出令人滿意的診斷效能。 本meta分析結果顯示，用于區分HBV-HCC與CHB感染者的ctDNA檢測的診斷OR為 15.98 ［95%CI為（10.65，23.99）］，其數值高于10，提示ctDNA檢測的診斷價值較高。此外，本meta分析還通過繪制SROC曲線及對應的AUC以評估整體診斷準確性，旨在為臨床使用提供更有意義的參考，其結果顯示：ctDNA診斷HBV-HCC的AUC值為0.87 ［95%CI為（0.84，0.90）］，提示ctDNA達到了高水平的診斷標準[25]。本meta分析結果還顯示，AFP作為HCC診斷最常用的生物標志物，敏感度為0.77 ［95%CI為（0.70，0.83）］、特異度為0.61 ［95%CI為（0.50，0.70）］，AUC為0.76 ［95%CI為（0.72，0.80）］，其診斷效能差強人意。以上結果表明，ctDNA檢測的診斷準確性優于單獨的AFP檢測。此外，ctDNA聯合AFP檢測具有較單獨使用任何一種方法具有更高的準確性，其敏感度為0.86 ［95%CI為（0.80，0.90）］、特異度為0.79 ［95%CI為（0.68，0.87）］、AUC為0.90 ［95%CI為（0.87，0.92）］。亞組分析結果顯示，定性分析比定量分析準確性更高，敏感度、特異度和AUC值分別是0.88、0.82、0.91和0.81、0.61及0.82。這與Chen等[14]的研究結果相一致，他們在HBV背景下ctDNA數量和完整性對HCC診斷價值的研究中發現，ctDNA的質量改變能更好地表征循環中釋放的腫瘤DNA，具有更高的診斷價值（AUC為0.83 比 0.56），而非數量變化。本meta分析結果顯示，與血漿組相比，血清組的敏感度（0.82 比 0.89）和AUC（0.86 比0.88）更低，而血清組的特異度優于血漿組（0.76比0.72），這可能是因為選擇用于檢測的基因位點主要存在于血清中所致。由于從全血中分離DNA過程中的分配不均導致血清中DNA含量更高，且因細胞破裂而釋放的外來DNA水平更低，因此血清可能是更好的ctDNA檢測標本[26]。目前，各研究所選擇的ctDNA檢測位點、技術或方法各具不同，導致敏感度和特異度結果良莠不齊，因此筆者強調液體活檢技術在收集、分離、富集或檢測階段應標準化。此外，在液體活檢中ctDNA的應用存在的局限性仍有待進一步闡明，包括早期腫瘤的ctDNA濃度較低（<1%）、循環DNA與腫瘤DNA的突變譜不完全重疊、有CHB/LC病史的高危人群可能存在某些驅動因子突變進而影響檢測效能、ctDNA釋放入血的機制尚未完全闡明等[8, 27-30]。下一代測序技術的發展極大改善了各類腫瘤遺傳變異的識別[31]。 因此，整合多個HBV相關HCC的特異性突變位點對于確保診斷效能的穩健性至關重要。
本研究進行了meta回歸分析等以探索異質性的潛在來源，就納入分析的協變量而言，未發現任何參數（例如樣本來源、樣本量、對照類型、測定方法和研究質量）有異質性，敏感性分析也未發現明顯影響異質性的研究。因此，異質性可能是由于其他原因引起的，包括ctDNA選擇、入組患者年齡、腫瘤大小、淋巴結浸潤、TNM 分期和手術方案的差異，由于數據部分不足，本研究未能對其進行評估。
本meta分析可能存在一些局限性：首先，雖然進行了系統的文獻檢索，但仍可能存在部分有價值的研究被遺漏和未納入本meta分析；其次，因為僅檢索了英文數據庫，有存在發表偏倚的可能；最后，由于研究數據有限，未能納入腫瘤大小、淋巴結浸潤和腫瘤的TNM分期等協變量進一步探討異質性的來源。
總之，本meta分析結果表明，ctDNA能以較高的敏感度、特異度和準確率診斷HBV-HCC，并且可以作為HBV相關HCC早期診斷中有潛力的循環生物學標志物。血清ctDNA聯合AFP檢測有利于提高HBV-HCC的診斷準確性。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：陳泰安、楊發才和熊永福負責構思與設計研究，統計學處理，撰寫論文；何理和熊永福參與檢索文獻，數據提取；陳泰安和楊發才負責結果的分析與解釋，論文的修改；李敬東負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責和監督管理。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例約841 000例，居全球癌癥死亡第3位[1]。在中國，慢性乙肝病毒感染是最常見的原因。據統計，有20%～30%的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B， CHB）和肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者有發展為HCC的可能，且在感染30年后發生率將顯著增高[2]。目前，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是最常用于HCC的篩查、診斷以及治療后監測的血清學檢測指標，然而，其敏感度、假陰性率和假陽性率遠不能令人滿意[3]。大約30%的晚期HCC患者在確診時AFP水平未見明顯異常，但在急性肝炎、生殖腺胚胎源性腫瘤等非HCC患者中發現高水平的AFP（>200 μg/L） [4]。因此，迫切需要更高診斷效能的非侵入性且臨床適用的HCC篩查工具以優化HCC患者的診斷和預后評估。
隨著新分子技術的不斷發展，液體活檢這一新診斷概念在近幾年受到了極大的關注。這是一種在非實體生物組織（如血液、尿液、腦脊液等）中對循環腫瘤DNA/無細胞DNA、循環腫瘤細胞、循環miRNA、外泌體等進行收集和分析的診斷和監測方法[5]。其中，基于循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）的液體活檢分析在多種組織類型的早期癌癥篩查中顯示出令人鼓舞的前景[6-7]。Qu等[8]使用基于多個突變基因的ctDNA檢測技術在3 793例HBV感染群體中篩查早期HCC和非HCC患者，結果顯示敏感度為85%、特異度為93%，具有較高的診斷價值。
盡管有研究[9-11]顯示了ctDNA在HBV相關HCC方面的診斷價值，但結果差異很大。因此，筆者對所有符合納入標準的研究進行薈萃分析，以客觀評估ctDNA作為潛在生物學標志物在區分早期HCC與CHB/LC高危個體的能力，以期為技術改進和臨床應用提供循證依據。
1 資料與方法
1.1 文獻來源
1.1.1 入選標準
① 病例組為乙肝病毒性肝細胞癌（hepatitis B viral hepatocellular carcinoma，HBV-HCC）患者，且均經病理或影像學檢查確診，對照組為HBV感染和（或）HBV相關肝臟良性疾病患者；② 從血清或血漿中提取ctDNA；③ 能提取或計算出真陽性、假陽性、假陰性和真陰性的數據用于構建2×2列表；④ 研究樣本量大于20例；⑤ 語言為英文。
1.1.2 排除標準
① 個案報道、綜述、動物實驗或會議報告等文獻；② 無法從原始文獻中提取有效數據；③ 重復發表或無法獲取全文的文獻；④ 樣本來源于肝臟組織、尿液、細胞系或動物。
1.2 檢索策略及文獻質量評價
采用主題詞與自由詞相結合的檢索策略，以 “Circulating Tumor” “ctDNA” “DNA” “hepatocellular carcinoma” “HCC”和“Hepatitis B virus” 作為關鍵詞，檢索PubMed、Embase、Web of Science和Cochrane Library數據庫中關于ctDNA診斷HBV-HCC的隊列研究或病例對照研究，檢索年限為建庫至2021年4月26日，同時輔以手動檢索。嚴格按照流程進行文獻篩選，排除不符合要求的文獻，并標明原因。根據診斷性試驗研究質量評估量表（QUADAS-2）[12]，對所有納入文獻的偏倚風險和外部真實性問題通過4個關鍵指標（病例選擇、待評價實驗、金標準以及流程和進展情況）評估為“低風險”“高風險”和“風險不明確” 。所有研究均由兩位作者獨立評估和評級。意見不統一時經協商解決或由第3名研究者再次評估。以 PubMed 為例，具體檢索策略見框1。
圖k1
1.3 數據收集
由兩位研究者獨立對納入的研究進行數據提取后，共同審查并總結出最終結果。從符合條件的研究中提取以下信息：第一作者姓名、出版年、國家、樣本量、對照類型、樣本來源、實驗方法、DNA類型、敏感度、特異度、真陽性、真陰性、假陽性、假陰性、陽性似然比、陰性似然比和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under curve，AUC）指標。
1.4 統計學方法
本meta分析通過RevMan 5.3和Stata 14.0軟件完成。計算合并的敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷比值比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（95% confidence interval，95%CI）作為評估指標。同時，生成合并的受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線并獲得對應的AUC值，以評估整體檢測的準確性，AUC值越接近1，診斷效能越高。同時繪制Fagan圖以驗證其臨床效能。 閾值效應采用SROC曲線和Spearman相關系數及其P值進行評估，若SROC曲線的散點呈手臂和肩膀樣分布，或當Spearman相關系數呈負值且P<0.05時，表明閾值效應存在；若存在閾值效應，則僅繪制SROC曲線進行匯總分析；若異質性是由非閾值效應引起的，則采用Q檢驗評估研究間異質性。如P≥0.05且I2≤50%，表明各研究結果間統計學異質性較低，采用固定效應模型；若P<0.05且I2>50%，表明各研究間存在明顯異質性，需采用隨機效應模型分析；并進行敏感性分析、meta回歸分析及亞組分析進一步探討異質性來源。最后，繪制Deek’s漏斗圖以檢測潛在的發表偏倚。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 文獻檢索流程
根據文獻檢索策略，本研究共檢索出相關文獻264篇，包括PubMed 55篇，Embase 80篇，Web of Science 99篇，Cochrane Library 30篇。其中有98篇重復文獻，26篇綜述、評價、摘要或動物實驗，71篇研究內容不吻合文獻，29篇文獻研究對象為非乙肝病毒性HCC，24篇文獻無敏感度和特異度等結局指標。最終，有16項研究納入分析（圖1）。
圖1
示文獻檢索流程圖
2.2 納入文獻的基本情況和質量評價
16項研究[8-11, 13-24]的基本情況如表1所示。共納入3 744例患者，其中1 852例為HBV-HCC患者，1 892例為無HCC的HBV患者。總共有12項研究[8, 10-11, 14-17, 19-20, 22-24]采用定性分析，3項研究[9, 13, 21]采用定量分析，1項研究 [18]結合定性和定量分析。此外，11項研究[9-11, 13, 15, 17, 19, 21-24]評估了AFP檢測對HCC的診斷準確性，8項研究[10-11, 15, 17, 19, 22-24]評估了ctDNA聯合AFP檢測在HCC中的診斷效能。根據診斷準確性研究質量評估量表（QUADAS-2）[12]對所有納入研究進行方法學質量評估（表2），除Tao（2020） [18]研究外，其余15篇文獻表現出中-高等質量，表明納入研究的整體質量是穩健的。
表1
納入文獻基本特征
表2
納入研究的文獻質量評價結果
2.3 閾值效應
通過SROC曲線和敏感度對數與（1–特異度）對數之間的Spearman相關系數評估閾值效應。結果表明，SROC曲線的形狀不像手臂和肩膀樣的形狀分布，在16項研究中，Spearman相關系數為0.174（P=0.254），表明不存在閾值效應。
2.4 ctDNA在HBV-HCC患者中的診斷價值
16項研究[8-11, 13-24] 分析了ctDNA在HBV-HCC患者中的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%， P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析。匯總結果顯示：敏感度為0.85 ［95%CI為（0.78，0.90）］、特異度為0.74 ［95%CI為（0.63，0.83）］、陽性似然比為3.29 ［95%CI為（2.30，4.70）］、陰性似然比為0.21 ［95%CI為（0.15，0.28）］、診斷OR為15.98 ［95%CI（10.65，23.99）］和AUC為0.87 ［95%CI為（0.84，0.90）］，見圖2和圖3。該結果提示，ctDNA具有很高的診斷準確性。
圖2
示ctDNA診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖3
示ctDNA診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.5 AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值
在所有納入研究中，有11項研究 [9-11, 13, 15, 17, 19, 21-24]分析了AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%，P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析，其結果顯示：敏感度為0.77 ［95%CI為（0.70，0.83）］、特異度為0.61 ［95%CI為（0.50，0.70）］、陽性似然比為1.95 ［95%CI為（1.53，2.50）］、陰性似然比為0.38 ［95%CI為（0.29，0.50）］、診斷OR為5.12 ［95%CI為（3.22，8.16）］和AUC為0.76 ［95%CI為（0.72，0.80）］，見圖4和圖5。該結果顯示， AFP的診斷準確性低于ctDNA。
圖4
示AFP診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖5
示AFP診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.6 ctDNA聯合AFP在HBV-HCC患者中的診斷價值
共有8項研究 [10-11, 15, 17, 19, 22-24]分析了ctDNA聯合AFP的診斷價值。根據異質性檢驗結果（I2>50%，P<0.05）采用隨機效應模型進行meta分析。其結果顯示：敏感度為0.86 ［95%CI為（0.80，0.90）］、特異度為0.79 ［95%為（0.68，0.87）］、陽性似然比為4.08 ［95%為（2.69，6.18）］、陰性似然比為0.18 ［95%CI（0.13，0.25）］、診斷OR為22.69 ［95%為（13.64，37.76）］和AUC為0.90 ［95%為（0.87，0.92）］，見圖6和圖7。其結果提示：ctDNA聯合AFP能以更高的靈敏度和特異度在CHB/LC高危人群中篩查出肝癌患者。
圖6
示ctDNA聯合AFP診斷價值的敏感度和特異度（a）以及陽性似然比和陰性似然比（b）meta 分析結果
圖7
示ctDNA聯合AFP診斷價值的診斷分數和診斷OR （a）meta 分析結果以及SROC 曲線（b）
2.7 meta回歸分析
本研究使用log OR作為應變量，將地區、樣本量、樣本類型、檢測方式、檢測類型以及文獻質量作為協變量進行meta回歸分析。I2值為81.18%，表明異質性可以用81.18%的殘余變異來解釋；校正決定系數為17.58%，這可以由研究間異質性來解釋。本meta回歸分析結果顯示：研究間的異質性與地區（P=0.973）、樣本量(P=0.544)、樣本類型(P=0.217)、檢測方式(P=0.474)、檢測類型(P=0.656)以及文獻質量(P=0.208)均無相關性，未發現有統計學差異的協變量存在。具體見表3。
表3
ctDNA對HBV-HCC診斷價值的meta回歸分析結果
2.8 亞組分析
根據樣本量、樣本類型和檢測類型進行亞組分析。各亞組分析的合并敏感度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、診斷OR和AUC結果見表4。在HBV-HCC的診斷中，定性分析比定量分析具有更高的診斷價值：敏感度（0.88 比 0.81）、特異度（0.82比 0.61）、陽性似然比（4.91比 2.15）、陰性似然比（0.19比 0.26）、診斷OR（29.8比 8.26）和AUC（0.91比 0.82）。相較于血清，血漿來源樣本的敏感度更高（0.89 比 0.82），但特異度更低（0.72比 0.76）。樣本量≥100研究的診斷準確性略高于樣本量<100的研究，敏感度（0.86 比 0.84）、特異度（0.82比 0.82）和AUC（0.91比 0.90）。
表4
ctDNA對HBV-HCC診斷價值的亞組分析結果
2.9 敏感性分析結果
結果如圖8所示，分別剔除每項研究后均未發現明顯影響結果及異質性的因素。
圖8
敏感性分析結果
2.10 發表偏倚分析結果
ctDNA診斷價值匯總研究的Deek’s檢驗結果為t=0.46，P=0.67（圖9a），AFP診斷價值匯總研究的Deek’s檢驗結果為t=–0.04，P=0.97（圖9b），均未顯示出明顯的發表偏倚。
圖9
示ctDNA（a）和AFP（b）發表偏倚分析結果及ctDNA診斷HBV-HCC的Fagan圖（c）
2.11 ctDNA的診斷效能驗證結果
通過繪制Fagan圖計算驗后概率，如圖9c所示，若經基于ctDNA的液體活檢診斷為HBV-HCC時，確診為HCC的概率為77%；如若為陰性結果，則患有HBV-HCC的概率則為17%。提示ctDNA診斷HBV-HCC具有較高的準確率。
3 討論
在免疫治療新時代下，HCC患者的預后仍不理想，但以外科干預為主的綜合治療取得了一定的成績，早期HCC患者經積極根治性手術或肝移植后5年無復發生存率高達70%， HCC的不良預后和高病死率在很大程度上歸因于其低早期診斷率[13]。現已證實，絕大多數（96.2%） 的HCC患者都存在ctDNA突變[9]。基于ctDNA的液體活檢不僅具有檢測早期HCC的良好前景，更能提供來自所有原發性和轉移性腫瘤的遺傳和表觀遺傳信息并反映腫瘤異質性。為了評估ctDNA作為HBV-HCC循環生物標志物的適用性和準確性，筆者進行了該項meta分析，以提供全面和最新的分析。
本meta分析結果中，ctDNA診斷HBV-HCC的敏感度為0.85 ［95%CI為（0.78，0.90）］，特異度為0.74 ［95%CI為（0.63，0.83）］，在HBV-HCC患者中顯示出令人滿意的診斷效能。 本meta分析結果顯示，用于區分HBV-HCC與CHB感染者的ctDNA檢測的診斷OR為 15.98 ［95%CI為（10.65，23.99）］，其數值高于10，提示ctDNA檢測的診斷價值較高。此外，本meta分析還通過繪制SROC曲線及對應的AUC以評估整體診斷準確性，旨在為臨床使用提供更有意義的參考，其結果顯示：ctDNA診斷HBV-HCC的AUC值為0.87 ［95%CI為（0.84，0.90）］，提示ctDNA達到了高水平的診斷標準[25]。本meta分析結果還顯示，AFP作為HCC診斷最常用的生物標志物，敏感度為0.77 ［95%CI為（0.70，0.83）］、特異度為0.61 ［95%CI為（0.50，0.70）］，AUC為0.76 ［95%CI為（0.72，0.80）］，其診斷效能差強人意。以上結果表明，ctDNA檢測的診斷準確性優于單獨的AFP檢測。此外，ctDNA聯合AFP檢測具有較單獨使用任何一種方法具有更高的準確性，其敏感度為0.86 ［95%CI為（0.80，0.90）］、特異度為0.79 ［95%CI為（0.68，0.87）］、AUC為0.90 ［95%CI為（0.87，0.92）］。亞組分析結果顯示，定性分析比定量分析準確性更高，敏感度、特異度和AUC值分別是0.88、0.82、0.91和0.81、0.61及0.82。這與Chen等[14]的研究結果相一致，他們在HBV背景下ctDNA數量和完整性對HCC診斷價值的研究中發現，ctDNA的質量改變能更好地表征循環中釋放的腫瘤DNA，具有更高的診斷價值（AUC為0.83 比 0.56），而非數量變化。本meta分析結果顯示，與血漿組相比，血清組的敏感度（0.82 比 0.89）和AUC（0.86 比0.88）更低，而血清組的特異度優于血漿組（0.76比0.72），這可能是因為選擇用于檢測的基因位點主要存在于血清中所致。由于從全血中分離DNA過程中的分配不均導致血清中DNA含量更高，且因細胞破裂而釋放的外來DNA水平更低，因此血清可能是更好的ctDNA檢測標本[26]。目前，各研究所選擇的ctDNA檢測位點、技術或方法各具不同，導致敏感度和特異度結果良莠不齊，因此筆者強調液體活檢技術在收集、分離、富集或檢測階段應標準化。此外，在液體活檢中ctDNA的應用存在的局限性仍有待進一步闡明，包括早期腫瘤的ctDNA濃度較低（<1%）、循環DNA與腫瘤DNA的突變譜不完全重疊、有CHB/LC病史的高危人群可能存在某些驅動因子突變進而影響檢測效能、ctDNA釋放入血的機制尚未完全闡明等[8, 27-30]。下一代測序技術的發展極大改善了各類腫瘤遺傳變異的識別[31]。 因此，整合多個HBV相關HCC的特異性突變位點對于確保診斷效能的穩健性至關重要。
本研究進行了meta回歸分析等以探索異質性的潛在來源，就納入分析的協變量而言，未發現任何參數（例如樣本來源、樣本量、對照類型、測定方法和研究質量）有異質性，敏感性分析也未發現明顯影響異質性的研究。因此，異質性可能是由于其他原因引起的，包括ctDNA選擇、入組患者年齡、腫瘤大小、淋巴結浸潤、TNM 分期和手術方案的差異，由于數據部分不足，本研究未能對其進行評估。
本meta分析可能存在一些局限性：首先，雖然進行了系統的文獻檢索，但仍可能存在部分有價值的研究被遺漏和未納入本meta分析；其次，因為僅檢索了英文數據庫，有存在發表偏倚的可能；最后，由于研究數據有限，未能納入腫瘤大小、淋巴結浸潤和腫瘤的TNM分期等協變量進一步探討異質性的來源。
總之，本meta分析結果表明，ctDNA能以較高的敏感度、特異度和準確率診斷HBV-HCC，并且可以作為HBV相關HCC早期診斷中有潛力的循環生物學標志物。血清ctDNA聯合AFP檢測有利于提高HBV-HCC的診斷準確性。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：陳泰安、楊發才和熊永福負責構思與設計研究，統計學處理，撰寫論文；何理和熊永福參與檢索文獻，數據提取；陳泰安和楊發才負責結果的分析與解釋，論文的修改；李敬東負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責和監督管理。
