引用本文： 張維志, 劉連新. 鐵死亡機制在肝細胞癌及其耐藥中的研究現狀與前景. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(5): 694-700. doi: 10.7507/1007-9424.202106100 復制
細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee for Cell Death，NCCD）根據功能將細胞死亡分為兩個獨立的類別：意外細胞死亡（accidental cell death，ACD）和調節性細胞死亡（regulated cell death，RCD）[1]。在生理條件下，RCD也被稱為程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），它涉及多種信號級聯反應，包括凋亡、壞死、自噬等途徑[1]。鐵死亡作為一種新型RCD，近年來受到了越來越多的研究與關注，它是一種鐵離子依賴的脂質過氧化物和脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）聚集介導的死亡方式[2]。
鐵是維持生物體生命的重要微量元素，鐵代謝為鐵被生物體吸收，在生物體內轉運、分布、儲存、利用、轉化及排泄的過程[3]，鐵離子是細胞發生鐵死亡的必要因素之一。轉鐵蛋白（transferrin，Tf）通過與轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）結合將游離鐵運輸到各種組織及細胞中，游離鐵與Tf解離后活化發揮作用，而過剩的細胞內鐵通過鐵轉運蛋白輸出或以Fe3+ 形式儲存在鐵蛋白中，此即鐵代謝的重要生理過程[3]。病理條件下，鐵超載引起不穩定鐵池（labile iron pool，LIP）中Fe2+ 增加，通過芬頓反應以及增強氧自由基生成酶的活性引起ROS累積，進而介導細胞鐵死亡[4]。
作為我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，原發性肝癌嚴重威脅國民的生命和健康，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌，占原發性肝癌的85%～95%，是消化系統常見的惡性腫瘤[5]，它的發生發展受到多種信號通路和細胞因子的調控[6]。 誘導鐵死亡在HCC的治療中具有重要意義，鐵死亡能夠調控惡性腫瘤生長，在惡性腫瘤治療中顯示出了巨大的優勢。筆者現就鐵死亡在HCC中的研究現狀與前景進行綜述，旨在進一步探索鐵死亡在HCC中的作用機制，以期為改善其預后提供新的思路。
1 鐵死亡在HCC發生發展中的機制
2012年Dixon等[2]首次發現并報道愛拉斯汀（erastin）可以通過抑制谷氨酸/胱氨酸逆向轉運體（glutamate/cystine antiporter system，System Xc–）導致谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，Gpx4）失活和脂質過氧化物聚集進而誘導細胞鐵死亡，并指出這種新型的細胞死亡方式和其他已知的任何死亡模式（凋亡[7]、壞死[7-8]、自噬[9]）都不同，具有其獨特的形態學、生物化學及遺傳學特征：① 形態學上鐵死亡表現為線粒體皺縮、線粒體嵴的消失和線粒體膜破裂；② 生物化學方面表現為細胞內谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量下降，Gpx4活性降低，細胞內的脂質過氧化物不能被清除而逐漸積累，從而導致鐵死亡的發生；③ 遺傳學上表現為某些鐵死亡特異性基因的突變，如核糖體蛋白L8（ribosomal protein L8，RPL8）基因、鐵反應元件結合蛋白2（iron-responsive element binding protein 2，IREB2）基因、 編碼ATP合酶亞基核基因的ATP5G3基因等。鑒于該死亡模式是一種由不飽和脂肪酸過氧化介導的鐵依賴的RCD，且可以被特異性抑制劑鐵抑制素-1 （ferrostatin-1，Fer-1）[10]所阻斷，因此Dixon依據該死亡特征將其命名為鐵死亡。HCC是全球常見的惡性腫瘤，大部分患者在確診時已屬中晚期，手術切除率低，系統治療耐藥率較高，亟需尋求改善HCC耐藥的方式和新的生物治療靶點。 目前有越來越多關于鐵死亡在HCC中的機制及信號通路研究，以下將針對鐵死亡在HCC發生發展中的機制作重點闡述。
1.1 調控蛋白
視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白失活是HCC發生過程中的一個重要事件。有研究[11]發現，在索拉非尼的作用下Rb蛋白表達明顯下降，進而使得HCC 細胞死亡增加了2～3倍，此時細胞內線粒體ROS 高表達并繼發鐵死亡，提示可能通過抑制Rb蛋白的功能誘導HCC細胞的鐵死亡。這可能是索拉非尼誘導鐵死亡的主要原因，但Rb蛋白在HCC細胞鐵死亡中的具體機制還有待于進一步探索。Sigma-1受體（Sigma-1 receptors，S1Rs）是一種非阿片類蛋白，除了中樞神經系統外，在肝臟、胰腺和腫瘤細胞中也發現了S1Rs[12]。研究[13]表明，S1Rs可以通過活化抗氧化反應元件，減少細胞內氧化型GSH水平，抑制許多器官中ROS的產生。Bai等[14]研究證實，S1Rs可以保護HCC細胞使其不受索拉非尼及其誘導的鐵死亡作用，這對更好地理解S1Rs在HCC細胞鐵死亡中所扮演的角色具有重要意義。多聚胞嘧啶結合蛋白1（poly C binding protein 1，PCBP1）作為一種胞質鐵伴侶蛋白，對細胞內鐵的分布具有重要作用[15]。研究[16]發現，PCBP1通過調節肝臟中的鐵存在形態來影響肝臟氧化應激的發生發展，PCBP1缺失增加了ROS的產生進而介導鐵死亡。因此該蛋白可能是抑制脂質過氧化和鐵死亡途徑的關鍵因子，有望成為影響HCC發生發展的新靶點。在生物膜中還有發揮重要作用的蛋白家族—ATP結合盒式轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC transporter），它們在HCC細胞的鐵死亡中也發揮了重要作用。Zhang等[17]通過富集分析發現ABC轉運子B亞族成員6（ABC transporter subfamily B member 6，ABCB6）在HCC細胞中高表達，這與HCC的不良預后有關，進一步分析表明ABCB6通過輸出細胞內的含鐵卟啉，減少細胞內鐵含量進而抑制HCC細胞的鐵死亡，并調節HCC 的耐藥和預后，這對我們了解ABCB6在HCC中的作用提供了新見解。
Yuan等[18]發現，CDGSH鐵硫結構域1 (CDGSH iron-sulfur domain 1，CISD1)是一種含鐵的線粒體外膜鐵硫蛋白，參與鐵死亡的負調控，它可以抑制HCC細胞中線粒體的鐵攝取進而抑制脂質過氧化和隨后的鐵死亡。這提示CISD1在HCC的鐵代謝中發揮了巨大作用，通過抑制CISD1的表達可以影響線粒體的鐵穩態，導致鐵離子及ROS堆積和細胞的鐵死亡并最終影響HCC的進展。綜上所述，CISD1可以減少HCC細胞中的線粒體損傷，負向調節鐵死亡并促進HCC的進展。在未來可以通過靶向抑制CISD1的表達，誘導細胞的鐵死亡，進而抑制HCC的發生發展。
胱硫醚β-合成酶（cystathionine-β-synthetase，CBS）是轉硫途徑中的關鍵酶，抑制CBS會影響細胞內Gpx4的表達而誘發HCC細胞的鐵死亡[19]，這為我們探索轉硫途徑在HCC細胞鐵死亡中的作用提供了線索。核糖核苷酸還原酶亞單位M2（ribonucleotide reductase subunit M2，RRM2）可以通過維持細胞內GSH的合成在HCC細胞中扮演對抗鐵死亡的重要角色，并可以作為HCC診斷和治療的重要標志物和靶點[20]。Wang等[21]發現，RNA結合蛋白無精癥缺失相關蛋白1（deleted in azoospermia-associated protein 1，DAZAP1）可以抑制System Xc– 的重要組分溶質載體家族7成員11（solute carrier family7 member11，SLC7A11）的表達，進而促進HCC的進展。DAZAP1這一新功能的闡述將有助于探索靶向鐵死亡治療HCC的新靶點。另外，細胞內還存在多種調節鐵死亡的轉錄因子例如肝細胞核因子4A（hepatocyte nuclear factor 4A，HNF4A）、腫瘤高甲基化基因1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）等，它們在HCC的鐵死亡中也發揮了巨大作用，這在基因層面上為我們研究鐵死亡與HCC的關系提供了方向[22]。
1.2 小分子化合物及新型化合物
Bai等[23]發現氟哌啶醇可以促進索拉非尼誘導的鐵死亡，即使上述兩種藥物的劑量相對較低。這表明氟哌啶醇可能通過增強索拉非尼對HCC患者的療效來發揮作用，此外它還可以減少索拉非尼的應用劑量，這一發現為聯合用藥治療HCC提供了一種新的策略。
研究[24]發現，聯合低密度脂蛋白和天然ω- ３多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸的納米復合物（low-density lipoprotein- docosahexaenoic acid，LDL-DHA），可以選擇性地殺死HCC細胞，抑制大鼠原位肝腫瘤的生長。Ou等[24]提出LDL-DHA通過鐵死亡途徑誘導HCC細胞死亡，這代表了LDL-DHA納米顆粒抗腫瘤活性的一種新的分子機制，也為未來HCC治療提供了新的靶點。Tang等[25]構建了負載索拉非尼的錳摻雜二氧化硅納米顆粒（sorafenib loaded manganese doped mesoporous silica nanoparticles，MMSNs@SO），通過消耗細胞內的GSH破壞細胞的氧化還原穩態，結果證明該納米顆粒具有雙重消耗細胞內GSH的作用（MMSNs的降解會消耗細胞內的GSH，而索拉非尼會通過抑制System Xc– 抑制GSH合成）。這種雙重消耗GSH的納米藥物在誘導HCC細胞鐵死亡中具有巨大的應用潛力，這種GSH饑餓治療策略將導致多途徑的PCD，是一種很有前途的腫瘤治療策略。
1.3 非編碼RNA
既往關于長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在鐵死亡中的作用及機制研究比較少。Qi等[26]提出了erastin通過調節lncRNA的作用誘導HepG2肝癌細胞鐵死亡的機制，研究表明erastin可以上調HepG2細胞中lncRNA GA結合蛋白轉錄因子B1-反義RNA1（GA binding protein transcription factor B1-antisense RNA1，GABPB1-AS1）的水平，進而減少GABPB1蛋白表達并進一步降低了peroxiredoxin-5（PRDX5）過氧化物酶的水平，導致細胞的抗氧化能力下降。lncRNA GABPB1-AS1可以顯著改善HCC的預后，說明了lncRNA在HCC鐵死亡中的重要作用，提示其未來有望成為HCC治療的新靶點。
微小RNA（microRNA，miR）是一類小的非編碼RNA分子，可以調節轉錄后基因的表達。既往關于miR-214的研究多集中在其調節HCC血管生成中的作用[27]。Bai等[28]研究表明，miR-214在HCC細胞中具有調節鐵死亡的作用。miR-214過表達增加了erastin暴露的腫瘤細胞中丙二醛和脂質ROS水平，上調了Fe2+ 濃度并降低了GSH水平，進而導致鐵死亡。miR-214的作用可以歸因于其對轉錄活化因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的抑制，這可能為HCC的治療提供了一個新的靶點。此外，研究[29]發現HCC中miR-148a的低表達可能會提高細胞攝取鐵的能力，增加細胞內高速代謝所需的鐵水平并刺激細胞增殖，而高濃度的鐵正是誘導細胞鐵死亡所必需的，這為我們通過鐵死亡抑制HCC提供了新的依據。Xu等[30]研究發現，在體內環狀白介素4受體（circinterleukin-4 receptor，CircIL4R）通過miR-541-3p/Gpx4網絡在HCC中發揮促癌作用，進一步的機制研究表明CircIL4R可以通過抑制miR-541-3p上調Gpx4的表達，同時Gpx4的表達上調也減輕了miR-541-3p誘導的鐵死亡和腫瘤抑制。CircIL4R在HCC中起到腫瘤啟動子和鐵死亡抑制劑的作用，這為包括HCC的治療提供了新思路。
1.4 經典信號通路
1.4.1 p53信號通路
p53基因是一種眾所周知的抑癌基因，能調節細胞的生長、分化、凋亡等過程。研究[31]表明，p53基因可以通過抑制SLC7A11的表達，抑制細胞內Gpx4活性，進而誘導細胞鐵死亡。此外p53基因還可以增加精脒/精胺N1-乙酰基轉移酶1（spermine N1-acetyl transferase，SAT1）基因的表達[32]，促進二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP4）[33]的表達，加劇細胞內脂質過氧化反應，進而導致鐵死亡。有研究[34]表明，HCC中Ser47位突變的p53蛋白失去了Ser46位的磷酸化能力，進而抑制了HCC的鐵死亡作用。綜上，p53基因可以通過多種機制抑制HCC細胞增殖，而突變的p53基因可以抑制HCC細胞的鐵死亡，促進HCC的發生發展。
1.4.2 p62-Keich樣環氧氯丙烷相關蛋白-1-核因子紅細胞相關因子2（p62-Kelch like epichlorohydrin associated protein-1-nuclear factor erythroid 2-related factor，p62-Keap1-Nrf2）信號通路
眾所周知，Nrf2是抗氧化反應的關鍵調節因子，Nrf2過表達可抑制細胞凋亡，并且可能導致腫瘤的化療耐藥。研究[35]發現，p62-Keap1-Nrf2 信號通路在保護HCC細胞對抗鐵死亡中起著核心作用。Sun等[35] 在體外細胞實驗中發現，暴露于erastin和索拉非尼后，p62的表達滅活了Keap1，進而避免了Nrf2的降解并增強了其隨后的核聚集。入核的Nrf2進一步激活血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶1（transcription of quinone oxidoreductase 1，NQO1）、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain1，FTH1）等，抑制細胞鐵超載和脂質過氧化，介導HCC細胞對抗鐵死亡。通過RNA干擾敲除p62、NQO1、HO-1和FTH1可以促進erastin誘導的鐵死亡。綜上，p62-Keap1-Nrf2信號通路主要通過調節細胞內的鐵代謝和ROS代謝，進而調控細胞的鐵死亡和HCC的發生發展。
2 鐵死亡在HCC耐藥中的研究
最近幾十年腫瘤治療領域出現了許多新的突破，人們研究出許多新的策略來對抗腫瘤，比如靶向治療、免疫治療等。即便如此，耐藥仍是腫瘤治療中的重大挑戰，無論是先天的還是后天形成的耐藥，其都與各種細胞與分子機制的改變有關，這些變化的累積為耐藥細胞提供了比藥敏細胞更大的生存優勢，從而導致耐藥腫瘤的形成[36]。深入探索鐵死亡在HCC耐藥中的作用機制對改善耐藥具有重要意義。
2.1 化學治療耐藥
2.1.1 腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）
HCC中CSCs的產生是腫瘤耐藥的重要原因，它們是腫瘤內部具有干細胞特性的一類細胞，在化學治療耐藥、腫瘤復發和侵襲中起著關鍵作用[37]。目前關于CSCs耐藥機制的研究主要集中在其特殊的微環境、藥物外排泵和醛脫氫酶的作用以及細胞內信號通路的調節[38]。近年的研究[39-40]表明，鐵死亡可以選擇性靶向腫瘤中的CSCs，這意味著鐵死亡可以被用來誘導CSCs死亡并改善HCC的耐藥。由于CSCs特有的代謝和信號通路，鐵死亡對其具有明顯的有效性和選擇性，在腫瘤治療和化療耐藥中具有重要作用。
2.1.2 存留細胞（persister cells）
存留細胞是經過幾輪化學治療藥物治療后存活下來的腫瘤細胞，這是一種治療性耐藥細胞狀態[41]，靶向存留細胞是改善HCC耐藥的重要策略。研究發現，存留細胞內的GSH、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和Nrf2水平顯著降低，對脂質過氧化具有很強的敏感性[42]。進一步研究[43]發現，存留細胞的生存嚴重依賴于Gpx4，下調Gpx4水平可以選擇性誘導存留細胞的鐵死亡。越來越多的證據表明，Gpx4抑制劑通過鐵死亡對存留細胞具有特異性致死作用，因此誘導鐵死亡可能是克服這些細胞耐藥的有效途徑。
2.2 索拉非尼耐藥
索拉非尼是第1個被批準用于不適合手術切除晚期HCC患者的全身治療方案，在2項針對晚期HCC患者的隨機Ⅲ期臨床試驗中，索拉非尼與安慰劑組相比延緩了腫瘤進展，分別延長了2.8個月和2.3個月生存期[44]。索拉非尼有限的生存獲益表明HCC細胞中存在原發性和獲得性索拉非尼耐藥機制。此外，金屬硫蛋白-1G（metallothionein-1G，MT-1G）可能是介導HCC中索拉非尼耐藥的關鍵蛋白，抑制MT-1G可以增加細胞內GSH的消耗和脂質過氧化，改善索拉非尼耐藥[44]。有報道[45-46]稱索拉非尼具有強效的鐵死亡誘導作用而非細胞凋亡的誘導劑，索拉非尼可以誘導HCC細胞的鐵死亡，這種鐵死亡是索拉非尼特有的，與其激酶抑制活性無關。綜上，我們可以通過增強鐵死亡來改善索拉非尼耐藥，如Rb、S1Rs、MT-1G和Nrf2可以抑制索拉非尼誘導的鐵死亡，通過靶向抑制上述的調節因子可以顯著改善索拉非尼的耐藥，這為未來改善索拉非尼耐藥提供了一個很有前景的策略。
3 鐵死亡在HCC研究中的前景
近年來，鐵死亡在多種疾病中的臨床意義已經逐漸顯現，尤其在腫瘤的治療中具有很大的應用潛力。隨著鐵死亡在HCC中機制研究的不斷深入，鐵死亡在HCC的治療中具有廣闊的前景。
3.1 改善耐藥
研究[42-46]證實通過增強鐵死亡可以明顯改善索拉非尼及化學治療耐藥。這是未來改善耐藥的一個有前景的靶點，有望使晚期HCC患者的預后得到有效改善；而且有研究[42-43, 47]發現鐵死亡可能更適用于那些對化學治療、放射治療等治療不太敏感的腫瘤細胞。然而絕大多數關于鐵死亡改善HCC耐藥的研究仍然處于體外細胞水平，其效果仍需要未來更多的臨床試驗來證明。
3.2 新藥研發
最近有研究[48]發現了一些高效鐵死亡誘導劑，例如中藥成分的重樓皂苷可以通過誘導鐵死亡來發揮其對抗HCC的活性，這對我們理解中藥抗腫瘤活性的機制，更好地治療HCC以及多種腫瘤具有深遠意義。考慮到Gpx4抑制劑治療耐藥腫瘤的效果，開發出具有更優藥代動力學的Gpx4靶向藥物將是一個有前景的方向。在這方面，納米醫學[49]有機會開發出更有效更有針對性的鐵死亡靶向藥物，從而更好地治療腫瘤，并提高藥物安全性，降低全身毒性。
3.3 聯合治療
研究[23]表明，氟哌啶醇可促進索拉非尼誘導的鐵死亡，這為HCC的聯合用藥治療提供了一個良好的策略。 Lippmann等[50]發現，聯合應用金諾芬/丁硫氨酸亞砜胺或丁硫氨酸亞砜胺/erastin可以顯著下調Gpx4水平，更有效地誘導鐵死亡并能顯著克服HCC的化學治療耐藥。此外，誘導鐵死亡聯合化學治療可明顯改善化學治療耐藥，提高化學治療藥物的療效，這也是未來改善腫瘤耐藥的一個有前景的策略。Wang等[51]發現，腫瘤的免疫治療效果也與鐵死亡有關，T細胞促進腫瘤鐵死亡作用是一種新的抗腫瘤機制，這提示靶向鐵死亡并結合免疫檢查點抑制劑是未來腫瘤治療的潛在方向。但HCC的免疫治療尚處于起步階段，誘導鐵死亡聯合免疫治療的機制與效果有待進一步的試驗來證實。
3.4 腫瘤分型
有研究[52]根據鐵死亡基因表達和甲基化情況，將HCC的鐵死亡分為兩種不同的表型，即鐵死亡-Ｈ和鐵死亡-Ｌ，兩種表型具有不同的預后和臨床病理特征，統計學分析顯示鐵死亡-Ｈ組的HCC患者通常腫瘤分化低、T分期高、血管侵犯發生率高、血清甲胎蛋白水平更高，預示著鐵死亡-Ｈ 組更差的預后。這一分型對預測HCC患者的預后，識別高危HCC患者具有重要意義。Liu等[53]基于32個數據集中的3 933個HCC樣本和74個鐵死亡相關基因全面探索了不同的鐵死亡亞型：C1為低代謝、高免疫力亞型；C2為高代謝、低免疫力亞型；不同亞型的臨床意義、功能狀態、免疫浸潤及逃逸機制和基因組改變都不甚相同，與C2相比，C1亞型的預后更差，且多發生在年輕、女性、腫瘤級別高并存在血管侵犯的患者當中；此外，該研究還構建并驗證了一個穩健而有潛力的系統—鐵死亡相關風險評分（ferroptosis related risk score，FRRS）系統，其可以用于評估預后及免疫治療風險，幫助我們更好地理解鐵死亡，以及應用鐵死亡對HCC進行精準管理與治療。
3.5 預后預測
Liang等[54]發現，大部分鐵死亡相關基因在HCC及鄰近的正常組織中存在差異表達，從中挑選與總生存期相關的10個基因組成的標志物構建了HCC的風險分層系統，與低風險組相比高風險組的生存期顯著縮短，顯示出良好的預后預測能力。Deng等[52]構建并驗證了一個由15個基因組成的鐵死亡相關HCC預后模型，顯示出準確的風險分層能力。Du等[55]通過生物信息學分析尋找與免疫和鐵死亡相關的生物學標志物，以期改善HCC的治療和預后，最終從眾多差異表達基因中篩選了5個免疫相關和2個鐵死亡相關基因：熱休克蛋白A4（heat shock protein A4，HSPA4）、干擾素刺激核酸外切酶基因20L2（interferon stimulated exonuclease gene 20 like 2，ISG20L2）、神經母細胞瘤大鼠肉瘤（neuroblastoma rat sarcoma，NRAS）、白細胞介素17D（interleukin 17D，IL-17D）、N-Myc下游調節基因1（N-Myc downstream regulated gene 1，NDRG1）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD），并經多因素Cox比例風險回歸建立腫瘤預后預測模型，其功能富集分析發現7個生物學標志物主要與HCC相關的核分裂、細胞周期等生物過程相關，且2種風險群體的免疫狀態不同；除了傳統的臨床病理因素外，上述7個免疫及鐵死亡相關生物標志物可能在預測HCC的預后方面具有重要臨床價值，同時也為我們更好地理解HCC的分子機制提供了新見解。
4 小結
鐵死亡是由脂質過氧化物和脂質ROS蓄積介導的一種新型RCD方式，涉及十分復雜的病理生理調控機制，在多種疾病尤其是腫瘤中具有重要意義，誘導鐵死亡可以和化學治療藥物以及索拉非尼發揮協同抗腫瘤作用。然而，鐵死亡領域還有許多的未知值得我們進一步探索，比如鐵死亡在HCC發生發展中的具體作用機制、鐵死亡在索拉非尼和化學治療耐藥中的關鍵作用機制以及HCC中鐵死亡與其他RCD之間的內在聯系。 深入研究鐵死亡的分子機制及相關信號通路，調節腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性，改善藥物耐藥，探索其在HCC和多種惡性腫瘤中的作用新靶點具有重要的意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張維志直接參與資料的收集及文章的撰寫；劉連新對文章的知識性內容作出了批判性的審閱并給予指導性意見。
細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee for Cell Death，NCCD）根據功能將細胞死亡分為兩個獨立的類別：意外細胞死亡（accidental cell death，ACD）和調節性細胞死亡（regulated cell death，RCD）[1]。在生理條件下，RCD也被稱為程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），它涉及多種信號級聯反應，包括凋亡、壞死、自噬等途徑[1]。鐵死亡作為一種新型RCD，近年來受到了越來越多的研究與關注，它是一種鐵離子依賴的脂質過氧化物和脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）聚集介導的死亡方式[2]。
鐵是維持生物體生命的重要微量元素，鐵代謝為鐵被生物體吸收，在生物體內轉運、分布、儲存、利用、轉化及排泄的過程[3]，鐵離子是細胞發生鐵死亡的必要因素之一。轉鐵蛋白（transferrin，Tf）通過與轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）結合將游離鐵運輸到各種組織及細胞中，游離鐵與Tf解離后活化發揮作用，而過剩的細胞內鐵通過鐵轉運蛋白輸出或以Fe3+ 形式儲存在鐵蛋白中，此即鐵代謝的重要生理過程[3]。病理條件下，鐵超載引起不穩定鐵池（labile iron pool，LIP）中Fe2+ 增加，通過芬頓反應以及增強氧自由基生成酶的活性引起ROS累積，進而介導細胞鐵死亡[4]。
作為我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，原發性肝癌嚴重威脅國民的生命和健康，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌，占原發性肝癌的85%～95%，是消化系統常見的惡性腫瘤[5]，它的發生發展受到多種信號通路和細胞因子的調控[6]。 誘導鐵死亡在HCC的治療中具有重要意義，鐵死亡能夠調控惡性腫瘤生長，在惡性腫瘤治療中顯示出了巨大的優勢。筆者現就鐵死亡在HCC中的研究現狀與前景進行綜述，旨在進一步探索鐵死亡在HCC中的作用機制，以期為改善其預后提供新的思路。
1 鐵死亡在HCC發生發展中的機制
2012年Dixon等[2]首次發現并報道愛拉斯汀（erastin）可以通過抑制谷氨酸/胱氨酸逆向轉運體（glutamate/cystine antiporter system，System Xc–）導致谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，Gpx4）失活和脂質過氧化物聚集進而誘導細胞鐵死亡，并指出這種新型的細胞死亡方式和其他已知的任何死亡模式（凋亡[7]、壞死[7-8]、自噬[9]）都不同，具有其獨特的形態學、生物化學及遺傳學特征：① 形態學上鐵死亡表現為線粒體皺縮、線粒體嵴的消失和線粒體膜破裂；② 生物化學方面表現為細胞內谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量下降，Gpx4活性降低，細胞內的脂質過氧化物不能被清除而逐漸積累，從而導致鐵死亡的發生；③ 遺傳學上表現為某些鐵死亡特異性基因的突變，如核糖體蛋白L8（ribosomal protein L8，RPL8）基因、鐵反應元件結合蛋白2（iron-responsive element binding protein 2，IREB2）基因、 編碼ATP合酶亞基核基因的ATP5G3基因等。鑒于該死亡模式是一種由不飽和脂肪酸過氧化介導的鐵依賴的RCD，且可以被特異性抑制劑鐵抑制素-1 （ferrostatin-1，Fer-1）[10]所阻斷，因此Dixon依據該死亡特征將其命名為鐵死亡。HCC是全球常見的惡性腫瘤，大部分患者在確診時已屬中晚期，手術切除率低，系統治療耐藥率較高，亟需尋求改善HCC耐藥的方式和新的生物治療靶點。 目前有越來越多關于鐵死亡在HCC中的機制及信號通路研究，以下將針對鐵死亡在HCC發生發展中的機制作重點闡述。
1.1 調控蛋白
視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白失活是HCC發生過程中的一個重要事件。有研究[11]發現，在索拉非尼的作用下Rb蛋白表達明顯下降，進而使得HCC 細胞死亡增加了2～3倍，此時細胞內線粒體ROS 高表達并繼發鐵死亡，提示可能通過抑制Rb蛋白的功能誘導HCC細胞的鐵死亡。這可能是索拉非尼誘導鐵死亡的主要原因，但Rb蛋白在HCC細胞鐵死亡中的具體機制還有待于進一步探索。Sigma-1受體（Sigma-1 receptors，S1Rs）是一種非阿片類蛋白，除了中樞神經系統外，在肝臟、胰腺和腫瘤細胞中也發現了S1Rs[12]。研究[13]表明，S1Rs可以通過活化抗氧化反應元件，減少細胞內氧化型GSH水平，抑制許多器官中ROS的產生。Bai等[14]研究證實，S1Rs可以保護HCC細胞使其不受索拉非尼及其誘導的鐵死亡作用，這對更好地理解S1Rs在HCC細胞鐵死亡中所扮演的角色具有重要意義。多聚胞嘧啶結合蛋白1（poly C binding protein 1，PCBP1）作為一種胞質鐵伴侶蛋白，對細胞內鐵的分布具有重要作用[15]。研究[16]發現，PCBP1通過調節肝臟中的鐵存在形態來影響肝臟氧化應激的發生發展，PCBP1缺失增加了ROS的產生進而介導鐵死亡。因此該蛋白可能是抑制脂質過氧化和鐵死亡途徑的關鍵因子，有望成為影響HCC發生發展的新靶點。在生物膜中還有發揮重要作用的蛋白家族—ATP結合盒式轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC transporter），它們在HCC細胞的鐵死亡中也發揮了重要作用。Zhang等[17]通過富集分析發現ABC轉運子B亞族成員6（ABC transporter subfamily B member 6，ABCB6）在HCC細胞中高表達，這與HCC的不良預后有關，進一步分析表明ABCB6通過輸出細胞內的含鐵卟啉，減少細胞內鐵含量進而抑制HCC細胞的鐵死亡，并調節HCC 的耐藥和預后，這對我們了解ABCB6在HCC中的作用提供了新見解。
Yuan等[18]發現，CDGSH鐵硫結構域1 (CDGSH iron-sulfur domain 1，CISD1)是一種含鐵的線粒體外膜鐵硫蛋白，參與鐵死亡的負調控，它可以抑制HCC細胞中線粒體的鐵攝取進而抑制脂質過氧化和隨后的鐵死亡。這提示CISD1在HCC的鐵代謝中發揮了巨大作用，通過抑制CISD1的表達可以影響線粒體的鐵穩態，導致鐵離子及ROS堆積和細胞的鐵死亡并最終影響HCC的進展。綜上所述，CISD1可以減少HCC細胞中的線粒體損傷，負向調節鐵死亡并促進HCC的進展。在未來可以通過靶向抑制CISD1的表達，誘導細胞的鐵死亡，進而抑制HCC的發生發展。
胱硫醚β-合成酶（cystathionine-β-synthetase，CBS）是轉硫途徑中的關鍵酶，抑制CBS會影響細胞內Gpx4的表達而誘發HCC細胞的鐵死亡[19]，這為我們探索轉硫途徑在HCC細胞鐵死亡中的作用提供了線索。核糖核苷酸還原酶亞單位M2（ribonucleotide reductase subunit M2，RRM2）可以通過維持細胞內GSH的合成在HCC細胞中扮演對抗鐵死亡的重要角色，并可以作為HCC診斷和治療的重要標志物和靶點[20]。Wang等[21]發現，RNA結合蛋白無精癥缺失相關蛋白1（deleted in azoospermia-associated protein 1，DAZAP1）可以抑制System Xc– 的重要組分溶質載體家族7成員11（solute carrier family7 member11，SLC7A11）的表達，進而促進HCC的進展。DAZAP1這一新功能的闡述將有助于探索靶向鐵死亡治療HCC的新靶點。另外，細胞內還存在多種調節鐵死亡的轉錄因子例如肝細胞核因子4A（hepatocyte nuclear factor 4A，HNF4A）、腫瘤高甲基化基因1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）等，它們在HCC的鐵死亡中也發揮了巨大作用，這在基因層面上為我們研究鐵死亡與HCC的關系提供了方向[22]。
1.2 小分子化合物及新型化合物
Bai等[23]發現氟哌啶醇可以促進索拉非尼誘導的鐵死亡，即使上述兩種藥物的劑量相對較低。這表明氟哌啶醇可能通過增強索拉非尼對HCC患者的療效來發揮作用，此外它還可以減少索拉非尼的應用劑量，這一發現為聯合用藥治療HCC提供了一種新的策略。
研究[24]發現，聯合低密度脂蛋白和天然ω- ３多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸的納米復合物（low-density lipoprotein- docosahexaenoic acid，LDL-DHA），可以選擇性地殺死HCC細胞，抑制大鼠原位肝腫瘤的生長。Ou等[24]提出LDL-DHA通過鐵死亡途徑誘導HCC細胞死亡，這代表了LDL-DHA納米顆粒抗腫瘤活性的一種新的分子機制，也為未來HCC治療提供了新的靶點。Tang等[25]構建了負載索拉非尼的錳摻雜二氧化硅納米顆粒（sorafenib loaded manganese doped mesoporous silica nanoparticles，MMSNs@SO），通過消耗細胞內的GSH破壞細胞的氧化還原穩態，結果證明該納米顆粒具有雙重消耗細胞內GSH的作用（MMSNs的降解會消耗細胞內的GSH，而索拉非尼會通過抑制System Xc– 抑制GSH合成）。這種雙重消耗GSH的納米藥物在誘導HCC細胞鐵死亡中具有巨大的應用潛力，這種GSH饑餓治療策略將導致多途徑的PCD，是一種很有前途的腫瘤治療策略。
1.3 非編碼RNA
既往關于長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在鐵死亡中的作用及機制研究比較少。Qi等[26]提出了erastin通過調節lncRNA的作用誘導HepG2肝癌細胞鐵死亡的機制，研究表明erastin可以上調HepG2細胞中lncRNA GA結合蛋白轉錄因子B1-反義RNA1（GA binding protein transcription factor B1-antisense RNA1，GABPB1-AS1）的水平，進而減少GABPB1蛋白表達并進一步降低了peroxiredoxin-5（PRDX5）過氧化物酶的水平，導致細胞的抗氧化能力下降。lncRNA GABPB1-AS1可以顯著改善HCC的預后，說明了lncRNA在HCC鐵死亡中的重要作用，提示其未來有望成為HCC治療的新靶點。
微小RNA（microRNA，miR）是一類小的非編碼RNA分子，可以調節轉錄后基因的表達。既往關于miR-214的研究多集中在其調節HCC血管生成中的作用[27]。Bai等[28]研究表明，miR-214在HCC細胞中具有調節鐵死亡的作用。miR-214過表達增加了erastin暴露的腫瘤細胞中丙二醛和脂質ROS水平，上調了Fe2+ 濃度并降低了GSH水平，進而導致鐵死亡。miR-214的作用可以歸因于其對轉錄活化因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的抑制，這可能為HCC的治療提供了一個新的靶點。此外，研究[29]發現HCC中miR-148a的低表達可能會提高細胞攝取鐵的能力，增加細胞內高速代謝所需的鐵水平并刺激細胞增殖，而高濃度的鐵正是誘導細胞鐵死亡所必需的，這為我們通過鐵死亡抑制HCC提供了新的依據。Xu等[30]研究發現，在體內環狀白介素4受體（circinterleukin-4 receptor，CircIL4R）通過miR-541-3p/Gpx4網絡在HCC中發揮促癌作用，進一步的機制研究表明CircIL4R可以通過抑制miR-541-3p上調Gpx4的表達，同時Gpx4的表達上調也減輕了miR-541-3p誘導的鐵死亡和腫瘤抑制。CircIL4R在HCC中起到腫瘤啟動子和鐵死亡抑制劑的作用，這為包括HCC的治療提供了新思路。
1.4 經典信號通路
1.4.1 p53信號通路
p53基因是一種眾所周知的抑癌基因，能調節細胞的生長、分化、凋亡等過程。研究[31]表明，p53基因可以通過抑制SLC7A11的表達，抑制細胞內Gpx4活性，進而誘導細胞鐵死亡。此外p53基因還可以增加精脒/精胺N1-乙酰基轉移酶1（spermine N1-acetyl transferase，SAT1）基因的表達[32]，促進二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP4）[33]的表達，加劇細胞內脂質過氧化反應，進而導致鐵死亡。有研究[34]表明，HCC中Ser47位突變的p53蛋白失去了Ser46位的磷酸化能力，進而抑制了HCC的鐵死亡作用。綜上，p53基因可以通過多種機制抑制HCC細胞增殖，而突變的p53基因可以抑制HCC細胞的鐵死亡，促進HCC的發生發展。
1.4.2 p62-Keich樣環氧氯丙烷相關蛋白-1-核因子紅細胞相關因子2（p62-Kelch like epichlorohydrin associated protein-1-nuclear factor erythroid 2-related factor，p62-Keap1-Nrf2）信號通路
眾所周知，Nrf2是抗氧化反應的關鍵調節因子，Nrf2過表達可抑制細胞凋亡，并且可能導致腫瘤的化療耐藥。研究[35]發現，p62-Keap1-Nrf2 信號通路在保護HCC細胞對抗鐵死亡中起著核心作用。Sun等[35] 在體外細胞實驗中發現，暴露于erastin和索拉非尼后，p62的表達滅活了Keap1，進而避免了Nrf2的降解并增強了其隨后的核聚集。入核的Nrf2進一步激活血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶1（transcription of quinone oxidoreductase 1，NQO1）、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain1，FTH1）等，抑制細胞鐵超載和脂質過氧化，介導HCC細胞對抗鐵死亡。通過RNA干擾敲除p62、NQO1、HO-1和FTH1可以促進erastin誘導的鐵死亡。綜上，p62-Keap1-Nrf2信號通路主要通過調節細胞內的鐵代謝和ROS代謝，進而調控細胞的鐵死亡和HCC的發生發展。
2 鐵死亡在HCC耐藥中的研究
最近幾十年腫瘤治療領域出現了許多新的突破，人們研究出許多新的策略來對抗腫瘤，比如靶向治療、免疫治療等。即便如此，耐藥仍是腫瘤治療中的重大挑戰，無論是先天的還是后天形成的耐藥，其都與各種細胞與分子機制的改變有關，這些變化的累積為耐藥細胞提供了比藥敏細胞更大的生存優勢，從而導致耐藥腫瘤的形成[36]。深入探索鐵死亡在HCC耐藥中的作用機制對改善耐藥具有重要意義。
2.1 化學治療耐藥
2.1.1 腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）
HCC中CSCs的產生是腫瘤耐藥的重要原因，它們是腫瘤內部具有干細胞特性的一類細胞，在化學治療耐藥、腫瘤復發和侵襲中起著關鍵作用[37]。目前關于CSCs耐藥機制的研究主要集中在其特殊的微環境、藥物外排泵和醛脫氫酶的作用以及細胞內信號通路的調節[38]。近年的研究[39-40]表明，鐵死亡可以選擇性靶向腫瘤中的CSCs，這意味著鐵死亡可以被用來誘導CSCs死亡并改善HCC的耐藥。由于CSCs特有的代謝和信號通路，鐵死亡對其具有明顯的有效性和選擇性，在腫瘤治療和化療耐藥中具有重要作用。
2.1.2 存留細胞（persister cells）
存留細胞是經過幾輪化學治療藥物治療后存活下來的腫瘤細胞，這是一種治療性耐藥細胞狀態[41]，靶向存留細胞是改善HCC耐藥的重要策略。研究發現，存留細胞內的GSH、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和Nrf2水平顯著降低，對脂質過氧化具有很強的敏感性[42]。進一步研究[43]發現，存留細胞的生存嚴重依賴于Gpx4，下調Gpx4水平可以選擇性誘導存留細胞的鐵死亡。越來越多的證據表明，Gpx4抑制劑通過鐵死亡對存留細胞具有特異性致死作用，因此誘導鐵死亡可能是克服這些細胞耐藥的有效途徑。
2.2 索拉非尼耐藥
索拉非尼是第1個被批準用于不適合手術切除晚期HCC患者的全身治療方案，在2項針對晚期HCC患者的隨機Ⅲ期臨床試驗中，索拉非尼與安慰劑組相比延緩了腫瘤進展，分別延長了2.8個月和2.3個月生存期[44]。索拉非尼有限的生存獲益表明HCC細胞中存在原發性和獲得性索拉非尼耐藥機制。此外，金屬硫蛋白-1G（metallothionein-1G，MT-1G）可能是介導HCC中索拉非尼耐藥的關鍵蛋白，抑制MT-1G可以增加細胞內GSH的消耗和脂質過氧化，改善索拉非尼耐藥[44]。有報道[45-46]稱索拉非尼具有強效的鐵死亡誘導作用而非細胞凋亡的誘導劑，索拉非尼可以誘導HCC細胞的鐵死亡，這種鐵死亡是索拉非尼特有的，與其激酶抑制活性無關。綜上，我們可以通過增強鐵死亡來改善索拉非尼耐藥，如Rb、S1Rs、MT-1G和Nrf2可以抑制索拉非尼誘導的鐵死亡，通過靶向抑制上述的調節因子可以顯著改善索拉非尼的耐藥，這為未來改善索拉非尼耐藥提供了一個很有前景的策略。
3 鐵死亡在HCC研究中的前景
近年來，鐵死亡在多種疾病中的臨床意義已經逐漸顯現，尤其在腫瘤的治療中具有很大的應用潛力。隨著鐵死亡在HCC中機制研究的不斷深入，鐵死亡在HCC的治療中具有廣闊的前景。
3.1 改善耐藥
研究[42-46]證實通過增強鐵死亡可以明顯改善索拉非尼及化學治療耐藥。這是未來改善耐藥的一個有前景的靶點，有望使晚期HCC患者的預后得到有效改善；而且有研究[42-43, 47]發現鐵死亡可能更適用于那些對化學治療、放射治療等治療不太敏感的腫瘤細胞。然而絕大多數關于鐵死亡改善HCC耐藥的研究仍然處于體外細胞水平，其效果仍需要未來更多的臨床試驗來證明。
3.2 新藥研發
最近有研究[48]發現了一些高效鐵死亡誘導劑，例如中藥成分的重樓皂苷可以通過誘導鐵死亡來發揮其對抗HCC的活性，這對我們理解中藥抗腫瘤活性的機制，更好地治療HCC以及多種腫瘤具有深遠意義。考慮到Gpx4抑制劑治療耐藥腫瘤的效果，開發出具有更優藥代動力學的Gpx4靶向藥物將是一個有前景的方向。在這方面，納米醫學[49]有機會開發出更有效更有針對性的鐵死亡靶向藥物，從而更好地治療腫瘤，并提高藥物安全性，降低全身毒性。
3.3 聯合治療
研究[23]表明，氟哌啶醇可促進索拉非尼誘導的鐵死亡，這為HCC的聯合用藥治療提供了一個良好的策略。 Lippmann等[50]發現，聯合應用金諾芬/丁硫氨酸亞砜胺或丁硫氨酸亞砜胺/erastin可以顯著下調Gpx4水平，更有效地誘導鐵死亡并能顯著克服HCC的化學治療耐藥。此外，誘導鐵死亡聯合化學治療可明顯改善化學治療耐藥，提高化學治療藥物的療效，這也是未來改善腫瘤耐藥的一個有前景的策略。Wang等[51]發現，腫瘤的免疫治療效果也與鐵死亡有關，T細胞促進腫瘤鐵死亡作用是一種新的抗腫瘤機制，這提示靶向鐵死亡并結合免疫檢查點抑制劑是未來腫瘤治療的潛在方向。但HCC的免疫治療尚處于起步階段，誘導鐵死亡聯合免疫治療的機制與效果有待進一步的試驗來證實。
3.4 腫瘤分型
有研究[52]根據鐵死亡基因表達和甲基化情況，將HCC的鐵死亡分為兩種不同的表型，即鐵死亡-Ｈ和鐵死亡-Ｌ，兩種表型具有不同的預后和臨床病理特征，統計學分析顯示鐵死亡-Ｈ組的HCC患者通常腫瘤分化低、T分期高、血管侵犯發生率高、血清甲胎蛋白水平更高，預示著鐵死亡-Ｈ 組更差的預后。這一分型對預測HCC患者的預后，識別高危HCC患者具有重要意義。Liu等[53]基于32個數據集中的3 933個HCC樣本和74個鐵死亡相關基因全面探索了不同的鐵死亡亞型：C1為低代謝、高免疫力亞型；C2為高代謝、低免疫力亞型；不同亞型的臨床意義、功能狀態、免疫浸潤及逃逸機制和基因組改變都不甚相同，與C2相比，C1亞型的預后更差，且多發生在年輕、女性、腫瘤級別高并存在血管侵犯的患者當中；此外，該研究還構建并驗證了一個穩健而有潛力的系統—鐵死亡相關風險評分（ferroptosis related risk score，FRRS）系統，其可以用于評估預后及免疫治療風險，幫助我們更好地理解鐵死亡，以及應用鐵死亡對HCC進行精準管理與治療。
3.5 預后預測
Liang等[54]發現，大部分鐵死亡相關基因在HCC及鄰近的正常組織中存在差異表達，從中挑選與總生存期相關的10個基因組成的標志物構建了HCC的風險分層系統，與低風險組相比高風險組的生存期顯著縮短，顯示出良好的預后預測能力。Deng等[52]構建并驗證了一個由15個基因組成的鐵死亡相關HCC預后模型，顯示出準確的風險分層能力。Du等[55]通過生物信息學分析尋找與免疫和鐵死亡相關的生物學標志物，以期改善HCC的治療和預后，最終從眾多差異表達基因中篩選了5個免疫相關和2個鐵死亡相關基因：熱休克蛋白A4（heat shock protein A4，HSPA4）、干擾素刺激核酸外切酶基因20L2（interferon stimulated exonuclease gene 20 like 2，ISG20L2）、神經母細胞瘤大鼠肉瘤（neuroblastoma rat sarcoma，NRAS）、白細胞介素17D（interleukin 17D，IL-17D）、N-Myc下游調節基因1（N-Myc downstream regulated gene 1，NDRG1）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD），并經多因素Cox比例風險回歸建立腫瘤預后預測模型，其功能富集分析發現7個生物學標志物主要與HCC相關的核分裂、細胞周期等生物過程相關，且2種風險群體的免疫狀態不同；除了傳統的臨床病理因素外，上述7個免疫及鐵死亡相關生物標志物可能在預測HCC的預后方面具有重要臨床價值，同時也為我們更好地理解HCC的分子機制提供了新見解。
4 小結
鐵死亡是由脂質過氧化物和脂質ROS蓄積介導的一種新型RCD方式，涉及十分復雜的病理生理調控機制，在多種疾病尤其是腫瘤中具有重要意義，誘導鐵死亡可以和化學治療藥物以及索拉非尼發揮協同抗腫瘤作用。然而，鐵死亡領域還有許多的未知值得我們進一步探索，比如鐵死亡在HCC發生發展中的具體作用機制、鐵死亡在索拉非尼和化學治療耐藥中的關鍵作用機制以及HCC中鐵死亡與其他RCD之間的內在聯系。 深入研究鐵死亡的分子機制及相關信號通路，調節腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性，改善藥物耐藥，探索其在HCC和多種惡性腫瘤中的作用新靶點具有重要的意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張維志直接參與資料的收集及文章的撰寫；劉連新對文章的知識性內容作出了批判性的審閱并給予指導性意見。