引用本文： 賀超, 曾赟裘, 鄒彬, 黃邵斌, 白劍, 羅順添. 可變剪接在胰腺癌中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(3): 415-420. doi: 10.7507/1007-9424.202105016 復制
胰腺癌是全世界第 7 位腫瘤相關死亡病因，每年有約 496 000 例新發病例和 466 000 例死亡病例[1]。胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）約占胰腺癌的 90%，其他主要是胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumor，PNET） [2]。手術治療是胰腺癌患者唯一的潛在根治性治療方式。5-氟尿嘧啶/亞葉酸/伊立替康/奧沙利鉑（FOLFIRINOX）或吉西他濱聯合白蛋白結合型紫杉醇是晚期胰腺癌患者的一線化學治療（以下簡稱化療）方案。由于早期診斷困難，各種治療方法效果差，復發風險高，胰腺癌患者診斷后的 5 年生存率僅約 8%[3]。因此，亟需探索新的早期診斷和治療方法。
可變剪接（alternative splicing）是指一個 mRNA 前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不同的 mRNA 剪接異構體的過程。可變剪接增加了 mRNA 和蛋白質的多樣性。人類超過 95% 的基因轉錄后發生可變剪接[4]。可變剪接異常可能改變基因的表達水平或形成新的剪接異構體，從而影響腫瘤發生、進展和化療耐藥，并可能提供有意義的腫瘤標志物和治療靶點[5]。筆者現就可變剪接在胰腺癌中的研究進展進行綜述，可能為胰腺癌的診治和研究提供新的思路。
1 可變剪接概述
可變剪接事件可分為 7 種：可變受體位點、可變供體位點、可變啟動子、可變終止子、外顯子跳躍、外顯子互斥和內含子保留[6]。可變剪接由剪接復合體選擇不同的 5′ 端或 3′ 端剪接位點完成。剪接復合體包含 5 個小核糖核蛋白：U1、U2、U4、U5 和 U6，每個都由 1 個特異的小核 RNA（small nuclear RNA）以及一些相關的蛋白和多肽組成。U1 識別 5′ 端剪接位點，U2 結合到 3′ 端剪接位點，然后結合到 U4/U5/U6 復合物。其他可變剪接調節因子包括絲氨酸/精氨酸富集（arginine-serine-rich，SR）剪接因子、異質核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）、RNA 結合基序蛋白 ［RNA-binding motif（RBM）proteins］ 等。這些蛋白識別內含子或外顯子中特異的調節序列，如剪接增強子或剪接沉默子，促進或抑制核心剪接機器對鄰近剪接位點的識別[4]。
2 可變剪接調節因子表達及活性調節與胰腺癌的發生、進展和化療耐藥
2.1 可變剪接調節因子的表達與胰腺癌
可變剪接調節因子可改變基因的可變剪接異構體表達水平，進而促進胰腺癌的發生、發展和化療耐藥。與正常組織相比，這些可變剪接調節因子可能在胰腺癌中高表達或低表達。比如：① hnRNPL 在胰腺癌中高表達，并可能結合 RNA 結合蛋白多聚嘧啶區結合蛋白 1（polypyrimidine-tract binding protein，PTBP1），作為剪接體的一部分，調節靶基因的可變剪接，促進胰腺癌的發生和發展，并與胰腺癌患者的不良預后有關[7]。② 剪接因子 45（splicing factor 45，SPF45）作用于內含子去除的第 2 個關鍵催化步驟。SPF45 通過識別內含子內腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）二核苷酸序列（AGs 序列）參與可變剪接。SPF45 過表達于多種腫瘤，包括胰腺癌。SPF45 在 Hela 細胞中過表達與阿霉素和長春新堿耐藥有關[8]。③ RNA 結合基序蛋白 10（RNA binding motif protein 10，RBM10）可結合端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的 mRNA，抑制全長 hTERT 的產生。hTERT 是近 90% 的惡性腫瘤中控制端粒酶活性和維持端粒的關鍵因子之一。大部分 hTERT 轉錄物為無活性的非全長異構體，以保證體細胞穩態和低惡性腫瘤發生率。RBM10 在胰腺癌中低表達，并與胰腺癌患者的不良預后有關。RBM10 丟失可促進胰腺癌細胞的增生、侵襲和異體移植物生長[9]。④ 上皮剪接調節蛋白 1（epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）是 RNA 結合蛋白，可結合成纖維細胞生長因子受體 2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR-2）的基因內剪接增強子/基因內剪接沉默子-3，增強剪接上游外顯子Ⅲb，而沉默下游外顯子Ⅲc，進而上調 FGFR-2 Ⅲb 的表達，抑制胰腺癌細胞的生長、遷移、侵襲和轉移。ESRP1 是 PDAC 患者良好的預后因子[10]。⑤ PTBP1 可調節丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）基因的可變剪接。PKM 編碼 2 個異構體 PKM1 和 PKM2。PKM2 典型地表達于癌細胞中并有促癌作用。PTBP1 促進 PKM2 表達，進而促進吉西他濱抵抗。PKM2 在吉西他濱抵抗的 PDAC 細胞中表達上調，并與胰腺癌患者的無復發生存有關。PKM2 和 PTBP1 可能作為增強胰腺癌化療敏感性的靶點[11]。
2.2 可變剪接調節因子活性的調節與胰腺癌
可變剪接調節因子的活性受多種方式調節，包括激酶、miRNA、lncRNA、轉錄因子等，從而影響基因的可變剪接異構體表達水平和胰腺癌的進展或化療耐藥。比如：① SR 剪接因子（SR splicing factor，SRSF）的活性主要受 Cdc2 樣激酶（Cdc2-like kinases，CLKs）家族和 SR 特異蛋白激酶家族調節。CLK1 通過調節 SRSF 的細胞分布和活性控制可變剪接。CLK1 在胰腺癌中過表達，并磷酸化激活 SRSF5。CLK1-SRSF5 軸抑制甲基轉移酶樣蛋白 14（methyltransferase like 14，METTL14）的外顯子 10+ 跳躍，從而上調 m6A 修飾，促進細胞增生和轉移。此外，CLK1-SRSF5 軸促進細胞周期蛋白 L2（Cyclin L2）的外顯子 6.3 跳躍，從而促進胰腺癌細胞的增生[12]。② Jiang 等[13]報道抑制 Src 家族激酶成員的 Fyn 可上調 P21 激活激酶 1（P21-activated kinase 1，PAK1）的表達，促進 hnRNP E1 磷酸化和細胞核定位，導致剪接體組裝，進而促進整合素 β1C 的表達；整合素 β1 的 B、C、D 異構體能抑制整合素 β1A 介導的局部黏附、細胞擴散和移動；因此 Fyn/ PAK1/ hnRNP E1/整合素 β1C 軸可抑制胰腺癌細胞的轉移[13]。③ miR-193a-5p 可靶向 SRSF6，抑制其表達。SRSF6 可調節氧化戊二酸脫氫酶樣蛋白（oxoglutarate dehydrogenase-like，OGDHL）和細胞外基質蛋白 1（extracellular matrix protein 1，ECM1）的可變剪接異構體的表達模式，影響胰腺癌上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。miR-193a-5p/SRSF6 軸可促進胰腺癌細胞的轉移[14]。④ 基因間長鏈非編碼 RNA（long intergenic non-coding RNA，lincRNA）Linc01232 在胰腺癌中顯著上調，可抑制 hnRNPA2B1 泛素化降解，進而上調其表達。hnRNPA2B1 調節 迅速加速纖維肉瘤蛋白（rapid accelerated fibrosarcoma，Raf）家族激酶 A-Raf 的可變剪接，減少短型異構體形成。A-Raf 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路的絲氨酸-蘇氨酸特異蛋白激酶之一。可變剪接產生短型和長型異構體，短型異構體包含 Ras 結合域，但缺乏 Ras 激活激酶域。Linc01232/hnRNPA2B1/A-Raf 軸可激活 MAPK/細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路，進而促進胰腺癌進展[15]。⑤ CD44 是腫瘤干細胞標志物之一。變異的外顯子 vl-vl0 經可變剪接產生不同的變異異構體 CD44v，而 CD44s（s 代表標準）沒有變異外顯子。幾乎所有胰腺癌細胞中都可以檢測到 CD44v。CD44v3 和 CD44v6 均與胰腺癌轉移有關。細胞外基質可誘導 CD44v 異構體表達，繼而促進胰腺癌細胞侵襲[16]。轉錄因子鋅指 E 盒結合同源框 1（Zinc finger E-box binding homeobox1，ZEB1）可通過調節 ESRP1 的表達，進而調控 CD44 的可變剪接，促進 CD44v 向 CD44s 轉換。CD44s 則反過來激活 ZEB1 的表達，形成維持 ZEB1 和 CD44s 表達的正反饋環，從而促進腫瘤成球能力、藥物抵抗和腫瘤復發[17]。⑥ 哺乳動物肌動蛋白調節蛋白人類同源物（human ortholog of mammalian enabled，hMENA），可調節細胞黏附、遷移和腫瘤侵襲。可變剪接產生多種蛋白異構體，其中 hMENA11a和 hMENA△v6 在細胞增生和侵襲中有相反的作用。轉化生長因子β1/β-連環蛋白信號可上調胰腺癌中 hMENA 和 hMENA△v6 的表達，而非 hMENA11a，從而促進胰腺癌 EMT 和侵襲[18]。
3 可變剪接異構體與胰腺癌發生、進展和化療耐藥
3.1 抑癌基因的可變剪接異構體與胰腺癌
可變剪接可能降低抑癌基因的表達水平或抑制抑癌基因的活性，從而促進胰腺癌的發生和進展。比如：① 脆性組氨酸三聯體（fragile histldine triad，FHIT）位于染色體的 3p14.2，被認為是腫瘤抑制基因。Simon 等[19]發現可變剪接使 70% 的胰腺癌細胞系丟失全長 FHIT 轉錄物，66% 的胰腺癌細胞系有基因內同源丟失外顯子 3、4、5；FHIT 蛋白的表達依賴于全長 FHIT 轉錄物；因此可變剪接可能導致 Fhit 蛋白表達下降，從而影響胰腺癌的發生。② 分泌素受體可能對胰腺癌細胞有生長抑制作用。Ding 等[20]報道外顯子 3 剪接去除的分泌素受體可變剪接異構體不能結合分泌素和傳導信號，但能與野生型受體形成二聚體，從而抑制野生型分泌素受體的活動；在中國倉鼠卵巢細胞中，生長素受體有生長抑制效應；因此，分泌素受體的 AS 異構體可能通過抑制野生型受體的活性進而促進胰腺癌進展。
3.2 原癌基因的可變剪接異構體與胰腺癌
可變剪接可能促進原癌基因的表達或增強其穩定性，從而促進胰腺癌的發生發展。比如：① 受體酪氨酸激酶（recepteur d'origine nantais，RON）是原癌基因，阻斷其活性可抑制腫瘤侵襲和生長，增強化療敏感性。與正常胰腺組織相比，胰腺癌中 RON 的 mRNA 表達水平顯著上調，其中可變剪接異構體占總表達量的 50%。短型異構體（short form of RON，sfRON）和部分剪接外顯子 5 和 6 產生的異構體（partial splicing of exons 5 and 6，P5P6）有配體獨立活性，與野生型相比可誘導顯著不同的基因表達模式。sfRON 和 P5P6 在人胰腺導管上皮細胞均可誘導致癌表型，并具有轉化活性[21-22]。② yes 相關蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）在多種腫瘤中被認為是原癌基因。PDAC 樣本中 YAP1 表達顯著升高，并與患者的不良預后有關。盡管 PDAC 細胞主要產生 YAP1-2 異構體，但其可促進 YAP1-2/血管生成抑制素結合蛋白（angiomotin，AMOT）/大腫瘤抑制激酶 1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）復合物形成，增強泛素化降解。與 YAP1-2 相比，YAP1-1 的穩定性更強，因而對細胞惡性行為的影響更強[23]。
3.3 其他基因的可變剪接異構體與胰腺癌
另外，一些基因經可變剪接產生的異構體功能各異，存在特殊的異構體能促進胰腺癌進展或對化療耐藥。比如：① 組織因子是凝血的主要生理性驅動劑，可變剪接產生的分泌型異構體，稱為選擇性剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor，asTF）。asTF 缺乏促凝血功能，但可促進 PDAC 生長、轉移、血管新生和單核細胞招募到間質。asTF 的表達水平在一些惡性腫瘤（包括胰腺癌）中與腫瘤晚期相關。晚期腫瘤的低氧環境下 asTF 可激活碳酸酐酶，促進 PDAC 細胞增生和移動[24]。asTF 的中和抗體可抑制 PDAC 進展[25-27]。② 90% 的胰腺腺癌過表達成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）1 和 2 及可變剪接形成的高親和力受體 FGFR-1β。成纖維細胞生長因子受體-1β（fibroblast growth factor receptor-1β，FGFR-1β）異構體與胰腺腺癌細胞生長和化療抵抗有關。抑制 FGFR-1 剪接或過表達 FGFR-1α 可抑制胰腺腺癌細胞生長并增強其對 5-氟尿嘧啶的敏感性[28]。③ Krüppel 樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是鋅指轉錄因子，在不同腫瘤中發揮抑癌作用或致癌作用。胰腺癌細胞中發現了其 4 種剪接異構體 KLF4α、KLF4β、KLF4γ 和 KLF4δ。其中 KLF4α 在侵襲性胰腺癌細胞和胰腺腫瘤組織中表達上調，并可促進胰腺癌生長，其表達水平與胰腺癌患者的不良預后有關[29]。④ 黏蛋白 4（mucin 4，MUC4）在正常的胰腺組織中幾乎檢測不到，但過表達于胰腺癌和結腸癌。MUC4 有至少 24 種剪接異構體，其中外顯子 2 和 3 缺失形成 MUC4/X，外顯子 2 缺失形成 MUC4/Y。Jahan 等[30]報道胰腺癌組織中 MUC4/X 顯著上調，并通過激活整合素-β1/黏著斑激酶/細胞外信號調節激酶信號通路促進胰腺癌細胞增生、侵襲和黏附于細胞外基質蛋白。Zhu 等[31]報道 MUC4/Y 可上調生存因子以抵抗不良的微環境，并上調一系列細胞因子和黏附分子的表達，影響胰腺癌微環境，從而驅動惡性相關正反饋環，促進胰腺癌的惡性行為。⑤ 催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）幾乎表達于所有組織器官，除與泌乳有關外，還與腫瘤的致癌機制有關。可變剪接產生的異構體可分為短型、中等型和長型，其中長型是主要的異構體。Nie 等[32]發現，與長型 PRLR 相比，短型 PRLR 異構體主要表達于胰腺腫瘤和胰腺癌細胞系；短型 PRLR 可通過中心體相關激酶 9-Hippo 軸抑制戊糖磷酸途徑和核苷酸形成，從而抑制 PDAC 細胞增生和腫瘤生長。⑥ 透明質酸介導的細胞游走受體（hyaluronic acid-mediated motility，RHAMM）基因編碼 18 個外顯子。可變剪接產生的 RHAMMA包括所有外顯子，而 RHAMMB缺乏外顯子 4。Choi 等[33]報道 RHAMMB而非 RHAMMA可促進 PNET 轉移（部分是通過表皮生長因子受體信號），且可作為胰腺癌患者的預后因子。⑦ 肌腱蛋白 C（tenascin C，TNC）是細胞外基質蛋白，其前體 mRNA 經可變剪接產生的大的剪接異構體（TNC-L）包含 FN Ⅲ重復區 A-D（TNfnA-D），能激活細胞表面的 TNC 受體膜聯蛋白 A2（annexin A2，ANXA2）。其他非大的異構體（TNC-NL）缺乏 TNfnA-D，不能激活 ANXA2，占 TNC 的主要部分。Hagiwara 等[34]報道間質中 TNC-L 和癌細胞表面 ANXA2 的表達水平與胰腺癌進展和患者的不良預后有關；二者高共表達對預測胰腺癌患者的預后更有特異性；ANXA2 介導的細胞激活可促進 EMT 和獲得侵襲性及腫瘤干細胞表型。Gong 等[35]報道 TNC 的可變剪接片段（TNfnA-D）可結合 ANXA2，并通過經典的 磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB信號通路抑制吉西他濱對胰腺癌細胞的細胞毒性。⑧ 含有 WD 重復單元及 SOCS 盒蛋白-1（WD repeat and SOCS box-containing protein 1，WSB1）的 mRNA 經可變剪接產生 3 種異構體。在人胰腺腫瘤中，總的 WSB1 mRNA 中度升高，然而異構體 3 顯著高表達，異構體 1 和 2 表達下調。異構體 1 和 2 可促進胰腺癌細胞生長，并對吉西他濱和阿霉素誘導的凋亡敏感。而異構體 3 可抑制細胞增生和增強凋亡抵抗[36]。
4 可變剪接異構體可能成為胰腺癌的生物標志物
除前述的 mRNA 剪接異構體外，有研究[37-39]還報道了一些 mRNA 的可變剪接異構體在胰腺癌、癌旁組織或血漿中特異性表達，可能作為胰腺癌診斷、侵襲性和預后預測的標志物。
4.1 診斷性標志物
① 轉錄因子激活蛋白 2α（activating protein 2α，AP-2α）的變異異構體 6 無轉錄活性，高表達于胰腺癌細胞系[37]。② 膽囊收縮素 B/胃泌素（cholecystokinin-B/gastrin，CCK-B）受體的錯義剪接形式包含內含子 4，其表達于胰腺癌，而非正常的胰腺[40]。③ Ⅵ型膠原蛋白α3鏈（type Ⅵ collagen α 3，COL6A3）在 PDAC 的癌旁組織中存在特異的異構體，如納入外顯子 3 和 6 的異構體和納入外顯子 4 的異構體[41]。④ MUC4 的異構體 sv4、sv12、sv13 和 sv10 存在于 36%（4/11）的胰腺腫瘤細胞系，但不存在于任何正常的人體組織[42]。
4.2 侵襲性標志物
PDAC 中 Hedgehog 信號通路的負性調節因子絲氨酸/蘇氨酸激酶 Fused 抑制物（suppressor of fused，SUFU）存在剪接異構體 SUFUvN，其 mRNA 表達水平與 PDAC 淋巴結轉移有關[38]。
4.3 預后標志物
① 與正常人相比較，胰腺癌患者血漿中的 asTF≥200 pg/mL 的比例更高，且 asTF≥200 pg/mL 與胰腺癌低可切除性有關[39]。② CD44 異構體在壺腹癌中有雙重預后預測作用：CD44s 的表達水平在早期壺腹癌可預測不良的預后，而 CD44v 的表達水平在晚期壺腹癌可預測復發[43]。③ 轉錄因子 Krüppel 樣因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）在胰腺腫瘤樣本和胰腺癌細胞系中的可變剪接異構體表達水平顯著上調，且與胰腺癌患者的分期和預后有關[44]。
5 小結
綜上所述，可變剪接異常影響胰腺癌的發生、進展和化療耐藥，可能為胰腺癌的治療提供新的靶點，也可能為胰腺癌診斷、侵襲性和預后預測提供新的標志物。但仍有許多認知盲區，需進一步研究。如胰腺癌中存在 KRAS、TP53 等基因突變[45]，這對可變剪接產生什么影響？胰腺癌中剪接調節因子表達水平改變的原因是什么？是否存在便于檢測的 AS 異構體用于胰腺癌早期診斷？另外，研究者試圖開發靶向可變剪接的抗腫瘤藥物，目前主要包括小分子剪接調節劑和反義寡核苷酸。小分子剪接調節劑主要包括 3 種結構特異的細菌發酵產物：FR901464（衍生物包括 spliceostatin A、meayamycin 和 thailanstatins）、pladienolide B（衍生物包括 E7107、H3B-8800 和 FD-895）和 GEX1（衍生物：herboxidiene），在體外實驗和多種小鼠模型中有抗腫瘤活性。其中，H3B-8800 是剪接因子 SF3B1 的抑制劑，對剪接體基因突變的癌細胞有協同致死作用，已進入Ⅰ期臨床試驗，用于血液系統腫瘤的患者[46]。其他如剪接異構體中和抗體在試驗中可抑制 PDAC 進展，但總體而言，藥物開發處于起步階段。繼續探索可變剪接在胰腺癌的發生發展分子機制，可能是改善胰腺癌早期診斷和治療的新思路。
重要聲明
利益沖突聲明：在整個研究期間（從論文設計/構思至成文、投稿），作者或所在機構未受其他實體（基金資助、政府機構（國家，省級，市級，科研院所等）或商業機構）的支持。稿件的作者和所涉及的內容（投稿前 2 年內），無潛在利益沖突。與所在機構外的非金融組織無關聯。
作者貢獻聲明：賀超完成文章撰寫、修改；曾赟裘參與文獻材料支持；鄒彬完成對文章的知識性內容作批評性審閱；黃邵斌和白劍負責指導論文撰寫；羅順添負責醞釀和設計本綜述。
胰腺癌是全世界第 7 位腫瘤相關死亡病因，每年有約 496 000 例新發病例和 466 000 例死亡病例[1]。胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）約占胰腺癌的 90%，其他主要是胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumor，PNET） [2]。手術治療是胰腺癌患者唯一的潛在根治性治療方式。5-氟尿嘧啶/亞葉酸/伊立替康/奧沙利鉑（FOLFIRINOX）或吉西他濱聯合白蛋白結合型紫杉醇是晚期胰腺癌患者的一線化學治療（以下簡稱化療）方案。由于早期診斷困難，各種治療方法效果差，復發風險高，胰腺癌患者診斷后的 5 年生存率僅約 8%[3]。因此，亟需探索新的早期診斷和治療方法。
可變剪接（alternative splicing）是指一個 mRNA 前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不同的 mRNA 剪接異構體的過程。可變剪接增加了 mRNA 和蛋白質的多樣性。人類超過 95% 的基因轉錄后發生可變剪接[4]。可變剪接異常可能改變基因的表達水平或形成新的剪接異構體，從而影響腫瘤發生、進展和化療耐藥，并可能提供有意義的腫瘤標志物和治療靶點[5]。筆者現就可變剪接在胰腺癌中的研究進展進行綜述，可能為胰腺癌的診治和研究提供新的思路。
1 可變剪接概述
可變剪接事件可分為 7 種：可變受體位點、可變供體位點、可變啟動子、可變終止子、外顯子跳躍、外顯子互斥和內含子保留[6]。可變剪接由剪接復合體選擇不同的 5′ 端或 3′ 端剪接位點完成。剪接復合體包含 5 個小核糖核蛋白：U1、U2、U4、U5 和 U6，每個都由 1 個特異的小核 RNA（small nuclear RNA）以及一些相關的蛋白和多肽組成。U1 識別 5′ 端剪接位點，U2 結合到 3′ 端剪接位點，然后結合到 U4/U5/U6 復合物。其他可變剪接調節因子包括絲氨酸/精氨酸富集（arginine-serine-rich，SR）剪接因子、異質核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）、RNA 結合基序蛋白 ［RNA-binding motif（RBM）proteins］ 等。這些蛋白識別內含子或外顯子中特異的調節序列，如剪接增強子或剪接沉默子，促進或抑制核心剪接機器對鄰近剪接位點的識別[4]。
2 可變剪接調節因子表達及活性調節與胰腺癌的發生、進展和化療耐藥
2.1 可變剪接調節因子的表達與胰腺癌
可變剪接調節因子可改變基因的可變剪接異構體表達水平，進而促進胰腺癌的發生、發展和化療耐藥。與正常組織相比，這些可變剪接調節因子可能在胰腺癌中高表達或低表達。比如：① hnRNPL 在胰腺癌中高表達，并可能結合 RNA 結合蛋白多聚嘧啶區結合蛋白 1（polypyrimidine-tract binding protein，PTBP1），作為剪接體的一部分，調節靶基因的可變剪接，促進胰腺癌的發生和發展，并與胰腺癌患者的不良預后有關[7]。② 剪接因子 45（splicing factor 45，SPF45）作用于內含子去除的第 2 個關鍵催化步驟。SPF45 通過識別內含子內腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）二核苷酸序列（AGs 序列）參與可變剪接。SPF45 過表達于多種腫瘤，包括胰腺癌。SPF45 在 Hela 細胞中過表達與阿霉素和長春新堿耐藥有關[8]。③ RNA 結合基序蛋白 10（RNA binding motif protein 10，RBM10）可結合端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的 mRNA，抑制全長 hTERT 的產生。hTERT 是近 90% 的惡性腫瘤中控制端粒酶活性和維持端粒的關鍵因子之一。大部分 hTERT 轉錄物為無活性的非全長異構體，以保證體細胞穩態和低惡性腫瘤發生率。RBM10 在胰腺癌中低表達，并與胰腺癌患者的不良預后有關。RBM10 丟失可促進胰腺癌細胞的增生、侵襲和異體移植物生長[9]。④ 上皮剪接調節蛋白 1（epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）是 RNA 結合蛋白，可結合成纖維細胞生長因子受體 2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR-2）的基因內剪接增強子/基因內剪接沉默子-3，增強剪接上游外顯子Ⅲb，而沉默下游外顯子Ⅲc，進而上調 FGFR-2 Ⅲb 的表達，抑制胰腺癌細胞的生長、遷移、侵襲和轉移。ESRP1 是 PDAC 患者良好的預后因子[10]。⑤ PTBP1 可調節丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）基因的可變剪接。PKM 編碼 2 個異構體 PKM1 和 PKM2。PKM2 典型地表達于癌細胞中并有促癌作用。PTBP1 促進 PKM2 表達，進而促進吉西他濱抵抗。PKM2 在吉西他濱抵抗的 PDAC 細胞中表達上調，并與胰腺癌患者的無復發生存有關。PKM2 和 PTBP1 可能作為增強胰腺癌化療敏感性的靶點[11]。
2.2 可變剪接調節因子活性的調節與胰腺癌
可變剪接調節因子的活性受多種方式調節，包括激酶、miRNA、lncRNA、轉錄因子等，從而影響基因的可變剪接異構體表達水平和胰腺癌的進展或化療耐藥。比如：① SR 剪接因子（SR splicing factor，SRSF）的活性主要受 Cdc2 樣激酶（Cdc2-like kinases，CLKs）家族和 SR 特異蛋白激酶家族調節。CLK1 通過調節 SRSF 的細胞分布和活性控制可變剪接。CLK1 在胰腺癌中過表達，并磷酸化激活 SRSF5。CLK1-SRSF5 軸抑制甲基轉移酶樣蛋白 14（methyltransferase like 14，METTL14）的外顯子 10+ 跳躍，從而上調 m6A 修飾，促進細胞增生和轉移。此外，CLK1-SRSF5 軸促進細胞周期蛋白 L2（Cyclin L2）的外顯子 6.3 跳躍，從而促進胰腺癌細胞的增生[12]。② Jiang 等[13]報道抑制 Src 家族激酶成員的 Fyn 可上調 P21 激活激酶 1（P21-activated kinase 1，PAK1）的表達，促進 hnRNP E1 磷酸化和細胞核定位，導致剪接體組裝，進而促進整合素 β1C 的表達；整合素 β1 的 B、C、D 異構體能抑制整合素 β1A 介導的局部黏附、細胞擴散和移動；因此 Fyn/ PAK1/ hnRNP E1/整合素 β1C 軸可抑制胰腺癌細胞的轉移[13]。③ miR-193a-5p 可靶向 SRSF6，抑制其表達。SRSF6 可調節氧化戊二酸脫氫酶樣蛋白（oxoglutarate dehydrogenase-like，OGDHL）和細胞外基質蛋白 1（extracellular matrix protein 1，ECM1）的可變剪接異構體的表達模式，影響胰腺癌上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。miR-193a-5p/SRSF6 軸可促進胰腺癌細胞的轉移[14]。④ 基因間長鏈非編碼 RNA（long intergenic non-coding RNA，lincRNA）Linc01232 在胰腺癌中顯著上調，可抑制 hnRNPA2B1 泛素化降解，進而上調其表達。hnRNPA2B1 調節 迅速加速纖維肉瘤蛋白（rapid accelerated fibrosarcoma，Raf）家族激酶 A-Raf 的可變剪接，減少短型異構體形成。A-Raf 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路的絲氨酸-蘇氨酸特異蛋白激酶之一。可變剪接產生短型和長型異構體，短型異構體包含 Ras 結合域，但缺乏 Ras 激活激酶域。Linc01232/hnRNPA2B1/A-Raf 軸可激活 MAPK/細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路，進而促進胰腺癌進展[15]。⑤ CD44 是腫瘤干細胞標志物之一。變異的外顯子 vl-vl0 經可變剪接產生不同的變異異構體 CD44v，而 CD44s（s 代表標準）沒有變異外顯子。幾乎所有胰腺癌細胞中都可以檢測到 CD44v。CD44v3 和 CD44v6 均與胰腺癌轉移有關。細胞外基質可誘導 CD44v 異構體表達，繼而促進胰腺癌細胞侵襲[16]。轉錄因子鋅指 E 盒結合同源框 1（Zinc finger E-box binding homeobox1，ZEB1）可通過調節 ESRP1 的表達，進而調控 CD44 的可變剪接，促進 CD44v 向 CD44s 轉換。CD44s 則反過來激活 ZEB1 的表達，形成維持 ZEB1 和 CD44s 表達的正反饋環，從而促進腫瘤成球能力、藥物抵抗和腫瘤復發[17]。⑥ 哺乳動物肌動蛋白調節蛋白人類同源物（human ortholog of mammalian enabled，hMENA），可調節細胞黏附、遷移和腫瘤侵襲。可變剪接產生多種蛋白異構體，其中 hMENA11a和 hMENA△v6 在細胞增生和侵襲中有相反的作用。轉化生長因子β1/β-連環蛋白信號可上調胰腺癌中 hMENA 和 hMENA△v6 的表達，而非 hMENA11a，從而促進胰腺癌 EMT 和侵襲[18]。
3 可變剪接異構體與胰腺癌發生、進展和化療耐藥
3.1 抑癌基因的可變剪接異構體與胰腺癌
可變剪接可能降低抑癌基因的表達水平或抑制抑癌基因的活性，從而促進胰腺癌的發生和進展。比如：① 脆性組氨酸三聯體（fragile histldine triad，FHIT）位于染色體的 3p14.2，被認為是腫瘤抑制基因。Simon 等[19]發現可變剪接使 70% 的胰腺癌細胞系丟失全長 FHIT 轉錄物，66% 的胰腺癌細胞系有基因內同源丟失外顯子 3、4、5；FHIT 蛋白的表達依賴于全長 FHIT 轉錄物；因此可變剪接可能導致 Fhit 蛋白表達下降，從而影響胰腺癌的發生。② 分泌素受體可能對胰腺癌細胞有生長抑制作用。Ding 等[20]報道外顯子 3 剪接去除的分泌素受體可變剪接異構體不能結合分泌素和傳導信號，但能與野生型受體形成二聚體，從而抑制野生型分泌素受體的活動；在中國倉鼠卵巢細胞中，生長素受體有生長抑制效應；因此，分泌素受體的 AS 異構體可能通過抑制野生型受體的活性進而促進胰腺癌進展。
3.2 原癌基因的可變剪接異構體與胰腺癌
可變剪接可能促進原癌基因的表達或增強其穩定性，從而促進胰腺癌的發生發展。比如：① 受體酪氨酸激酶（recepteur d'origine nantais，RON）是原癌基因，阻斷其活性可抑制腫瘤侵襲和生長，增強化療敏感性。與正常胰腺組織相比，胰腺癌中 RON 的 mRNA 表達水平顯著上調，其中可變剪接異構體占總表達量的 50%。短型異構體（short form of RON，sfRON）和部分剪接外顯子 5 和 6 產生的異構體（partial splicing of exons 5 and 6，P5P6）有配體獨立活性，與野生型相比可誘導顯著不同的基因表達模式。sfRON 和 P5P6 在人胰腺導管上皮細胞均可誘導致癌表型，并具有轉化活性[21-22]。② yes 相關蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）在多種腫瘤中被認為是原癌基因。PDAC 樣本中 YAP1 表達顯著升高，并與患者的不良預后有關。盡管 PDAC 細胞主要產生 YAP1-2 異構體，但其可促進 YAP1-2/血管生成抑制素結合蛋白（angiomotin，AMOT）/大腫瘤抑制激酶 1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）復合物形成，增強泛素化降解。與 YAP1-2 相比，YAP1-1 的穩定性更強，因而對細胞惡性行為的影響更強[23]。
3.3 其他基因的可變剪接異構體與胰腺癌
另外，一些基因經可變剪接產生的異構體功能各異，存在特殊的異構體能促進胰腺癌進展或對化療耐藥。比如：① 組織因子是凝血的主要生理性驅動劑，可變剪接產生的分泌型異構體，稱為選擇性剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor，asTF）。asTF 缺乏促凝血功能，但可促進 PDAC 生長、轉移、血管新生和單核細胞招募到間質。asTF 的表達水平在一些惡性腫瘤（包括胰腺癌）中與腫瘤晚期相關。晚期腫瘤的低氧環境下 asTF 可激活碳酸酐酶，促進 PDAC 細胞增生和移動[24]。asTF 的中和抗體可抑制 PDAC 進展[25-27]。② 90% 的胰腺腺癌過表達成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）1 和 2 及可變剪接形成的高親和力受體 FGFR-1β。成纖維細胞生長因子受體-1β（fibroblast growth factor receptor-1β，FGFR-1β）異構體與胰腺腺癌細胞生長和化療抵抗有關。抑制 FGFR-1 剪接或過表達 FGFR-1α 可抑制胰腺腺癌細胞生長并增強其對 5-氟尿嘧啶的敏感性[28]。③ Krüppel 樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是鋅指轉錄因子，在不同腫瘤中發揮抑癌作用或致癌作用。胰腺癌細胞中發現了其 4 種剪接異構體 KLF4α、KLF4β、KLF4γ 和 KLF4δ。其中 KLF4α 在侵襲性胰腺癌細胞和胰腺腫瘤組織中表達上調，并可促進胰腺癌生長，其表達水平與胰腺癌患者的不良預后有關[29]。④ 黏蛋白 4（mucin 4，MUC4）在正常的胰腺組織中幾乎檢測不到，但過表達于胰腺癌和結腸癌。MUC4 有至少 24 種剪接異構體，其中外顯子 2 和 3 缺失形成 MUC4/X，外顯子 2 缺失形成 MUC4/Y。Jahan 等[30]報道胰腺癌組織中 MUC4/X 顯著上調，并通過激活整合素-β1/黏著斑激酶/細胞外信號調節激酶信號通路促進胰腺癌細胞增生、侵襲和黏附于細胞外基質蛋白。Zhu 等[31]報道 MUC4/Y 可上調生存因子以抵抗不良的微環境，并上調一系列細胞因子和黏附分子的表達，影響胰腺癌微環境，從而驅動惡性相關正反饋環，促進胰腺癌的惡性行為。⑤ 催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）幾乎表達于所有組織器官，除與泌乳有關外，還與腫瘤的致癌機制有關。可變剪接產生的異構體可分為短型、中等型和長型，其中長型是主要的異構體。Nie 等[32]發現，與長型 PRLR 相比，短型 PRLR 異構體主要表達于胰腺腫瘤和胰腺癌細胞系；短型 PRLR 可通過中心體相關激酶 9-Hippo 軸抑制戊糖磷酸途徑和核苷酸形成，從而抑制 PDAC 細胞增生和腫瘤生長。⑥ 透明質酸介導的細胞游走受體（hyaluronic acid-mediated motility，RHAMM）基因編碼 18 個外顯子。可變剪接產生的 RHAMMA包括所有外顯子，而 RHAMMB缺乏外顯子 4。Choi 等[33]報道 RHAMMB而非 RHAMMA可促進 PNET 轉移（部分是通過表皮生長因子受體信號），且可作為胰腺癌患者的預后因子。⑦ 肌腱蛋白 C（tenascin C，TNC）是細胞外基質蛋白，其前體 mRNA 經可變剪接產生的大的剪接異構體（TNC-L）包含 FN Ⅲ重復區 A-D（TNfnA-D），能激活細胞表面的 TNC 受體膜聯蛋白 A2（annexin A2，ANXA2）。其他非大的異構體（TNC-NL）缺乏 TNfnA-D，不能激活 ANXA2，占 TNC 的主要部分。Hagiwara 等[34]報道間質中 TNC-L 和癌細胞表面 ANXA2 的表達水平與胰腺癌進展和患者的不良預后有關；二者高共表達對預測胰腺癌患者的預后更有特異性；ANXA2 介導的細胞激活可促進 EMT 和獲得侵襲性及腫瘤干細胞表型。Gong 等[35]報道 TNC 的可變剪接片段（TNfnA-D）可結合 ANXA2，并通過經典的 磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB信號通路抑制吉西他濱對胰腺癌細胞的細胞毒性。⑧ 含有 WD 重復單元及 SOCS 盒蛋白-1（WD repeat and SOCS box-containing protein 1，WSB1）的 mRNA 經可變剪接產生 3 種異構體。在人胰腺腫瘤中，總的 WSB1 mRNA 中度升高，然而異構體 3 顯著高表達，異構體 1 和 2 表達下調。異構體 1 和 2 可促進胰腺癌細胞生長，并對吉西他濱和阿霉素誘導的凋亡敏感。而異構體 3 可抑制細胞增生和增強凋亡抵抗[36]。
4 可變剪接異構體可能成為胰腺癌的生物標志物
除前述的 mRNA 剪接異構體外，有研究[37-39]還報道了一些 mRNA 的可變剪接異構體在胰腺癌、癌旁組織或血漿中特異性表達，可能作為胰腺癌診斷、侵襲性和預后預測的標志物。
4.1 診斷性標志物
① 轉錄因子激活蛋白 2α（activating protein 2α，AP-2α）的變異異構體 6 無轉錄活性，高表達于胰腺癌細胞系[37]。② 膽囊收縮素 B/胃泌素（cholecystokinin-B/gastrin，CCK-B）受體的錯義剪接形式包含內含子 4，其表達于胰腺癌，而非正常的胰腺[40]。③ Ⅵ型膠原蛋白α3鏈（type Ⅵ collagen α 3，COL6A3）在 PDAC 的癌旁組織中存在特異的異構體，如納入外顯子 3 和 6 的異構體和納入外顯子 4 的異構體[41]。④ MUC4 的異構體 sv4、sv12、sv13 和 sv10 存在于 36%（4/11）的胰腺腫瘤細胞系，但不存在于任何正常的人體組織[42]。
4.2 侵襲性標志物
PDAC 中 Hedgehog 信號通路的負性調節因子絲氨酸/蘇氨酸激酶 Fused 抑制物（suppressor of fused，SUFU）存在剪接異構體 SUFUvN，其 mRNA 表達水平與 PDAC 淋巴結轉移有關[38]。
4.3 預后標志物
① 與正常人相比較，胰腺癌患者血漿中的 asTF≥200 pg/mL 的比例更高，且 asTF≥200 pg/mL 與胰腺癌低可切除性有關[39]。② CD44 異構體在壺腹癌中有雙重預后預測作用：CD44s 的表達水平在早期壺腹癌可預測不良的預后，而 CD44v 的表達水平在晚期壺腹癌可預測復發[43]。③ 轉錄因子 Krüppel 樣因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）在胰腺腫瘤樣本和胰腺癌細胞系中的可變剪接異構體表達水平顯著上調，且與胰腺癌患者的分期和預后有關[44]。
5 小結
綜上所述，可變剪接異常影響胰腺癌的發生、進展和化療耐藥，可能為胰腺癌的治療提供新的靶點，也可能為胰腺癌診斷、侵襲性和預后預測提供新的標志物。但仍有許多認知盲區，需進一步研究。如胰腺癌中存在 KRAS、TP53 等基因突變[45]，這對可變剪接產生什么影響？胰腺癌中剪接調節因子表達水平改變的原因是什么？是否存在便于檢測的 AS 異構體用于胰腺癌早期診斷？另外，研究者試圖開發靶向可變剪接的抗腫瘤藥物，目前主要包括小分子剪接調節劑和反義寡核苷酸。小分子剪接調節劑主要包括 3 種結構特異的細菌發酵產物：FR901464（衍生物包括 spliceostatin A、meayamycin 和 thailanstatins）、pladienolide B（衍生物包括 E7107、H3B-8800 和 FD-895）和 GEX1（衍生物：herboxidiene），在體外實驗和多種小鼠模型中有抗腫瘤活性。其中，H3B-8800 是剪接因子 SF3B1 的抑制劑，對剪接體基因突變的癌細胞有協同致死作用，已進入Ⅰ期臨床試驗，用于血液系統腫瘤的患者[46]。其他如剪接異構體中和抗體在試驗中可抑制 PDAC 進展，但總體而言，藥物開發處于起步階段。繼續探索可變剪接在胰腺癌的發生發展分子機制，可能是改善胰腺癌早期診斷和治療的新思路。
重要聲明
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作者貢獻聲明：賀超完成文章撰寫、修改；曾赟裘參與文獻材料支持；鄒彬完成對文章的知識性內容作批評性審閱；黃邵斌和白劍負責指導論文撰寫；羅順添負責醞釀和設計本綜述。