引用本文： 郭晨明, 李慧芳, 歐提庫爾·艾尼, 羅志文, 熱艷娜·莫合塔爾, 地力木拉提·艾斯木吐拉. 異硫氰酸苯乙酯通過內質網應激途徑促進乳腺癌細胞凋亡及增殖的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(1): 12-16. doi: 10.7507/1007-9424.202104103 復制
乳腺癌發病率逐年升高，盡管化療提高了患者的生存率，但放化療引起的耐受、不良反應等問題亟待解決[1]。中藥具有多靶點、容易獲得、毒性低等優勢，已廣泛應用于腫瘤的輔助治療，效果顯著。異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是從十字花科植物中提取的一種異硫氰酸酯類物質，對多種惡性腫瘤具有抑制作用[2-4]，但其作用機制尚不清楚。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞凋亡的一條途徑，適度的 ERS 可維持細胞的完整，但持續 ERS 可激活細胞凋亡通路[5-6]。有研究[7-10]發現，多種中藥可通過 ERS 途徑促進腫瘤細胞的凋亡，但 PEITC 促進乳腺癌細胞凋亡的作用是否與 ERS 途徑有關目前仍不甚明確。本研究探索了 PEITC 對乳腺癌細胞凋亡的影響及其可能機制，希望為乳腺癌的防治提供一些新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM 培養液、雙抗、胰蛋白酶，武漢博士德生物有限公司；PEITC，美國 Sigma 公司；Trizol 試劑、Triton X-100，江蘇碧云天科技有限公司；兔抗人蛋白激酶 R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、真核生物翻譯起始因子2α亞基（eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，eIF2α）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP）、肌醇依賴內質網調節細胞核信號激酶1α（inositol-requiring ER-to-nucleus signal kinase 1α，IRE1α）和活化轉錄因子6α（activating transcription factor 6α，ATF6α）多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗，英國 Santa Cruz 公司；B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及髓細胞白血病基因 1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）多克隆一抗，美國 Abcam 公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）及其抗體、碘化丙啶（PI），美國 BD Biosciences；引物序列，上海生工有限公司；TUNEL原位凋亡細胞檢測試劑盒、DAPI 染色試劑盒，美國 BioVision 公司；MTT 檢測試劑盒、RNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒，武漢博士德生物公司；Western blot 試劑盒，美國 Kapa Biosystems；酶標儀、倒置熒光顯微鏡及 ABI7900 PCR 擴增儀，上海儀電分析儀器有限公司；FACS 流式細胞儀，美國 BD Biosciences。
1.2 細胞培養與處理
乳腺癌細胞株 SK-BR-3（上海細胞庫提供）于含 10% 胎牛血清和青、鏈霉素各 100 U/L 的 DMEM 培養基中培養，培養條件為 37 ℃、5% CO2。待細胞鋪滿培養瓶后用 0.25% 胰酶消化，制備單細胞懸液，使用完全培養基繼續培養，定期更換培養基、傳代。選取第 3 代細胞，待細胞生長密度達到 80% 左右時分別用 10、30、50 μmol/L PEITC 處理的 SK-BR-3 細胞作為實驗組，不加 PEITC（0 μmol/L PEITC）處理的細胞作為對照組，各組細胞處理后繼續培養后 48 h 時收集細胞用于后續實驗。
1.3 細胞增殖能力檢測
1.3.1 MTT 法
取對數生長期細胞制備單細胞懸液，以每孔1×103個/mL細胞接種于96孔板（體積200 μL，每組設3個復孔），于含10%胎牛血清的培養基、37 ℃ 5% CO2 培養箱中分別培養 24、48 及 72 h，終止前加入 5 mg/mL MTT 20 μL 繼續培養后 4 h 時加入 150 μL 二甲基亞砜振蕩混勻 10 min，充分溶解結晶物，ELX800 酶標儀 490 nm 波長測定吸光度（A）值以計算細胞成活率，其計算公式為“（實驗孔A 值–空白孔 A 值）/（對照孔 A 值–空白孔 A 值）×100%”，其中空白孔為沒有細胞，只加培養液。每次重復測量 3 次取平均值。
1.3.2 BrdU 法
分別消化、收集各組細胞，調整細胞濃度為 5×103/L 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，繼續培養，隔日換液，10 d 后去除培養液，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）輕輕洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min。0.2% Triton X-100 滲透 10 min，于 4 ℃ 與 BrdU 抗體共培養過夜。最后用 DAPI 進行染色并用熒光顯微鏡（×200）拍照，在光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下（×40物光鏡）對所有BrdU標記陽性細胞進行計數。
1.4 細胞凋亡檢測
1.4.1 TUNEL 法
取對數生長期細胞，去除培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛孵育10 min，PBS洗滌，加入適量凋亡檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌，加入DAPI室溫避光孵育8 min，PBS沖洗，加抗淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色，計算凋亡率，其計算公式為“TUNEL染色陽性細胞數/細胞總數×100%”。
1.4.2 流式細胞術
胰酶消化，離心細胞，調整濃度為 5×105/L 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，每組設置 5 個復孔，加入 0.2% 胎牛血清繼續培養 48 h，加入 10 μL PI 避光條件下 4 ℃ 孵育 1 h，流式細胞儀測定，ModFit 軟件分析。計算凋亡率，其計算公式為“凋亡率（%）= F2 凋亡率+F4 凋亡率”，其中F2、F4分別指晚期凋亡細胞和早期凋亡細胞。
1.5 凋亡相關指標Bcl-2、Bax、MCL-1和ERS相關指標PERK、CHOP、IRE1α、ATF6α、eIF2α 表達檢測
1.5.1 Western blot 法
胰酶消化細胞，40 ℃ 1 500 r/min（r=10 cm）離心 5 min，去上清，超聲波破核，離心，取上清液。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h，按 1∶1 000 分別加入 PERK、eIF2α、CHOP、IRE1α、ATF6α、Bcl-2、Bax、MCL-1 一抗 4 ℃ 過夜，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定其A值，以目標蛋白與GAPDH A值比表示相對表達量。
1.5.2 實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法
取處理后繼續培養 24 h 后的各組細胞，胰酶消化，離心。加入 Trizol 試劑 1 mL，依次加入氯仿、異丙醇等提取 RNA并測定濃度，逆轉錄成 cDNA，合成體系為：10 mmol/L dNTP 1.5 μL，5×PCR Buffer 5 μL，反轉錄酶 1 μL，DEPC 水 2.5 μL，總體積 25 μL。然后 PCR 擴增，引物序列見表 1，反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL+上下游引物 10 μmol/L 各 1 μL，加 DEPC 水總體積為 25 μL。反應參數：95 ℃ 預變性 2 min，然后進行下列循環，94 ℃ 變性 15 s、55 ℃ 退火 15 s、68 ℃ 延伸 30 s，共 45 個循環，75 ℃ 構建熔解曲線。2–ΔΔCt法計算目標指標 mRNA 的相對表達量。
表1
目標引物序列和大小
2 結果
2.1 PEITC 抑制 SK-BR-3 細胞增殖能力檢測結果
MTT 法和 BrdU 染色結果（圖 1a–1c）均顯示，與對照組（0 μmol/L PEITC）比較，10、30、50 μmol/L PEITC 均可抑制 SK-BR-3 細胞增殖能力，在 30、50 μmol/L PEITC 時更明顯且 MTT 法檢測結果見隨著時間延長呈降低趨勢。
圖1
示 PEITC 對乳腺癌細胞增殖、凋亡及 ERS 凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達結果
a：MTT 法檢測結果；b、c：分別為BrdU染色的定性（ ×20）及半定量結果；d、e：分別為TUNEL 法染色的定性（ ×40）及半定量結果；f–j：各組流式細胞術半定量結果（f）和定性（g–j）結果，F1所指區域細胞為壞死細胞、F2所指區域細胞為晚期凋亡細胞、F3所指區域細胞為活細胞、F4所指區域細胞為早期凋亡細胞；k–p：蛋白及mRNA表達結果
2.2 PEITC 促進 SK-BR-3 細胞凋亡檢測結果
TUNEL 法（圖 1d、1e）和流式細胞術（圖 1f–1j）檢測結果顯示，與對照組（0 μmol/L PEITC）比較，10、30、50 μmol/L PEITC 均可促進 SK-BR-3 細胞凋亡，在 30、50 μmol/L PEITC 時更明顯。
2.3 PEITC對SK-BR-3細胞凋亡相關指標和ERS凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達影響結果
Western blot 法和qRT-PCR法檢測 SK-BR-3 細胞凋亡相關指標和ERS凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達的定性和定量結果見圖 1k–1p。30、50 μmol/L PEITC 組細胞 Bcl-2、MCL-1 蛋白和 mRNA 表達量低于對照組（0 μmol/L），且隨著濃度增加表達量逐漸降低。30、50 μmol/L PEITC組細胞 Bax、PERK、eIF2α、CHOP、IRE1α、ATF6α 蛋白和 mRNA 表達高于對照組（0 μmol/L），且隨著濃度的增加表達量呈逐漸升高趨勢。
3 討論
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，其發生發展機制尚不完全清楚。腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡在腫瘤進展中發揮重要的作用，因此，如何促進乳腺癌細胞的凋亡是目前研究的重點。
近年來，中藥成為治療腫瘤的熱點。PEITC 屬于異硫氰酸酯類家族，有研究[11-12]表明，PEITC 可調控乳腺癌細胞的生物學行為如增殖、侵襲、凋亡等，但其具體機制尚未被完全闡明。在本研究采用 MTT 法和 BrdU 染色結果均發現，PEITC 可抑制乳腺癌 SK-BR-3 細胞的增殖能力且呈濃度依賴性趨勢，與 Nguyen 等[11]的研究結果基本一致。
細胞凋亡是細胞在一系列基因激活下進行的一種死亡過程，通過這種過程人體可消除無功能或異常細胞。有研究[13-15]發現，PEITC 可促進多種腫瘤細胞的凋亡。本研究首先利用 TUNEL 染色法觀察了 PEITC 對細胞凋亡的影響，結果發現，PEITC可促進 SK-BR-3 細胞的凋亡，凋亡程度隨著藥物濃度的增加而呈增加趨勢；采用流式細胞技術檢測結果發現與 TUNEL 染色法同樣的結果。
細胞在凋亡過程中表達一些特異性的蛋白，如抗凋亡蛋白（Bcl-2、MCL-1）和促凋亡蛋白（Bax），本研究采用 Western blot 法和 qRT-PCR 法檢測了細胞在凋亡過程中表達一些特異性的指標如抗凋亡蛋白（Bcl-2、MCL-1）和促凋亡蛋白（Bax）的表達，結果顯示，經 PEITC 處理 SK-BR-3 細胞后抗凋亡指標（Bcl-2、MCL-1）的蛋白和 mRNA 水平均降低而促凋亡指標（Bax）升高，并且其表達水平隨著濃度增加呈現增加趨勢，也再一次佐證 PEITC 可以促進腫瘤細胞的凋亡。
目前研究[16]認為，細胞凋亡時除了細胞核發生改變外，內質網也是細胞凋亡病理改變的重要組成部分。內質網是調控、維持細胞正常代謝的重要細胞器。當細胞發生凋亡時內質網穩態發生改變，導致其功能缺陷，進而引發 ERS[17]。細胞發生 ERS 時，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白如 PERK、ATF6、IRE1α 等在內質網中聚積并激活信號通路，從而誘導細胞凋亡[18-19]，這些受體蛋白可與內質網中的葡萄糖調節蛋白 78 結合形成復合物，從而使其保持無活性狀態。CHOP 是 ERS 引起的未折疊蛋白反應介導的凋亡通路的下游元件之一[20]。本研究結果顯示，PEITC 處理后的 SK-BR-3 細胞中 ERS 相關蛋白高表達且呈藥物濃度依賴性的趨勢，提示 PEITC 可能通過 ERS 途徑促進細胞的凋亡。
從本研究的初步研究結果看，PEITC 可濃度依賴性地調控乳腺癌 SK-BR-3 細胞中 ERS 和凋亡相關途徑的蛋白和 mRNA 表達水平，從而促進細胞凋亡和抑制其增殖，后期有待進一步進行動物體內實驗探索其作用機制，為 PEITC 的開發和利用提供可靠的實驗依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：郭晨明、地力木拉提·艾斯木吐拉負責課題設計及論文撰寫；郭晨明、李慧芳、歐提庫爾·艾尼、羅志文、熱艷娜·莫合塔爾負責細胞培養及實驗操作；地力木拉提·艾斯木吐拉提出實驗的研究思路并在論文修改過程中提出建議。
乳腺癌發病率逐年升高，盡管化療提高了患者的生存率，但放化療引起的耐受、不良反應等問題亟待解決[1]。中藥具有多靶點、容易獲得、毒性低等優勢，已廣泛應用于腫瘤的輔助治療，效果顯著。異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是從十字花科植物中提取的一種異硫氰酸酯類物質，對多種惡性腫瘤具有抑制作用[2-4]，但其作用機制尚不清楚。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞凋亡的一條途徑，適度的 ERS 可維持細胞的完整，但持續 ERS 可激活細胞凋亡通路[5-6]。有研究[7-10]發現，多種中藥可通過 ERS 途徑促進腫瘤細胞的凋亡，但 PEITC 促進乳腺癌細胞凋亡的作用是否與 ERS 途徑有關目前仍不甚明確。本研究探索了 PEITC 對乳腺癌細胞凋亡的影響及其可能機制，希望為乳腺癌的防治提供一些新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM 培養液、雙抗、胰蛋白酶，武漢博士德生物有限公司；PEITC，美國 Sigma 公司；Trizol 試劑、Triton X-100，江蘇碧云天科技有限公司；兔抗人蛋白激酶 R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、真核生物翻譯起始因子2α亞基（eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，eIF2α）、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP）、肌醇依賴內質網調節細胞核信號激酶1α（inositol-requiring ER-to-nucleus signal kinase 1α，IRE1α）和活化轉錄因子6α（activating transcription factor 6α，ATF6α）多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗，英國 Santa Cruz 公司；B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及髓細胞白血病基因 1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）多克隆一抗，美國 Abcam 公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）及其抗體、碘化丙啶（PI），美國 BD Biosciences；引物序列，上海生工有限公司；TUNEL原位凋亡細胞檢測試劑盒、DAPI 染色試劑盒，美國 BioVision 公司；MTT 檢測試劑盒、RNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒，武漢博士德生物公司；Western blot 試劑盒，美國 Kapa Biosystems；酶標儀、倒置熒光顯微鏡及 ABI7900 PCR 擴增儀，上海儀電分析儀器有限公司；FACS 流式細胞儀，美國 BD Biosciences。
1.2 細胞培養與處理
乳腺癌細胞株 SK-BR-3（上海細胞庫提供）于含 10% 胎牛血清和青、鏈霉素各 100 U/L 的 DMEM 培養基中培養，培養條件為 37 ℃、5% CO2。待細胞鋪滿培養瓶后用 0.25% 胰酶消化，制備單細胞懸液，使用完全培養基繼續培養，定期更換培養基、傳代。選取第 3 代細胞，待細胞生長密度達到 80% 左右時分別用 10、30、50 μmol/L PEITC 處理的 SK-BR-3 細胞作為實驗組，不加 PEITC（0 μmol/L PEITC）處理的細胞作為對照組，各組細胞處理后繼續培養后 48 h 時收集細胞用于后續實驗。
1.3 細胞增殖能力檢測
1.3.1 MTT 法
取對數生長期細胞制備單細胞懸液，以每孔1×103個/mL細胞接種于96孔板（體積200 μL，每組設3個復孔），于含10%胎牛血清的培養基、37 ℃ 5% CO2 培養箱中分別培養 24、48 及 72 h，終止前加入 5 mg/mL MTT 20 μL 繼續培養后 4 h 時加入 150 μL 二甲基亞砜振蕩混勻 10 min，充分溶解結晶物，ELX800 酶標儀 490 nm 波長測定吸光度（A）值以計算細胞成活率，其計算公式為“（實驗孔A 值–空白孔 A 值）/（對照孔 A 值–空白孔 A 值）×100%”，其中空白孔為沒有細胞，只加培養液。每次重復測量 3 次取平均值。
1.3.2 BrdU 法
分別消化、收集各組細胞，調整細胞濃度為 5×103/L 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，繼續培養，隔日換液，10 d 后去除培養液，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）輕輕洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min。0.2% Triton X-100 滲透 10 min，于 4 ℃ 與 BrdU 抗體共培養過夜。最后用 DAPI 進行染色并用熒光顯微鏡（×200）拍照，在光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下（×40物光鏡）對所有BrdU標記陽性細胞進行計數。
1.4 細胞凋亡檢測
1.4.1 TUNEL 法
取對數生長期細胞，去除培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛孵育10 min，PBS洗滌，加入適量凋亡檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌，加入DAPI室溫避光孵育8 min，PBS沖洗，加抗淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色，凋亡細胞呈綠色，計算凋亡率，其計算公式為“TUNEL染色陽性細胞數/細胞總數×100%”。
1.4.2 流式細胞術
胰酶消化，離心細胞，調整濃度為 5×105/L 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，每組設置 5 個復孔，加入 0.2% 胎牛血清繼續培養 48 h，加入 10 μL PI 避光條件下 4 ℃ 孵育 1 h，流式細胞儀測定，ModFit 軟件分析。計算凋亡率，其計算公式為“凋亡率（%）= F2 凋亡率+F4 凋亡率”，其中F2、F4分別指晚期凋亡細胞和早期凋亡細胞。
1.5 凋亡相關指標Bcl-2、Bax、MCL-1和ERS相關指標PERK、CHOP、IRE1α、ATF6α、eIF2α 表達檢測
1.5.1 Western blot 法
胰酶消化細胞，40 ℃ 1 500 r/min（r=10 cm）離心 5 min，去上清，超聲波破核，離心，取上清液。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1 h，按 1∶1 000 分別加入 PERK、eIF2α、CHOP、IRE1α、ATF6α、Bcl-2、Bax、MCL-1 一抗 4 ℃ 過夜，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定其A值，以目標蛋白與GAPDH A值比表示相對表達量。
1.5.2 實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法
取處理后繼續培養 24 h 后的各組細胞，胰酶消化，離心。加入 Trizol 試劑 1 mL，依次加入氯仿、異丙醇等提取 RNA并測定濃度，逆轉錄成 cDNA，合成體系為：10 mmol/L dNTP 1.5 μL，5×PCR Buffer 5 μL，反轉錄酶 1 μL，DEPC 水 2.5 μL，總體積 25 μL。然后 PCR 擴增，引物序列見表 1，反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL+上下游引物 10 μmol/L 各 1 μL，加 DEPC 水總體積為 25 μL。反應參數：95 ℃ 預變性 2 min，然后進行下列循環，94 ℃ 變性 15 s、55 ℃ 退火 15 s、68 ℃ 延伸 30 s，共 45 個循環，75 ℃ 構建熔解曲線。2–ΔΔCt法計算目標指標 mRNA 的相對表達量。
表1
目標引物序列和大小
2 結果
2.1 PEITC 抑制 SK-BR-3 細胞增殖能力檢測結果
MTT 法和 BrdU 染色結果（圖 1a–1c）均顯示，與對照組（0 μmol/L PEITC）比較，10、30、50 μmol/L PEITC 均可抑制 SK-BR-3 細胞增殖能力，在 30、50 μmol/L PEITC 時更明顯且 MTT 法檢測結果見隨著時間延長呈降低趨勢。
圖1
示 PEITC 對乳腺癌細胞增殖、凋亡及 ERS 凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達結果
a：MTT 法檢測結果；b、c：分別為BrdU染色的定性（ ×20）及半定量結果；d、e：分別為TUNEL 法染色的定性（ ×40）及半定量結果；f–j：各組流式細胞術半定量結果（f）和定性（g–j）結果，F1所指區域細胞為壞死細胞、F2所指區域細胞為晚期凋亡細胞、F3所指區域細胞為活細胞、F4所指區域細胞為早期凋亡細胞；k–p：蛋白及mRNA表達結果
2.2 PEITC 促進 SK-BR-3 細胞凋亡檢測結果
TUNEL 法（圖 1d、1e）和流式細胞術（圖 1f–1j）檢測結果顯示，與對照組（0 μmol/L PEITC）比較，10、30、50 μmol/L PEITC 均可促進 SK-BR-3 細胞凋亡，在 30、50 μmol/L PEITC 時更明顯。
2.3 PEITC對SK-BR-3細胞凋亡相關指標和ERS凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達影響結果
Western blot 法和qRT-PCR法檢測 SK-BR-3 細胞凋亡相關指標和ERS凋亡通路相關指標的蛋白及 mRNA 表達的定性和定量結果見圖 1k–1p。30、50 μmol/L PEITC 組細胞 Bcl-2、MCL-1 蛋白和 mRNA 表達量低于對照組（0 μmol/L），且隨著濃度增加表達量逐漸降低。30、50 μmol/L PEITC組細胞 Bax、PERK、eIF2α、CHOP、IRE1α、ATF6α 蛋白和 mRNA 表達高于對照組（0 μmol/L），且隨著濃度的增加表達量呈逐漸升高趨勢。
3 討論
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，其發生發展機制尚不完全清楚。腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡在腫瘤進展中發揮重要的作用，因此，如何促進乳腺癌細胞的凋亡是目前研究的重點。
近年來，中藥成為治療腫瘤的熱點。PEITC 屬于異硫氰酸酯類家族，有研究[11-12]表明，PEITC 可調控乳腺癌細胞的生物學行為如增殖、侵襲、凋亡等，但其具體機制尚未被完全闡明。在本研究采用 MTT 法和 BrdU 染色結果均發現，PEITC 可抑制乳腺癌 SK-BR-3 細胞的增殖能力且呈濃度依賴性趨勢，與 Nguyen 等[11]的研究結果基本一致。
細胞凋亡是細胞在一系列基因激活下進行的一種死亡過程，通過這種過程人體可消除無功能或異常細胞。有研究[13-15]發現，PEITC 可促進多種腫瘤細胞的凋亡。本研究首先利用 TUNEL 染色法觀察了 PEITC 對細胞凋亡的影響，結果發現，PEITC可促進 SK-BR-3 細胞的凋亡，凋亡程度隨著藥物濃度的增加而呈增加趨勢；采用流式細胞技術檢測結果發現與 TUNEL 染色法同樣的結果。
細胞在凋亡過程中表達一些特異性的蛋白，如抗凋亡蛋白（Bcl-2、MCL-1）和促凋亡蛋白（Bax），本研究采用 Western blot 法和 qRT-PCR 法檢測了細胞在凋亡過程中表達一些特異性的指標如抗凋亡蛋白（Bcl-2、MCL-1）和促凋亡蛋白（Bax）的表達，結果顯示，經 PEITC 處理 SK-BR-3 細胞后抗凋亡指標（Bcl-2、MCL-1）的蛋白和 mRNA 水平均降低而促凋亡指標（Bax）升高，并且其表達水平隨著濃度增加呈現增加趨勢，也再一次佐證 PEITC 可以促進腫瘤細胞的凋亡。
目前研究[16]認為，細胞凋亡時除了細胞核發生改變外，內質網也是細胞凋亡病理改變的重要組成部分。內質網是調控、維持細胞正常代謝的重要細胞器。當細胞發生凋亡時內質網穩態發生改變，導致其功能缺陷，進而引發 ERS[17]。細胞發生 ERS 時，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白如 PERK、ATF6、IRE1α 等在內質網中聚積并激活信號通路，從而誘導細胞凋亡[18-19]，這些受體蛋白可與內質網中的葡萄糖調節蛋白 78 結合形成復合物，從而使其保持無活性狀態。CHOP 是 ERS 引起的未折疊蛋白反應介導的凋亡通路的下游元件之一[20]。本研究結果顯示，PEITC 處理后的 SK-BR-3 細胞中 ERS 相關蛋白高表達且呈藥物濃度依賴性的趨勢，提示 PEITC 可能通過 ERS 途徑促進細胞的凋亡。
從本研究的初步研究結果看，PEITC 可濃度依賴性地調控乳腺癌 SK-BR-3 細胞中 ERS 和凋亡相關途徑的蛋白和 mRNA 表達水平，從而促進細胞凋亡和抑制其增殖，后期有待進一步進行動物體內實驗探索其作用機制，為 PEITC 的開發和利用提供可靠的實驗依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：郭晨明、地力木拉提·艾斯木吐拉負責課題設計及論文撰寫；郭晨明、李慧芳、歐提庫爾·艾尼、羅志文、熱艷娜·莫合塔爾負責細胞培養及實驗操作；地力木拉提·艾斯木吐拉提出實驗的研究思路并在論文修改過程中提出建議。
