引用本文： 趙帥華, 張先舟, 蒙博, 曹勝利. 肝內膽管癌組織膽汁酸G蛋白偶聯受體5和熱休克蛋白75表達及與預后的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(2): 218-225. doi: 10.7507/1007-9424.202104073 復制
肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常見的原發性肝臟惡性腫瘤，起源于肝內膽管上皮細胞，生長在肝內二級分支膽管以上部位，占所有原發性肝癌的 10%～15%，且其發病率在全球范圍內持續攀升[1-2]。ICC 與肝細胞肝癌的臨床表現有較大區別，以早期淋巴結及肝內轉移為特征，其侵襲轉移能力更強。目前手術切除仍是 ICC 的首選且最有效的治療方法，但即使能夠手術切除腫瘤的患者，由于術后早期復發、腫瘤生長迅速、遠處轉移等因素，患者預后較差，患者 3 年及5 年生存率只有 30% 和 18%[3-4]。因此，探尋 ICC 細胞侵襲轉移的關鍵分子對篩查及防治腫瘤復發和改善治療效果具有重要的臨床意義。膽汁酸 G 蛋白偶聯受體 5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）也被稱為 G 蛋白耦聯膽汁酸受體 1（G-protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），是 G 蛋白偶聯受體家族的成員，在機體內廣泛表達，在肝臟、腸道和免疫細胞中表達較高[5]。TGR5 能被膽汁酸激活，其激活后具有多種生物學功能，在調節糖類、脂類、能量代謝以及膽汁代謝中發揮重要作用[6]。已有研究[7]證實，TGR5 參與消化系統惡性腫瘤的發生，可作為消化系統惡性腫瘤的潛在治療靶點。熱休克蛋白 75 是熱休克蛋白 70 家族蛋白的一種，廣泛存在于細胞器內，具有調節細胞分化及腫瘤發展的作用[8]。有研究[9]發現，熱休克蛋白 75 在乳腺癌、肝癌和膀胱癌中呈高表達，且具有癌基因特征，與腫瘤的發生發展密切相關。在膽管癌的研究中發現，TGR5 通過結合并上調熱休克蛋白 75 促進膽管癌細胞增殖[10]，推測 TGR5 與熱休克蛋白 75 可能與 ICC 的預后有關。本研究探討了 TGR5 和熱休克蛋白 75 與 ICC 患者病理特征及預后的關系，為探尋 ICC 的篩查和預后評估相關的生物學指標提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取 2015 年 3 月至 2018 年 3 月期間濮陽市安陽地區醫院收治住院并行手術治療的 ICC 患者 94 例作為研究對象，其中男 61 例，女 33 例；年齡 50～69 歲，中位年齡 60 歲；腫瘤直徑≥5 cm 27 例，<5 cm 67 例；腫瘤位于肝左葉 40 例，肝右葉 27 例，橫跨肝左右葉 27 例。按照 WHO 病理分級標準[11]，高分化 17 例，中分化 46 例，低分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期 25 例，Ⅱ期 31 例，Ⅲ期 28 例，Ⅳ期 10 例；46 例有淋巴結轉移，神經受累 17 例，微血管侵犯 11 例，20 例存在腫瘤衛星灶，18 例伴肝硬變。病例納入標準：① 完整切除腫物，經術后病理學檢查證實為 ICC，切緣陰性患者；② 臨床病理資料完整，所有患者術前均未行放化療、免疫療法、中醫中藥等治療；③ 患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書；④ 隨訪信息完整。排除標準：① 其他部位膽管癌轉移至肝內及合并肝細胞癌患者；② 術前腫瘤自發性破裂；③ 入院前有抗腫瘤治療史；④ 嚴重心肝腎功能不全者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。
1.2 主要試劑與儀器
TGR5 一抗（武漢益普生物科技有限公司，貨號：ATA38633），熱休克蛋白 75 一抗（北京安諾論生物科技有限公司，貨號：APR07835G），SP 免疫組織化學試劑盒（上海瑞楚生物科技有限公司，貨號：R200821），DAB 顯色劑（上海煊雅生物科技有限公司，貨號：XY-MY-0075），BCA 試劑盒、SDS-PAGE 膠制備試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY12001A、ZD304-01），半干式電轉膜儀（北京賽百奧科技有限公司），化學發光儀（濟南歐萊博電子商務有限公司，型號：CIA1800）。
1.3 研究方法
1.3.1 樣本的采集與保存
ICC 患者經手術切除ICC組織，同時取其對應的癌旁組織（距腫瘤邊緣 2 cm 以上且病理檢查未發現癌細胞），組織標本取出后先切取約 1.0 cm 見方的組織塊置入 15 mL 中性甲醛液中固定約 12 h，實驗脫水劑將樣本脫水，后將組織樣本用石蠟包埋切片、HE 染色，經病理專家復診及組織定位后，再用切片機連續切片，厚度為 4 μm，制作成組織切片保存于液氮罐中儲存備用。切取后剩余的組織標本立即置入 –80 ℃ 冰箱凍存備用。
1.3.2 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達檢測
采用免疫組織化學（EnVision）SP 法。取 1.3.1 制備的石蠟切片，常規脫蠟至水，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行，DAB 顯色后在顯微鏡下控制顯色強度，并蘇木精復染，脫水、封片，最后鏡檢采集數據。以 PBS 代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片為陽性對照。染色結果由兩位對病理資料不知情的病理科醫師進行判定，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 陽性表達評定標準參照文獻 [12] 的定性法進行評定，即于光鏡下隨機選取 5 個視野（200 倍），以每個視野計數 100 個癌細胞為基數，按照陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞占比≤10% 為 1 分，10%～50% 為 2 分，50%～75% 為 3 分，≥75% 為 4 分；按染色強度評分：鏡下觀察膽管上皮細胞細胞質和細胞核內出現棕黃色或褐色顆粒，其中淺黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；最后以兩項評分的乘積作為最終判定結果，0～2 分判為陰性，≥3 分判為陽性。
1.3.3 Western blot（WB）法檢測癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 相對表達量
取 1.3.1 中凍存樣本，嚴格按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，并采用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，取 20 μL 樣品上樣，使用 SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白，半干式電轉膜儀轉移蛋白至 PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉，加入 TGR5（稀釋比 1∶2 000）、熱休克蛋白 75（稀釋比 1∶2 000）和 GAPDH 內參抗體（稀釋比 1∶3 000），4 ℃ 孵育過夜，加入二抗 IgG（稀釋比 1∶5 000），室溫孵育 2 h，用增強化學發光法顯色，以化學發光儀觀察條帶并拍照，并以 Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達量。
1.4 隨訪
納入本研究的患者術后均進行常規隨訪，術后 1 年內每 3 個月隨訪 1 次，1 年后每 6 個月隨訪 1 次，隨訪時進行相關實驗室及影像學檢查，主要通過腹部 CT 和 MRI 檢查診斷復發。如患者出現復發，則采用手術切除、局部放射治療、全身化學治療、動脈栓塞等措施控制病情發展。隨訪截止日期為 2021 年 3 月 31 日，以術后生存情況作為終點事件，將生存患者作為預后良好組，將死亡患者作為預后不良組進行分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計學軟件進行統計學分析。計數資料比較采用配對樣本或成組樣本χ2檢驗；計量資料符合正態分布，組間比較采用配對樣本 t 檢驗。繪制 Kaplan-Meier 生存曲線并行 log-rank 檢驗，分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達與 ICC 患者預后的關系；采用多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者不良預后的危險因素；ROC 曲線分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達對 ICC 患者預后的診斷價值，曲線下面積（AUC）比較行Z檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ICC 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達情況
免疫組織化學結果顯示，TGR5 蛋白陽性表達主要定位于細胞膜和細胞質，熱休克蛋白 75 陽性表達主要定位于細胞質中，均呈淺黃色或棕褐色顆粒狀（圖 1a～1d）。按照染色評分標準評價 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的免疫評分，發現 ICC 癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 未表達或陽性表達較少，其表達陽性率分別為 13.83%（13/94）和 11.70%（11/94）；在癌組織中 TGR5 蛋白表達陽性率為 79.79%（75/94），熱休克蛋白 75 表達陽性率為 84.04%（79/94），均高于癌旁組織中的表達（χ2=82.122，P<0.001；χ2=98.561，P<0.001）。WB 結果（圖 1e、1f）顯示：癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。
圖1
示 ICC 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達檢測結果
a、b：分別示癌旁組織（a）和 ICC 癌組織（b）中 TGR5 蛋白表達結果（免疫組織化學 SP ×200）；c、d：分別示癌旁組織（c）和 ICC 癌組織（d）中熱休克蛋白 75 表達結果（免疫組織化學 SP ×200）；e、f：示 WB 法檢測 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達的電泳圖（e）及其定量結果（f），e 圖中 1 代表癌組織，2 代表癌旁組織
2.2 ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況與患者臨床病理特征的關系
ICC 癌組織中 TGR5 蛋白的表達狀態與患者年齡、腫瘤部位、淋巴結轉移、神經受累和微血管侵犯無關（P>0.05），但與患者性別、腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期、衛星灶和肝硬變相關（P<0.05）。ICC 癌組織中熱休克蛋白 75 的表達狀態與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移和微血管侵犯無關（P>0.05），但與腫瘤直徑、TNM 分期、神經受累、衛星灶和肝硬變相關（P<0.05）。見表 1。
表1
ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 不同預后情況 ICC 患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征
根據隨訪結果將本組 94 例 ICC 患者分為預后不良組（已死亡者，58 例）和預后良好組（仍生存者，36 例），分析 2 組患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征，結果見表 2。由表 2 可見，2 組患者在年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移和神經受累方面比較其差異無統計學意義（P>0.05），而 2 組患者在性別、腫瘤直徑、TNM 分期、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況方面比較差有統計學意義（P<0.05）。
表2
不同預后情況 ICC 患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征比較（例）
進一步繪制 Kaplan-Meier 生存曲線分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達與 ICC 患者預后的關系，結果顯示 TGR5 蛋白表達陽性者的累積 3 年總生存率（32.00%）低于 TGR5 蛋白表達陰性者（63.16%），χ2=6.228，P=0.013；熱休克蛋白 75 表達陽性者的累積 3 年總生存率（32.91%）也低于熱休克蛋白 75 表達陰性者（66.67%），χ2=6.079，P=0.014。具體見圖 2a、2b。
圖2
示 ICC 癌組織中 TGR5 蛋白（a）和熱休克蛋白 75（b）不同表達狀態患者的生存曲線，以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平對 ICC 患者預后診斷的 ROC 曲線（c）
2.4 多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者預后不良的危險因素
以預后作為應變量（預后不良=1，預后良好=0），以 TGR5 蛋白、熱休克蛋白 75、TNM 分期、淋巴結轉移、衛星灶、肝硬變為自變量進行多因素 Cox 比例風險回歸模型分析，其結果顯示：TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有衛星灶和肝硬變為 ICC 患者預后不良的危險因素（P<0.05），見表 3。
表3
多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者預后不良的危險因素
2.5 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平對 ICC 預后的診斷價值
以癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平繪制 ROC 曲線，約登指數最大值時對應的值為截斷值。其結果顯示：以 TGR5 蛋白表達水平 0.932 為截斷值，其診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.783，95%CI為（0.691，0.874），P<0.001，敏感度為 72.4%，特異度為 72.2%；以熱休克蛋白 75 表達水平 0.756 為截斷值，其診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.805，95%CI為（0.717，0.892），P<0.001，敏感度為 84.4%，特異度為 63.9%；二者聯合診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.884，95%CI為（0.818，0.949），P<0.001，敏感度為 79.3%，特異度為 83.3%；二者聯合診斷 ICC 患者預后不良的AUC高于 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 單獨診斷者（Z=2.848、P=0.004；Z=2.326、P=0.020），具體見圖 2c。
3 討論
ICC 是一種高度惡性的原發性肝臟惡性腫瘤，多數 ICC 患者缺乏典型癥狀，常在體檢進行影像學檢查時發現肝內占位性病變[13]，在肝硬變肝臟中，ICC 的鑒別診斷相對困難。隨著篩查項目的改進及醫療水平的提高，ICC 的診斷率有所提高。根治性腫瘤切除是幫助 ICC 患者獲得長期生存最有效的治療手段。病因學和流行病學研究[14]顯示，肝硬變、病毒性肝炎（乙肝、丙肝）、原發性硬化性膽管炎及肝內膽管結石可作為 ICC 的高危風險因素。ICC 主要通過淋巴系統進行腫瘤遠處播散，有研究[15]發現，腫瘤分化程度、腫瘤直徑等對患者總體預后評價具有一定的臨床價值，但僅以其評估患者預后較片面，且由于病因、治療等情況的不同，臨床預后有所差異。因此，尋找能更客觀、更簡便的評估 ICC 患者預后的生物學指標，對治療方案的制定及預后情況的改善十分重要。
TGR5 受體由 330 個氨基酸組成，包括 7 個跨膜結構域，基因定位于人染色體 2q35，在靜息狀態下由 α、β 和 γ 亞基組成，一旦與膽汁酸結合后，分離的 α 蛋白亞基激活腺苷酸環化酶（AC），誘導環磷酸腺苷（cAMP）產生增加，激活蛋白激酶 A（PKA）途徑及下游信號通路[16-18]。在胃腺癌研究[19]中發現，TGR5 在大部分胃腸型腺癌中過表達，且其在細胞膜和細胞質內中度到強度表達與胃腺癌患者生存率下降有關。TGR5 在 ICC 中的研究較少，本研究免疫組織化學染色結果顯示，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白表達陽性率為 79.79%，高于在癌旁組織中的表達；WB 檢測結果顯示，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白相對表達量高于癌旁組織，提示 TGR5 可能與 ICC 的發生有關，是 ICC 癌組織演變中的重要因子。
熱休克蛋白 75 作為一種線粒體常駐蛋白，分子量約為 74×103，編碼基因定位于人染色體 5q31.1，具有 46 個氨基酸，熱休克蛋白 75 與熱激活蛋白具有高度相似序列，被歸為熱休克蛋白 70 家族伴侶蛋白成員之一[20-22]。熱休克蛋白 75 具有蛋白質修飾、免疫應答、參與胞內運輸、受體的內化等功能[23]。有研究[24]顯示，熱休克蛋白 75 參與了細胞生長周期的調控、外界應激、腫瘤發生等多種生物學過程，在多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤轉移密切相關。在結直腸癌中的研究[25]發現，熱休克蛋白 75 的高表達與患者預后不良密切相關。另有研究[26]發現，肝癌患者術后早期復發與無復發患者相比，熱休克蛋白 75 表達增高，熱休克蛋白 75 高表達與肝癌的 TNM 分期及靜脈浸潤密切相關。本研究結果顯示，ICC 癌組織中熱休克蛋白 75 蛋白表達陽性率高于癌旁組織；WB 檢測結果顯示，癌組織中熱休克蛋白 75 蛋白相對表達量也高于癌旁組織，提示熱休克蛋白 75 可能與 ICC 的發生有關，熱休克蛋白 75 可能作為“分子伴侶”參與調節和穩定癌細胞的異常增殖過程。
另外，本研究結果還顯示，預后不良組和預后良好組 ICC 患者在性別、腫瘤直徑、TNM 分期、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況方面比較差異均有統計學意義，提示腫瘤直徑>5 cm 患者預后不良風險較大，腫瘤直徑大小與手術切緣及淋巴結轉移情況有關，從而對患者預后產生影響。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性患者的累積 3 年總生存率均低于 TGR5 蛋白及熱休克蛋白 75 表達陰性患者；進一步進行多因素 Cox 比例風險回歸模型分析顯示，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性、TNM Ⅲ+Ⅳ期以及有衛星灶和肝硬變均為 ICC 患者預后不良的危險因素，提示 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達可作為對 ICC 患者預后不良預測的輔助指標。另 ROC 結果顯示，TGR5 蛋白表達水平診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.783，熱休克蛋白 75 表達水平診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.805，二者聯合診斷的AUC為 0.884，聯合診斷價值高于二者單獨診斷，提示二者聯合診斷對 ICC 患者預后不良具有一定預測價值，可作為預測 ICC 患者預后不良情況的潛在生物學指標。
綜上所述，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 高表達，是 ICC 患者預后不良的危險因素，并對預后具有一定的預測價值。但本研究結果僅能得出癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達可能與 ICC 的發生有關，二者與 ICC 發生的因果關系尚不能明確，在今后的研究中需將其作為重點繼續探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙帥華負責本研究的設計、試驗、數據統計及論文寫作；張先舟、蒙博和曹勝利共同參與完成本研究的設計、試驗、數據統計及論文修改。
倫理聲明：該研究通過了濮陽市安陽地區醫院倫理委員會的審批（批文編號：20190315-7526）
肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常見的原發性肝臟惡性腫瘤，起源于肝內膽管上皮細胞，生長在肝內二級分支膽管以上部位，占所有原發性肝癌的 10%～15%，且其發病率在全球范圍內持續攀升[1-2]。ICC 與肝細胞肝癌的臨床表現有較大區別，以早期淋巴結及肝內轉移為特征，其侵襲轉移能力更強。目前手術切除仍是 ICC 的首選且最有效的治療方法，但即使能夠手術切除腫瘤的患者，由于術后早期復發、腫瘤生長迅速、遠處轉移等因素，患者預后較差，患者 3 年及5 年生存率只有 30% 和 18%[3-4]。因此，探尋 ICC 細胞侵襲轉移的關鍵分子對篩查及防治腫瘤復發和改善治療效果具有重要的臨床意義。膽汁酸 G 蛋白偶聯受體 5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）也被稱為 G 蛋白耦聯膽汁酸受體 1（G-protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），是 G 蛋白偶聯受體家族的成員，在機體內廣泛表達，在肝臟、腸道和免疫細胞中表達較高[5]。TGR5 能被膽汁酸激活，其激活后具有多種生物學功能，在調節糖類、脂類、能量代謝以及膽汁代謝中發揮重要作用[6]。已有研究[7]證實，TGR5 參與消化系統惡性腫瘤的發生，可作為消化系統惡性腫瘤的潛在治療靶點。熱休克蛋白 75 是熱休克蛋白 70 家族蛋白的一種，廣泛存在于細胞器內，具有調節細胞分化及腫瘤發展的作用[8]。有研究[9]發現，熱休克蛋白 75 在乳腺癌、肝癌和膀胱癌中呈高表達，且具有癌基因特征，與腫瘤的發生發展密切相關。在膽管癌的研究中發現，TGR5 通過結合并上調熱休克蛋白 75 促進膽管癌細胞增殖[10]，推測 TGR5 與熱休克蛋白 75 可能與 ICC 的預后有關。本研究探討了 TGR5 和熱休克蛋白 75 與 ICC 患者病理特征及預后的關系，為探尋 ICC 的篩查和預后評估相關的生物學指標提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取 2015 年 3 月至 2018 年 3 月期間濮陽市安陽地區醫院收治住院并行手術治療的 ICC 患者 94 例作為研究對象，其中男 61 例，女 33 例；年齡 50～69 歲，中位年齡 60 歲；腫瘤直徑≥5 cm 27 例，<5 cm 67 例；腫瘤位于肝左葉 40 例，肝右葉 27 例，橫跨肝左右葉 27 例。按照 WHO 病理分級標準[11]，高分化 17 例，中分化 46 例，低分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期 25 例，Ⅱ期 31 例，Ⅲ期 28 例，Ⅳ期 10 例；46 例有淋巴結轉移，神經受累 17 例，微血管侵犯 11 例，20 例存在腫瘤衛星灶，18 例伴肝硬變。病例納入標準：① 完整切除腫物，經術后病理學檢查證實為 ICC，切緣陰性患者；② 臨床病理資料完整，所有患者術前均未行放化療、免疫療法、中醫中藥等治療；③ 患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書；④ 隨訪信息完整。排除標準：① 其他部位膽管癌轉移至肝內及合并肝細胞癌患者；② 術前腫瘤自發性破裂；③ 入院前有抗腫瘤治療史；④ 嚴重心肝腎功能不全者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。
1.2 主要試劑與儀器
TGR5 一抗（武漢益普生物科技有限公司，貨號：ATA38633），熱休克蛋白 75 一抗（北京安諾論生物科技有限公司，貨號：APR07835G），SP 免疫組織化學試劑盒（上海瑞楚生物科技有限公司，貨號：R200821），DAB 顯色劑（上海煊雅生物科技有限公司，貨號：XY-MY-0075），BCA 試劑盒、SDS-PAGE 膠制備試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY12001A、ZD304-01），半干式電轉膜儀（北京賽百奧科技有限公司），化學發光儀（濟南歐萊博電子商務有限公司，型號：CIA1800）。
1.3 研究方法
1.3.1 樣本的采集與保存
ICC 患者經手術切除ICC組織，同時取其對應的癌旁組織（距腫瘤邊緣 2 cm 以上且病理檢查未發現癌細胞），組織標本取出后先切取約 1.0 cm 見方的組織塊置入 15 mL 中性甲醛液中固定約 12 h，實驗脫水劑將樣本脫水，后將組織樣本用石蠟包埋切片、HE 染色，經病理專家復診及組織定位后，再用切片機連續切片，厚度為 4 μm，制作成組織切片保存于液氮罐中儲存備用。切取后剩余的組織標本立即置入 –80 ℃ 冰箱凍存備用。
1.3.2 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達檢測
采用免疫組織化學（EnVision）SP 法。取 1.3.1 制備的石蠟切片，常規脫蠟至水，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行，DAB 顯色后在顯微鏡下控制顯色強度，并蘇木精復染，脫水、封片，最后鏡檢采集數據。以 PBS 代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片為陽性對照。染色結果由兩位對病理資料不知情的病理科醫師進行判定，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 陽性表達評定標準參照文獻 [12] 的定性法進行評定，即于光鏡下隨機選取 5 個視野（200 倍），以每個視野計數 100 個癌細胞為基數，按照陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞占比≤10% 為 1 分，10%～50% 為 2 分，50%～75% 為 3 分，≥75% 為 4 分；按染色強度評分：鏡下觀察膽管上皮細胞細胞質和細胞核內出現棕黃色或褐色顆粒，其中淺黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；最后以兩項評分的乘積作為最終判定結果，0～2 分判為陰性，≥3 分判為陽性。
1.3.3 Western blot（WB）法檢測癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 相對表達量
取 1.3.1 中凍存樣本，嚴格按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，并采用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，取 20 μL 樣品上樣，使用 SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白，半干式電轉膜儀轉移蛋白至 PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉，加入 TGR5（稀釋比 1∶2 000）、熱休克蛋白 75（稀釋比 1∶2 000）和 GAPDH 內參抗體（稀釋比 1∶3 000），4 ℃ 孵育過夜，加入二抗 IgG（稀釋比 1∶5 000），室溫孵育 2 h，用增強化學發光法顯色，以化學發光儀觀察條帶并拍照，并以 Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達量。
1.4 隨訪
納入本研究的患者術后均進行常規隨訪，術后 1 年內每 3 個月隨訪 1 次，1 年后每 6 個月隨訪 1 次，隨訪時進行相關實驗室及影像學檢查，主要通過腹部 CT 和 MRI 檢查診斷復發。如患者出現復發，則采用手術切除、局部放射治療、全身化學治療、動脈栓塞等措施控制病情發展。隨訪截止日期為 2021 年 3 月 31 日，以術后生存情況作為終點事件，將生存患者作為預后良好組，將死亡患者作為預后不良組進行分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計學軟件進行統計學分析。計數資料比較采用配對樣本或成組樣本χ2檢驗；計量資料符合正態分布，組間比較采用配對樣本 t 檢驗。繪制 Kaplan-Meier 生存曲線并行 log-rank 檢驗，分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達與 ICC 患者預后的關系；采用多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者不良預后的危險因素；ROC 曲線分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達對 ICC 患者預后的診斷價值，曲線下面積（AUC）比較行Z檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ICC 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達情況
免疫組織化學結果顯示，TGR5 蛋白陽性表達主要定位于細胞膜和細胞質，熱休克蛋白 75 陽性表達主要定位于細胞質中，均呈淺黃色或棕褐色顆粒狀（圖 1a～1d）。按照染色評分標準評價 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的免疫評分，發現 ICC 癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 未表達或陽性表達較少，其表達陽性率分別為 13.83%（13/94）和 11.70%（11/94）；在癌組織中 TGR5 蛋白表達陽性率為 79.79%（75/94），熱休克蛋白 75 表達陽性率為 84.04%（79/94），均高于癌旁組織中的表達（χ2=82.122，P<0.001；χ2=98.561，P<0.001）。WB 結果（圖 1e、1f）顯示：癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。
圖1
示 ICC 癌組織及其癌旁組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達檢測結果
a、b：分別示癌旁組織（a）和 ICC 癌組織（b）中 TGR5 蛋白表達結果（免疫組織化學 SP ×200）；c、d：分別示癌旁組織（c）和 ICC 癌組織（d）中熱休克蛋白 75 表達結果（免疫組織化學 SP ×200）；e、f：示 WB 法檢測 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達的電泳圖（e）及其定量結果（f），e 圖中 1 代表癌組織，2 代表癌旁組織
2.2 ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況與患者臨床病理特征的關系
ICC 癌組織中 TGR5 蛋白的表達狀態與患者年齡、腫瘤部位、淋巴結轉移、神經受累和微血管侵犯無關（P>0.05），但與患者性別、腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期、衛星灶和肝硬變相關（P<0.05）。ICC 癌組織中熱休克蛋白 75 的表達狀態與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移和微血管侵犯無關（P>0.05），但與腫瘤直徑、TNM 分期、神經受累、衛星灶和肝硬變相關（P<0.05）。見表 1。
表1
ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達與患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 不同預后情況 ICC 患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征
根據隨訪結果將本組 94 例 ICC 患者分為預后不良組（已死亡者，58 例）和預后良好組（仍生存者，36 例），分析 2 組患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征，結果見表 2。由表 2 可見，2 組患者在年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移和神經受累方面比較其差異無統計學意義（P>0.05），而 2 組患者在性別、腫瘤直徑、TNM 分期、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況方面比較差有統計學意義（P<0.05）。
表2
不同預后情況 ICC 患者的 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況及其臨床病理特征比較（例）
進一步繪制 Kaplan-Meier 生存曲線分析 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達與 ICC 患者預后的關系，結果顯示 TGR5 蛋白表達陽性者的累積 3 年總生存率（32.00%）低于 TGR5 蛋白表達陰性者（63.16%），χ2=6.228，P=0.013；熱休克蛋白 75 表達陽性者的累積 3 年總生存率（32.91%）也低于熱休克蛋白 75 表達陰性者（66.67%），χ2=6.079，P=0.014。具體見圖 2a、2b。
圖2
示 ICC 癌組織中 TGR5 蛋白（a）和熱休克蛋白 75（b）不同表達狀態患者的生存曲線，以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平對 ICC 患者預后診斷的 ROC 曲線（c）
2.4 多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者預后不良的危險因素
以預后作為應變量（預后不良=1，預后良好=0），以 TGR5 蛋白、熱休克蛋白 75、TNM 分期、淋巴結轉移、衛星灶、肝硬變為自變量進行多因素 Cox 比例風險回歸模型分析，其結果顯示：TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有衛星灶和肝硬變為 ICC 患者預后不良的危險因素（P<0.05），見表 3。
表3
多因素 Cox 比例風險回歸模型分析 ICC 患者預后不良的危險因素
2.5 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平對 ICC 預后的診斷價值
以癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達水平繪制 ROC 曲線，約登指數最大值時對應的值為截斷值。其結果顯示：以 TGR5 蛋白表達水平 0.932 為截斷值，其診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.783，95%CI為（0.691，0.874），P<0.001，敏感度為 72.4%，特異度為 72.2%；以熱休克蛋白 75 表達水平 0.756 為截斷值，其診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.805，95%CI為（0.717，0.892），P<0.001，敏感度為 84.4%，特異度為 63.9%；二者聯合診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.884，95%CI為（0.818，0.949），P<0.001，敏感度為 79.3%，特異度為 83.3%；二者聯合診斷 ICC 患者預后不良的AUC高于 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 單獨診斷者（Z=2.848、P=0.004；Z=2.326、P=0.020），具體見圖 2c。
3 討論
ICC 是一種高度惡性的原發性肝臟惡性腫瘤，多數 ICC 患者缺乏典型癥狀，常在體檢進行影像學檢查時發現肝內占位性病變[13]，在肝硬變肝臟中，ICC 的鑒別診斷相對困難。隨著篩查項目的改進及醫療水平的提高，ICC 的診斷率有所提高。根治性腫瘤切除是幫助 ICC 患者獲得長期生存最有效的治療手段。病因學和流行病學研究[14]顯示，肝硬變、病毒性肝炎（乙肝、丙肝）、原發性硬化性膽管炎及肝內膽管結石可作為 ICC 的高危風險因素。ICC 主要通過淋巴系統進行腫瘤遠處播散，有研究[15]發現，腫瘤分化程度、腫瘤直徑等對患者總體預后評價具有一定的臨床價值，但僅以其評估患者預后較片面，且由于病因、治療等情況的不同，臨床預后有所差異。因此，尋找能更客觀、更簡便的評估 ICC 患者預后的生物學指標，對治療方案的制定及預后情況的改善十分重要。
TGR5 受體由 330 個氨基酸組成，包括 7 個跨膜結構域，基因定位于人染色體 2q35，在靜息狀態下由 α、β 和 γ 亞基組成，一旦與膽汁酸結合后，分離的 α 蛋白亞基激活腺苷酸環化酶（AC），誘導環磷酸腺苷（cAMP）產生增加，激活蛋白激酶 A（PKA）途徑及下游信號通路[16-18]。在胃腺癌研究[19]中發現，TGR5 在大部分胃腸型腺癌中過表達，且其在細胞膜和細胞質內中度到強度表達與胃腺癌患者生存率下降有關。TGR5 在 ICC 中的研究較少，本研究免疫組織化學染色結果顯示，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白表達陽性率為 79.79%，高于在癌旁組織中的表達；WB 檢測結果顯示，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白相對表達量高于癌旁組織，提示 TGR5 可能與 ICC 的發生有關，是 ICC 癌組織演變中的重要因子。
熱休克蛋白 75 作為一種線粒體常駐蛋白，分子量約為 74×103，編碼基因定位于人染色體 5q31.1，具有 46 個氨基酸，熱休克蛋白 75 與熱激活蛋白具有高度相似序列，被歸為熱休克蛋白 70 家族伴侶蛋白成員之一[20-22]。熱休克蛋白 75 具有蛋白質修飾、免疫應答、參與胞內運輸、受體的內化等功能[23]。有研究[24]顯示，熱休克蛋白 75 參與了細胞生長周期的調控、外界應激、腫瘤發生等多種生物學過程，在多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤轉移密切相關。在結直腸癌中的研究[25]發現，熱休克蛋白 75 的高表達與患者預后不良密切相關。另有研究[26]發現，肝癌患者術后早期復發與無復發患者相比，熱休克蛋白 75 表達增高，熱休克蛋白 75 高表達與肝癌的 TNM 分期及靜脈浸潤密切相關。本研究結果顯示，ICC 癌組織中熱休克蛋白 75 蛋白表達陽性率高于癌旁組織；WB 檢測結果顯示，癌組織中熱休克蛋白 75 蛋白相對表達量也高于癌旁組織，提示熱休克蛋白 75 可能與 ICC 的發生有關，熱休克蛋白 75 可能作為“分子伴侶”參與調節和穩定癌細胞的異常增殖過程。
另外，本研究結果還顯示，預后不良組和預后良好組 ICC 患者在性別、腫瘤直徑、TNM 分期、微血管侵犯、衛星灶、肝硬變以及 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達情況方面比較差異均有統計學意義，提示腫瘤直徑>5 cm 患者預后不良風險較大，腫瘤直徑大小與手術切緣及淋巴結轉移情況有關，從而對患者預后產生影響。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性患者的累積 3 年總生存率均低于 TGR5 蛋白及熱休克蛋白 75 表達陰性患者；進一步進行多因素 Cox 比例風險回歸模型分析顯示，TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達陽性、TNM Ⅲ+Ⅳ期以及有衛星灶和肝硬變均為 ICC 患者預后不良的危險因素，提示 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 表達可作為對 ICC 患者預后不良預測的輔助指標。另 ROC 結果顯示，TGR5 蛋白表達水平診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.783，熱休克蛋白 75 表達水平診斷 ICC 患者預后不良的AUC為 0.805，二者聯合診斷的AUC為 0.884，聯合診斷價值高于二者單獨診斷，提示二者聯合診斷對 ICC 患者預后不良具有一定預測價值，可作為預測 ICC 患者預后不良情況的潛在生物學指標。
綜上所述，ICC 癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 高表達，是 ICC 患者預后不良的危險因素，并對預后具有一定的預測價值。但本研究結果僅能得出癌組織中 TGR5 蛋白和熱休克蛋白 75 的表達可能與 ICC 的發生有關，二者與 ICC 發生的因果關系尚不能明確，在今后的研究中需將其作為重點繼續探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙帥華負責本研究的設計、試驗、數據統計及論文寫作；張先舟、蒙博和曹勝利共同參與完成本研究的設計、試驗、數據統計及論文修改。
倫理聲明：該研究通過了濮陽市安陽地區醫院倫理委員會的審批（批文編號：20190315-7526）
