引用本文： 劉偉偉, 方征, 夏咸軍, 柏楊, 謝偉選, 濮毅峰, 羅昆侖. 大鼠 ALPPS 一期術后 Lgr5 蛋白表達變化及其與肝臟再生的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(10): 1275-1279. doi: 10.7507/1007-9424.202102032 復制
肝部分切除術是目前治療肝腫瘤最重要的方法[1-2]，但是肝切除術后剩余肝體積不足限制了擴大肝切除術。為了提高手術切除率，1990 年 Makuuchi 等[3]首次將門靜脈栓塞（portal vein embolism，PVE）聯合肝臟切除應用于臨床。PVE 或門靜脈結扎（portal vein ligation，PVL）的應用使部分患者獲得了手術機會。但是 PVE 或 PVL 術后肝臟增生需要較長的時間（4～8 周），在這期間腫瘤可能進展且仍有部分患者殘余肝臟增生不足而無法行二步肝切除術[4-5]。2007 年德國 Schlitt 對肝門部膽管癌根治行右三葉切除時發現剩余肝體積不足，于是先離斷肝臟、結扎門靜脈右支，6～10 d 后二期切除患側肝臟，這種方法后來由德國的 Schnitzbauer 等[6]2012 年報道且被正式命名為聯合肝臟離斷和門靜脈結扎分期肝切除術 (associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS），隨即也引起國內肝膽外科醫生的關注[7-8]。但是有臨床病例研究[9-10]報道，ALPPS 術后的并發癥率和死亡率較高，而且目前 ALPPS 促進肝增生的機制尚不明確。近年來有研究[11-12]發現，在肝臟、胰腺、胃等器官中 Lgr5 蛋白表達陽性的組織干細胞在損傷修復中對組織器官再生發揮重要作用。基于此，本研究通過建立 ALPPS 手術動物實驗模型，探究 Lgr5 蛋白在大鼠 ALPPS 術后肝再生過程中的表達變化及意義。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
健康雄性 SD 大鼠（200～240 g）120 只，購自于江蘇省血吸蟲病防治研究所。在標準飼料、水及自然光下喂養，自由飲食水，光照 12 h/d。Ki-67 抗體購自于北京中杉金橋有限公司，Lgr5 抗體購自于美國 LSBio 公司。中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院提供實驗外科手術器械。
1.2 動物分組及手術方法
采用隨機數字表法將大鼠分為 ALPPS 組、PVL 組、假手術（sham operation，SO）組 3 組，每組 40 只大鼠。所有大鼠采用 10% 水合氯醛（3.0～3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取正中切口進腹。SO 組開腹后游離大鼠肝葉肝周韌帶、游離肝葉擬結扎處的門靜脈并使之與伴行的肝膽管與肝動脈之間有較充分的空隙，而后關腹；PVL 組分離出供應肝右葉門靜脈支和供應左外葉及中葉左支的門靜脈支，分別用 4-0 絲線結扎，將尾狀葉切除；ALPPS 組在 PVL 組的基礎上，分離并結扎左外葉、左中葉支、肝右葉門靜脈支，保留右中葉所有管道，然后切除尾狀葉（圖 1a），最后在左中葉和右中葉缺血帶處離斷大鼠肝臟（圖 1b、1c）。術后檢查無活動性出血后間斷縫合關腹。所有手術均為清潔手術，定時觀察 3 組動物的存活情況。切除的尾狀葉約占肝臟 10%，結扎肝臟約占全肝質量的 70%[3]。
圖1
示主要結果展示圖
a：肝左外葉、左中葉、右葉 PVL 及切除尾狀葉；b：沿著缺血帶逐步壓榨進行肝臟離斷；c：離斷后的肝臟；d：3 組術后肝臟再生率（與 SO 組相應時間點比較，*
1.3 標本收集
各組大鼠分別在術后第 1、2、4、7 天時取材，每個時間點 10 只大鼠。麻醉后進腹，一次性注射器于肝下下腔靜脈抽血 5～6 mL 后即可處死大鼠，留取大鼠下腔靜脈血液 4 mL，3 000 r/min（r=5.9 cm）離心 5 min 分離血清于–80 ℃ 保存，以備檢測各時點谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）情況；分離出肝右中葉留取肝臟標本并稱取大鼠肝右中葉質量，然后剪取所需標本于 4% 甲醛固定，24 h 后常規石蠟包埋切片。
1.4 檢測方法
1.4.1 肝功能檢測
血清收集后采用全自動生化儀檢測 ALT、AST 水平。
1.4.2 肝臟增生率的計算
保留側肝葉肝臟再生率（%）計算公式為“（WA?WI）/WI×100%”，其中 WA 為各時點取材時肝右中葉質量，WI 為術前大鼠肝右中葉質量（肝右中葉 WI 約占大鼠體質量的 0.76%）[13]。
1.4.3 肝臟組織病理學觀察
切取肝臟組織石蠟切片，每張厚約 4 μm，HE 染色。
1.4.4 免疫組織化學 SP 法檢測 Ki-67 及 Lgr5 蛋白在肝組織中的表達情況
Ki-67 和 Lgr5 蛋白工作濃度分別為 1∶100、1∶150。試劑公司提供的陽性標本作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。Ki-67 表達陽性的定性判定：細胞核呈界限清楚的棕黃色–黃色反應為陽性；其半定量結果計算方法：每張切片隨機選擇 5 個視野，在高倍鏡（×400）下計數視野內 Ki-67 染色陽性細胞數占肝細胞總數的百分比即是 Ki-67 蛋白表達陽性率，然后取其均數。Lgr5 蛋白表達陽性的定性判定：細胞核或細胞漿呈界限清楚的棕黃色–黃色反應為陽性；其半定量計算方法：每張切片隨機選擇 5 個視野，在高倍鏡（×400）下采圖后進行分析，采圖時將數碼相機相關參數固定，用 IPP6.0 醫學圖像專業分析軟件測定 Lgr5 陽性染色部位的吸光度值表示Lgr5 蛋白相對表達量，取其均數。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行分析。用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗計量數據是否符合正態分布，符合正態分布者采用均數±標準差（
±s）表示并采用單因素方差分析進行多樣本均數比較（組內兩兩比較采用 SNK-q 檢驗）進行統計分析。采用 Pearson 相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肝臟大體形態變化及肝臟再生情況
ALPPS 術結扎側肝葉顏色變暗并逐漸開始萎縮，保留側肝葉占總肝質量比例隨時間推移而增加。肝臟再生率在 PVL 組和 ALPPS 組的第 1、2、4、7 天均高于 SO 組（P<0.05），其在第 4、7 天時 ALPPS 組高于 PVL 組（P<0.05），第 1、2 天時這 2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1d。
2.2 肝功能檢測結果
結果見圖 1e、1f。ALPPS 組和 PVL 組的 ALT 和 AST 水平在術后第 1、2 天時高于 SO 組（P<0.05），而其在第 4、7 天時比較差異均無統計學意義（P>0.05）；ALPPS 組的 ALT 和 AST 水平在術后第 1 天時高于 PVL 組（P<0.05），而其余時間點 2 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），即這 2 組的肝功能在術后第 4 天均可恢復正常。
2.3 肝臟組織的病理學改變
SO 組大鼠各時間點未見明顯核分裂；PVL 組術后第 1 天時大鼠肝右中葉肝細胞核數量少量增加（圖 1g），術后第 2、4 天時可見肝細胞核分裂，核分裂較 ALPPS 組弱；ALPPS 組術后第 1 天時大鼠肝右中葉肝細胞核數量明顯增多，核漿比例增高，可見肝細胞核分裂象（圖 1h），術后第 2、4 天時肝細胞核分裂活躍，第 7 天時僅有少量核分裂。
2.4 Ki-67 和 Lgr5 免疫組織化學檢測結果
Ki-67 蛋白陽性表達在細胞核呈棕黃色染色（圖 1i–1k）；Lgr5 蛋白陽性表達在細胞核或細胞漿呈界限清楚的棕黃色–黃色染色（圖 1l–1n）。Ki-67 蛋白表達陽性率和 Lgr5 蛋白相對表達量在 ALPPS 組和 PVL 組的第 1、2、4 天時均高于 SO 組（P<0.05），而在第 7 天時與 SO 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；其在 ALPPS 組的第 2 和 4 天時高于 PVL 組（P<0.05），其余時間點這 2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1o、1p。
2.5 Lgr5 蛋白相對表達量與 Ki-67 蛋白表達陽性率的相關性分析結果
相關性分析結果顯示，ALPPS 術后第 1、2、4、7 天時大鼠肝右中葉組織中 Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達呈正相關（r分別為 0.978、0.972、0.951、0.901，P值分別為<0.001、<0.001、<0.001、<0.001），散點圖見圖 1q–1t。
3 討論
足夠剩余肝體積是肝切除術的一個重要條件；正常肝臟行肝切除術后剩余肝體積要達到 25%、肝硬化患者至少要達到 40% 以上才可以維持代謝平衡[14]；臨床上 80% 的肝癌患者確診時已是中晚期，因此多數患者由于缺乏足夠剩余肝體積而失去手術機會[15]。既往研究[16]表明，PVL 或 PVE 后行二步肝切除術雖然取得了一定的效果，但由于術后肝增生需要較長時間，在此期間腫瘤可能進展且肝增生不足，導致無法行二期手術。ALPPS 的出現克服了 PVL 或 PVE 的不足，可以在短時間內促進剩余肝體積快速增大[17]，ALPPS 可使剩余肝體積在一期手術后 7 d 左右迅速增長 74%～99%，繼而行二期手術切除[6]。ALPPS 在短時間內快速促進殘肝再生，有效解決了剩余肝體積不足的問題，但同時 ALPPS 術后并發癥率和病死率較高且其再生機制不明確。有研究者們[18]對門靜脈血流動力學改變、生長因子與細胞因子等體液因素變化進行了探究，但確切機制仍有待進一步探究。近期研究發現，ALPPS 術后血管再生是殘肝再生的基礎[19]，Endocan 可能通過肝細胞生長因子/c-Met 途徑相互作用促進肝干細胞再生[20]，血流動力學改變促進殘肝再生[21]。
Lgr5 是 G 蛋白偶聯受體家族的一員，又名 HG38、FEX、GPR49[22]，其結構特點是細胞外區域包含 17 個富含亮氨酸的重復序列，一個信號肽以及高度保守的 7 次 α-螺旋跨膜區，其廣泛參與生物體內信號轉導[23]。Lgr5 曾被認為是孤兒受體，但近期有研究者[24]發現，Lgr5 能與配體 R-spondin 結合，進而激活 Wnt 信號通路，參與干細胞的分化發育和腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等過程。Lgr5 在如胃竇、毛囊、乳腺、卵巢等多種組織器官中可以作為組織干細胞的標志物，Lgr5 陽性細胞被作為一類腫瘤干細胞，促進腫瘤發生、發展和轉移[25-26]。Lgr5 蛋白表達陽性肝細胞具有干細胞屬性，可有效治療肝纖維化[27]，在體外進行類器官培養和誘導分化可形成類器官[28]。本研究通過分析 ALPPS 術后肝再生過程中 Lgr5 蛋白表達變化探究肝干細胞是否參與肝再生，結果顯示，ALPPS 術后在中央靜脈周圍 Lgr5 蛋白活化表達，其參與了術后的肝臟再生；PVL 術后 Lgr5 也出現表達，但沒有 ALPPS 術后表達強烈，大鼠 ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達變化和術后肝再生率、肝臟病理組織核分裂象的變化相吻合；Ki-67 表達范圍覆蓋除 G0 期以外各增殖期細胞，是一種增殖細胞核相關抗原，能夠很好地反映細胞處于增殖狀態[29-30]。本研究中大鼠肝臟 ALPPS 術后第 1 天即可見較多 Ki-67 陽性細胞，在觀察范圍內術后第 2 天達到峰值，出現大量陽性細胞，第 4 天陽性細胞減少，第 7 天僅有少量表達，大鼠肝臟 Lgr5 蛋白表達在術后第 1、2、4、7 天與 Ki-67 蛋白表達陽性率呈正相關，相關系數均超過0.9（均P<0.001），結果提示，Lgr5 與 ALPPS 術后殘肝再生密切相關。有研究[28]發現，Lgr5 蛋白表達陽性的肝細胞可在體外培養為肝組織；Kuijk 等[31]報道肝干細胞的可能標志物是 Lgr5，并且干細胞需要 Wnt 蛋白的維持；ALPPS 術后殘肝中央靜脈周圍 Wnt2 呈高表達[32]，Lgr5 是 Wnt 信號通路的靶向基因，能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路[25]；結合本實驗結果提示，大鼠 ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達與 ALPPS 術后肝再生密切相關；ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達陽性細胞增多，Lgr5 蛋白表達陽性細胞是肝干細胞，進一步表明 ALPPS 術后肝干細胞可能參與了肝臟再生。
總之，從本研究初步結果看，通過建立 ALPPS 大鼠模型檢測肝再生過程中 Lgr5 蛋白表達變化提示了其與殘肝再生密切相關，表明 ALPPS 術后肝干細胞可能參與了肝臟再生。但本實驗仍有一定的局限性：大鼠模型與人類肝的再生機制可能不同；正常肝臟與腫瘤肝臟有差異；Lgr5 參與肝再生的機制有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉偉偉進行實驗實施、數據采集分析和文章撰寫修改；方征、夏咸軍對文章的知識性內容作批評性審閱；柏楊、謝偉選、濮毅峰參與配合手術實驗；羅昆侖提出研究思路、設計實驗方案及文章修改。
倫理聲明：本研究通過了聯勤保障部隊第 904 醫院倫理委員會審批（批文編號：20181123）。
肝部分切除術是目前治療肝腫瘤最重要的方法[1-2]，但是肝切除術后剩余肝體積不足限制了擴大肝切除術。為了提高手術切除率，1990 年 Makuuchi 等[3]首次將門靜脈栓塞（portal vein embolism，PVE）聯合肝臟切除應用于臨床。PVE 或門靜脈結扎（portal vein ligation，PVL）的應用使部分患者獲得了手術機會。但是 PVE 或 PVL 術后肝臟增生需要較長的時間（4～8 周），在這期間腫瘤可能進展且仍有部分患者殘余肝臟增生不足而無法行二步肝切除術[4-5]。2007 年德國 Schlitt 對肝門部膽管癌根治行右三葉切除時發現剩余肝體積不足，于是先離斷肝臟、結扎門靜脈右支，6～10 d 后二期切除患側肝臟，這種方法后來由德國的 Schnitzbauer 等[6]2012 年報道且被正式命名為聯合肝臟離斷和門靜脈結扎分期肝切除術 (associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS），隨即也引起國內肝膽外科醫生的關注[7-8]。但是有臨床病例研究[9-10]報道，ALPPS 術后的并發癥率和死亡率較高，而且目前 ALPPS 促進肝增生的機制尚不明確。近年來有研究[11-12]發現，在肝臟、胰腺、胃等器官中 Lgr5 蛋白表達陽性的組織干細胞在損傷修復中對組織器官再生發揮重要作用。基于此，本研究通過建立 ALPPS 手術動物實驗模型，探究 Lgr5 蛋白在大鼠 ALPPS 術后肝再生過程中的表達變化及意義。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
健康雄性 SD 大鼠（200～240 g）120 只，購自于江蘇省血吸蟲病防治研究所。在標準飼料、水及自然光下喂養，自由飲食水，光照 12 h/d。Ki-67 抗體購自于北京中杉金橋有限公司，Lgr5 抗體購自于美國 LSBio 公司。中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院提供實驗外科手術器械。
1.2 動物分組及手術方法
采用隨機數字表法將大鼠分為 ALPPS 組、PVL 組、假手術（sham operation，SO）組 3 組，每組 40 只大鼠。所有大鼠采用 10% 水合氯醛（3.0～3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取正中切口進腹。SO 組開腹后游離大鼠肝葉肝周韌帶、游離肝葉擬結扎處的門靜脈并使之與伴行的肝膽管與肝動脈之間有較充分的空隙，而后關腹；PVL 組分離出供應肝右葉門靜脈支和供應左外葉及中葉左支的門靜脈支，分別用 4-0 絲線結扎，將尾狀葉切除；ALPPS 組在 PVL 組的基礎上，分離并結扎左外葉、左中葉支、肝右葉門靜脈支，保留右中葉所有管道，然后切除尾狀葉（圖 1a），最后在左中葉和右中葉缺血帶處離斷大鼠肝臟（圖 1b、1c）。術后檢查無活動性出血后間斷縫合關腹。所有手術均為清潔手術，定時觀察 3 組動物的存活情況。切除的尾狀葉約占肝臟 10%，結扎肝臟約占全肝質量的 70%[3]。
圖1
示主要結果展示圖
a：肝左外葉、左中葉、右葉 PVL 及切除尾狀葉；b：沿著缺血帶逐步壓榨進行肝臟離斷；c：離斷后的肝臟；d：3 組術后肝臟再生率（與 SO 組相應時間點比較，*
1.3 標本收集
各組大鼠分別在術后第 1、2、4、7 天時取材，每個時間點 10 只大鼠。麻醉后進腹，一次性注射器于肝下下腔靜脈抽血 5～6 mL 后即可處死大鼠，留取大鼠下腔靜脈血液 4 mL，3 000 r/min（r=5.9 cm）離心 5 min 分離血清于–80 ℃ 保存，以備檢測各時點谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）情況；分離出肝右中葉留取肝臟標本并稱取大鼠肝右中葉質量，然后剪取所需標本于 4% 甲醛固定，24 h 后常規石蠟包埋切片。
1.4 檢測方法
1.4.1 肝功能檢測
血清收集后采用全自動生化儀檢測 ALT、AST 水平。
1.4.2 肝臟增生率的計算
保留側肝葉肝臟再生率（%）計算公式為“（WA?WI）/WI×100%”，其中 WA 為各時點取材時肝右中葉質量，WI 為術前大鼠肝右中葉質量（肝右中葉 WI 約占大鼠體質量的 0.76%）[13]。
1.4.3 肝臟組織病理學觀察
切取肝臟組織石蠟切片，每張厚約 4 μm，HE 染色。
1.4.4 免疫組織化學 SP 法檢測 Ki-67 及 Lgr5 蛋白在肝組織中的表達情況
Ki-67 和 Lgr5 蛋白工作濃度分別為 1∶100、1∶150。試劑公司提供的陽性標本作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。Ki-67 表達陽性的定性判定：細胞核呈界限清楚的棕黃色–黃色反應為陽性；其半定量結果計算方法：每張切片隨機選擇 5 個視野，在高倍鏡（×400）下計數視野內 Ki-67 染色陽性細胞數占肝細胞總數的百分比即是 Ki-67 蛋白表達陽性率，然后取其均數。Lgr5 蛋白表達陽性的定性判定：細胞核或細胞漿呈界限清楚的棕黃色–黃色反應為陽性；其半定量計算方法：每張切片隨機選擇 5 個視野，在高倍鏡（×400）下采圖后進行分析，采圖時將數碼相機相關參數固定，用 IPP6.0 醫學圖像專業分析軟件測定 Lgr5 陽性染色部位的吸光度值表示Lgr5 蛋白相對表達量，取其均數。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行分析。用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗計量數據是否符合正態分布，符合正態分布者采用均數±標準差（±s）表示并采用單因素方差分析進行多樣本均數比較（組內兩兩比較采用 SNK-q 檢驗）進行統計分析。采用 Pearson 相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肝臟大體形態變化及肝臟再生情況
ALPPS 術結扎側肝葉顏色變暗并逐漸開始萎縮，保留側肝葉占總肝質量比例隨時間推移而增加。肝臟再生率在 PVL 組和 ALPPS 組的第 1、2、4、7 天均高于 SO 組（P<0.05），其在第 4、7 天時 ALPPS 組高于 PVL 組（P<0.05），第 1、2 天時這 2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1d。
2.2 肝功能檢測結果
結果見圖 1e、1f。ALPPS 組和 PVL 組的 ALT 和 AST 水平在術后第 1、2 天時高于 SO 組（P<0.05），而其在第 4、7 天時比較差異均無統計學意義（P>0.05）；ALPPS 組的 ALT 和 AST 水平在術后第 1 天時高于 PVL 組（P<0.05），而其余時間點 2 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），即這 2 組的肝功能在術后第 4 天均可恢復正常。
2.3 肝臟組織的病理學改變
SO 組大鼠各時間點未見明顯核分裂；PVL 組術后第 1 天時大鼠肝右中葉肝細胞核數量少量增加（圖 1g），術后第 2、4 天時可見肝細胞核分裂，核分裂較 ALPPS 組弱；ALPPS 組術后第 1 天時大鼠肝右中葉肝細胞核數量明顯增多，核漿比例增高，可見肝細胞核分裂象（圖 1h），術后第 2、4 天時肝細胞核分裂活躍，第 7 天時僅有少量核分裂。
2.4 Ki-67 和 Lgr5 免疫組織化學檢測結果
Ki-67 蛋白陽性表達在細胞核呈棕黃色染色（圖 1i–1k）；Lgr5 蛋白陽性表達在細胞核或細胞漿呈界限清楚的棕黃色–黃色染色（圖 1l–1n）。Ki-67 蛋白表達陽性率和 Lgr5 蛋白相對表達量在 ALPPS 組和 PVL 組的第 1、2、4 天時均高于 SO 組（P<0.05），而在第 7 天時與 SO 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；其在 ALPPS 組的第 2 和 4 天時高于 PVL 組（P<0.05），其余時間點這 2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1o、1p。
2.5 Lgr5 蛋白相對表達量與 Ki-67 蛋白表達陽性率的相關性分析結果
相關性分析結果顯示，ALPPS 術后第 1、2、4、7 天時大鼠肝右中葉組織中 Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達呈正相關（r分別為 0.978、0.972、0.951、0.901，P值分別為<0.001、<0.001、<0.001、<0.001），散點圖見圖 1q–1t。
3 討論
足夠剩余肝體積是肝切除術的一個重要條件；正常肝臟行肝切除術后剩余肝體積要達到 25%、肝硬化患者至少要達到 40% 以上才可以維持代謝平衡[14]；臨床上 80% 的肝癌患者確診時已是中晚期，因此多數患者由于缺乏足夠剩余肝體積而失去手術機會[15]。既往研究[16]表明，PVL 或 PVE 后行二步肝切除術雖然取得了一定的效果，但由于術后肝增生需要較長時間，在此期間腫瘤可能進展且肝增生不足，導致無法行二期手術。ALPPS 的出現克服了 PVL 或 PVE 的不足，可以在短時間內促進剩余肝體積快速增大[17]，ALPPS 可使剩余肝體積在一期手術后 7 d 左右迅速增長 74%～99%，繼而行二期手術切除[6]。ALPPS 在短時間內快速促進殘肝再生，有效解決了剩余肝體積不足的問題，但同時 ALPPS 術后并發癥率和病死率較高且其再生機制不明確。有研究者們[18]對門靜脈血流動力學改變、生長因子與細胞因子等體液因素變化進行了探究，但確切機制仍有待進一步探究。近期研究發現，ALPPS 術后血管再生是殘肝再生的基礎[19]，Endocan 可能通過肝細胞生長因子/c-Met 途徑相互作用促進肝干細胞再生[20]，血流動力學改變促進殘肝再生[21]。
Lgr5 是 G 蛋白偶聯受體家族的一員，又名 HG38、FEX、GPR49[22]，其結構特點是細胞外區域包含 17 個富含亮氨酸的重復序列，一個信號肽以及高度保守的 7 次 α-螺旋跨膜區，其廣泛參與生物體內信號轉導[23]。Lgr5 曾被認為是孤兒受體，但近期有研究者[24]發現，Lgr5 能與配體 R-spondin 結合，進而激活 Wnt 信號通路，參與干細胞的分化發育和腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等過程。Lgr5 在如胃竇、毛囊、乳腺、卵巢等多種組織器官中可以作為組織干細胞的標志物，Lgr5 陽性細胞被作為一類腫瘤干細胞，促進腫瘤發生、發展和轉移[25-26]。Lgr5 蛋白表達陽性肝細胞具有干細胞屬性，可有效治療肝纖維化[27]，在體外進行類器官培養和誘導分化可形成類器官[28]。本研究通過分析 ALPPS 術后肝再生過程中 Lgr5 蛋白表達變化探究肝干細胞是否參與肝再生，結果顯示，ALPPS 術后在中央靜脈周圍 Lgr5 蛋白活化表達，其參與了術后的肝臟再生；PVL 術后 Lgr5 也出現表達，但沒有 ALPPS 術后表達強烈，大鼠 ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達變化和術后肝再生率、肝臟病理組織核分裂象的變化相吻合；Ki-67 表達范圍覆蓋除 G0 期以外各增殖期細胞，是一種增殖細胞核相關抗原，能夠很好地反映細胞處于增殖狀態[29-30]。本研究中大鼠肝臟 ALPPS 術后第 1 天即可見較多 Ki-67 陽性細胞，在觀察范圍內術后第 2 天達到峰值，出現大量陽性細胞，第 4 天陽性細胞減少，第 7 天僅有少量表達，大鼠肝臟 Lgr5 蛋白表達在術后第 1、2、4、7 天與 Ki-67 蛋白表達陽性率呈正相關，相關系數均超過0.9（均P<0.001），結果提示，Lgr5 與 ALPPS 術后殘肝再生密切相關。有研究[28]發現，Lgr5 蛋白表達陽性的肝細胞可在體外培養為肝組織；Kuijk 等[31]報道肝干細胞的可能標志物是 Lgr5，并且干細胞需要 Wnt 蛋白的維持；ALPPS 術后殘肝中央靜脈周圍 Wnt2 呈高表達[32]，Lgr5 是 Wnt 信號通路的靶向基因，能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路[25]；結合本實驗結果提示，大鼠 ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達與 ALPPS 術后肝再生密切相關；ALPPS 術后 Lgr5 蛋白表達陽性細胞增多，Lgr5 蛋白表達陽性細胞是肝干細胞，進一步表明 ALPPS 術后肝干細胞可能參與了肝臟再生。
總之，從本研究初步結果看，通過建立 ALPPS 大鼠模型檢測肝再生過程中 Lgr5 蛋白表達變化提示了其與殘肝再生密切相關，表明 ALPPS 術后肝干細胞可能參與了肝臟再生。但本實驗仍有一定的局限性：大鼠模型與人類肝的再生機制可能不同；正常肝臟與腫瘤肝臟有差異；Lgr5 參與肝再生的機制有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉偉偉進行實驗實施、數據采集分析和文章撰寫修改；方征、夏咸軍對文章的知識性內容作批評性審閱；柏楊、謝偉選、濮毅峰參與配合手術實驗；羅昆侖提出研究思路、設計實驗方案及文章修改。
倫理聲明：本研究通過了聯勤保障部隊第 904 醫院倫理委員會審批（批文編號：20181123）。
