引用本文： 翟秧秧, 師鑫鵬, 羅曉勇. Krüppel 樣轉錄因子 8 在乳腺癌中的 表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(10): 1320-1327. doi: 10.7507/1007-9424.202102004 復制
乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤，也是中國女性第六大主要的惡性腫瘤死因，發病率約為 46.74/10 萬[1]，遠處轉移是患者死亡的主要原因之一[2]。因而研究乳腺癌的發病機制，尋找參與乳腺癌發生、發展的相關基因，以幫助提高乳腺癌患者生存率、延長其生存期。Krüppel 樣轉錄因子（Krüppel like factors，KLFs）首次于果蠅中被發現，是一類具有鋅指結構（即 DNA 結合結構域）的基本轉錄因子，可通過結合 DNA 中的 CC 盒或相關的 CACCC 元件，調控富含 CC 啟動子的基因表達[3-4]，至今在人類組織中已發現 17 個該家族的成員。KLFs 家族成員的 C 末端區域高度保守，由 3 個與 DNA 結合的鋅指組成，其 N 末端區域包含轉錄調控域，可以結合輔助因子并促進不同功能的 KLFs。有研究[5]發現，KLFs 參與了上皮-間質轉化、細胞外基質改變、侵襲、血管生成等轉移過程。KLF8 作為該家族的一名新成員，被證實參與了多種惡性腫瘤如肝癌[6]、結直腸癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]等的發生及發展，且 KLF8 蛋白具有很強的上皮-間質轉化作用[10]。然而對于 KLF8 在乳腺癌組織中的表達及意義的研究較少。本研究旨在通過檢測 KLF8 在乳腺癌中的表達及亞細胞定位情況，以了解 KLF8 的表達與乳腺癌患者臨床病理特征及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 臨床資料
選取 2019 年 1～6 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院甲乳外科經手術切除的乳腺癌患者 16 例，年齡 42～69 歲。所有納入本研究的病例術前均未接受過放療、化療或免疫治療。術后經組織學病理切片證實為浸潤性乳腺癌。本研究所有患者對本研究內容知情并已簽署知情同意書，并且通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學倫理委員會審批。
1.1.2 細胞及組織芯片
① 人正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 和 7 種乳腺癌細胞系 MDA-MB-231、MCF-12A、Hs-578T、MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、ZR-75-30 均購自ATCC細胞庫。② 乳腺癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，芯片編號為［乳腺癌，139］HBre-D139Su-01。該組織芯片共包含 139 例乳腺癌患者的癌組織，對該組織芯片行免疫組織化學檢測，檢測后脫片 4 例，其余 135 例用于預后分析。
1.1.3 數據庫中的數據
① 登錄 Oncomine 數據庫（https://www.oncomine.org/），設定如下篩選條件選擇病例：Gene：KLF8；Cancer Type：Breast Cancer；Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；Date Type：mRNA；選擇數據集 Finak，分析 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況，結果以箱狀圖展示。② 利用 Kaplan-Meier Plotter 數據庫（http://kmplot.com/analysis/）基因芯片數據在線分析 KLF8 mRNA 高或低表達與乳腺癌患者生存情況的關系。設定篩選條件如下：Cancer Type：Breast Cancer；Gene：KLF8；Analysis：RFS（無復發生存率）、OS（總生存率）、PPS（ 后進展生存率）、DMFS（無遠處轉移生存率），KLF8 mRNA 高或低表達分組截點選擇中位數，其他為數據庫默認設定。
1.2 實時定量 PCR（qRT-PCR）技術檢測 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達
根據 GeneBank 提供的基因序列，設計 KLF8 和 GAPDH 的引物，KLF8 上游引物序列為 5′ -GCTCACCGCAGAATCCATACA-3′ ，下游引物序列為 5′ -GTGCACCGAAAAGGCTTGAT-3′ ，擴增片段長度為 134 bp；內參基因 GAPDH 的上游引物序列為 5′ -TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′ ，下游引物序列為 5′ -CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′ ，擴增片段長度為 132 bp。用 TRIzol 試劑提取組織的總 RNA，用 Nano Drop 2000 分光光度計測定 RNA 濃度，以組織 RNA 為模板，使用一步法高效 RT-PCR 試劑盒（HiScript? ⅡOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit），根據其說明書配制反應體系，PCR 擴增條件：95 ℃ 變性 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進行 40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，采集溶解曲線，數據以 2–ΔΔCt法計算基因表達的倍數改變。
1.3 Western blot 法檢測 KLF8 蛋白在臨床病例乳腺癌組織及細胞系中的表達
鄭州大學附屬洛陽中心醫院手術切除的 16 例乳腺癌及其相應的癌旁正常組織樣本和細胞在低溫 RIPA 裂解緩沖液中裂解并提取全蛋白。使用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每個泳道裝載 20 μg 蛋白質樣品，用 12% 的 SDS-PAGE 進一步分離，轉移到 PVDF 膜。在 5% 脫脂牛奶中室溫封閉 1 h 后，膜與 KLF8 抗體（美國加州，博士德，1∶400）在室溫下孵育 2 h，洗脫后與同種屬二抗（1∶1 000）在室溫下孵育 1 h。最后再次洗脫后通過化學發光法檢測印跡。使用 GAPDH（中國上海，碧云天，1∶2 000）作為內參，并通過 Image pro plus 6.0 圖像分析系統對 Western blot 結果條帶進行灰度值分析。
1.4 免疫熒光技術檢測 KLF8 表達在 KLF8 表達量較高的乳腺癌細胞中的定位情況
在 24 孔板底滴一滴培養基，將滅菌后 14 mm 直徑圓形蓋玻片置于孔內，趕出蓋玻片下的培養基，使其與孔板底部緊密結合。將 KLF8 表達量較高的乳腺癌細胞懸液按每孔 500 μL 的體積加入處理好的 24 孔板中，每個細胞系鋪 6 孔，在 37 ℃、5% 的培養箱中培養至次日。取出 24 孔板，用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5 min，隨后使用預冷的 4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，再次清洗后使用 0.3% Triton-X-100 破膜處理，清洗后進行封閉（Beyotime，免疫染色封閉液）1 h，一抗（Bioss，Rabbit Anti-KLF8 Polyclonal Antibody，濃度 1∶100）4 ℃ 過夜，清洗后避光 37 ℃ 孵育二抗 1 h（Bioss，Goat Anti-Mouse IgG/FITC，1∶100），隨后使用 DAPI 染液 37 ℃ 避光條件下染細胞核 5 min，清洗后從孔板中取出蓋玻片，滴加一滴封片劑封于載玻片上。隨后在熒光顯微鏡下進行觀察并采圖。
1.5 免疫組織化學方法檢測 KLF8 蛋白在乳腺癌組織芯片中的表達
組織芯片烤片 3 h 后二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，于檸檬酸鹽緩沖液中 95～97 ℃ 處理 25 min 進行抗原修復。3% H2O2 室溫孵育消除內源性過氧化物酶的活性，10% 山羊血清孵育封閉非特異性免疫球蛋白后用 PBS 沖洗，滴加 KLF8 抗體工作液（美國加州，博士德，1∶400）4 ℃ 過夜。PBS 沖洗 3 次后滴加抗兔二抗孵育 1 h，然后與 DAB 反應，以蘇木精染細胞核，鹽酸乙醇分化、清水返藍，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。免疫組織化學檢測結果采用 H-Score 評分，即 H-score=Σpi（i+1），pi 表示陽性細胞數量占切片中所有細胞數量的百分數；i 代表著色強度。以 75 分為截點判定 KLF8 蛋白表達水平的高低，>75 分為 KLF8 蛋白高表達，≤75 分則為 KLF8 蛋白低表達；同時分析 KLF8 蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件對數據進行分析。乳腺癌與癌旁組織 KLF8 的相對表達分析采用配對 t 檢驗；KLF8 表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系采用 χ2 檢驗；采用 Kaplan-Meier 法 log-rank 檢驗分析患者的總生存期與 KLF8 蛋白表達水平的關系；采用單因素及 Cox 比例風險回歸多因素分析患者 KLF8 蛋白表達及其他臨床病理特征與預后的關系。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 數據庫中 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況以及患者生存分析結果
2.1.1 Oncomine 數據庫中 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況
在 Oncomine 數據庫中的 Finak 基因芯片數據中共包含 53 例乳腺癌組織及 6 例正常乳腺組織的 KLF8 mRNA 表達數據，其結果顯示，KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達較正常乳腺組織明顯升高（t=6.024，P<0.001），見圖 1a。
圖1
示主要研究結果
a–e：分別為 Oncomine 數據庫中乳腺癌患者組織中 KLF8 mRNA 的表達情況（a；*：
2.1.2 Kaplan-Meier Plotter 數據庫中 KLF8 mRNA 表達與乳腺癌患者的生存關系
Kaplan-Meier Plotter 數據庫中提供的基因芯片 mRNA 表達數據進行的生存分析結果顯示，KLF8 mRNA 低表達組患者的無復發生存率、總生存率、后進展生存率、無遠處轉移生存率均優于KLF8 mRNA 高表達組（P<0.05），見圖 1b–1e。
2.2 臨床數據中 KLF8 蛋白和 mRNA 在乳腺癌組織中以及 KLF8 蛋白在乳腺癌細胞系中的表達情況
2.2.1 KLF8 在臨床乳腺癌組織中的表達情況
分別采用 Western blot 和 qRT-PCR 法對我院 16 例乳腺癌患者的癌組織及其相應的癌旁正常組織中 KLF8 蛋白和 mRNA 表達檢測結果見圖 1f–1h，結果顯示，乳腺癌患者的癌組織中 KLF8 蛋白和 mRNA 均高于其相應的癌旁正常組織（13.284±0.830比7.160±0.448，t=–5.900，P<0.001；47.229±2.952比19.014比1.188，t=–3.839，P=0.002）。
2.2.2 KLF8 蛋白在乳腺癌細胞系中的表達及定位情況
采用 Western blot 法檢測了正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 及乳腺癌細胞系 MDA-MB-231、MCF-12A、HS-578T、MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、ZR-75-30 中 KLF8 蛋白表達的結果顯示，KLF8 蛋白在 7 個乳腺癌細胞系中的表達均高于正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A，并且從高到低依次是：BT-474、HS-578T、MCF-7、ZR-75-30、MDA-MB-453、MCF-12A、MDA-MB-231、MCF-10A，見圖 1i、1j。同時采用免疫熒光技術檢測 KLF8 表達量較高的 MCF-7 及 HS-578T 兩種乳腺癌細胞中 KLF8 在乳腺癌細胞中的定位情況，結果見圖 1k、1l，可見 KLF8 在乳腺癌細胞系的細胞漿、細胞核及細胞膜中均有表達，且在多數細胞中為細胞漿表達為主，僅在少數細胞的細胞核中表達較高。
2.3 免疫組織化學方法檢測乳腺癌芯片組織中 KLF8 蛋白表達結果及其與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系
2.3.1 KLF8 蛋白表達情況及其與乳腺癌患者臨床病理特征的關系
免疫組織化學方法檢測 KLF8 蛋白在 135 例乳腺癌組織芯片中的表達結果（圖 1m、1n）顯示，KLF8 蛋白高表達 63 例，KLF8 蛋白低表達 72 例。KLF8 蛋白高低表達與患者的年齡、病理分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移、TNM 分期及 HER-2 表達情況均無關（P>0.05），而與雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達情況有關（P<0.05），見表 1。
表1
乳腺癌芯片組織中 KLF8 蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系
2.3.2 KLF8 蛋白表達情況與乳腺癌患者預后的關系
隨訪時間 2～140 個月、中位隨訪時間 107 個月。KLF8 蛋白高表達組的 3、5 年生存率分別為 81.0%（51/63）、74.6%（47/63），KLF8 蛋白低表達組 3、5 年生存率分別為 94.4%（68/72）、91.7%蛋白（66/72）。經 Kaplan-Meier 生存曲線（圖 1o）分析結果顯示，KLF8 蛋白高表達患者的預后情況劣于 KLF8 蛋白低表達患者（χ2=9.476，P=0.002）。單因素分析結果顯示，乳腺癌患者的總生存預后與患者的年齡、病理分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移及 HER-2 表達情況均無關，而 TNM 分期Ⅲ期（P=0.004）、ER 表達陰性（P=0.011）、PR 表達陰性（P=0.043）及 KLF8 蛋白高表達（P=0.003）患者的中位生存時間明顯短于 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、ER 表達陽性、PR 表達陽性及 KLF8 蛋白低表達者，見表 1；Cox 比例風險回歸多因素分析結果顯示，乳腺癌 TNM 分期晚及 KLF8 蛋白高表達是乳腺癌患者生存預后的獨立危險因素（OR=2.523、P=0.036；OR=2.764、P=0.004），見表 2。
表2
影響乳腺癌患者生存預后的多因素分析結果
3 討論
乳腺癌發生是多階段、多因素、多基因共同作用的復雜過程，涉及腫瘤細胞自身生長優勢、細胞間黏附能力降低、細胞骨架重構導致細胞運動和遷移、細胞凋亡、免疫殺傷、腫瘤血管和淋巴管形成等多種因素。有研究[11-15]報道，KLF8 可通過促進基質金屬蛋白 9 和 14、上皮基質相互作用蛋白 1、CXC 趨化因子受體 4 的表達而促進了乳腺癌的侵襲或轉移；還有研究[16]發現，KLF8 可促進乳腺癌細胞 DNA 修復而導致其對阿霉素治療耐藥；Li 等[17]還發現 KLF8 可通過抑制 miR-141 的表達而間接促進乳腺癌細胞表皮生長因子受體的表達。本研究探討了 KLF8 在乳腺癌中表達與其患者臨床病理特征及預后關系。
本研究通過 Oncomine 數據庫中的數據分析發現，KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中表達較正常乳腺組織升高（P<0.001），Kaplan-Meier Plotter 數據庫中的數據分析結果顯示，KLF8 mRNA 低表達患者的無復發生存、總生存、后進展生存及無遠處轉移生存情況均優于高表達患者（P<0.05）。然后本研究通過對臨床乳腺癌組織樣本及乳腺癌細胞系進行 qRT-PCR 及 Western blot 檢測結果發現，KLF8 表達水平在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中均較乳腺癌旁正常組織及正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 中升高（P<0.05），而且進一步了解了 KLF8 蛋白表達在 KLF8 表達量較高的 HS-578T 及 MCF-7 乳腺癌細胞系中的定位情況，發現以在細胞漿表達為主，僅在少量細胞中以核表達為主。
KLF8 作為轉錄因子和其他細胞蛋白一樣，在細胞質中產生。一些轉錄因子可以通過蛋白序列中的核定位序列從細胞質轉運到細胞核[18]，而另有一些轉錄因子則通過磷酸化、乙酰化、甲基化或其他特殊反應進行修飾，使它們從細胞質轉運到細胞核[19]，在細胞核中，這些轉錄因子在其靶基因的啟動子區域找到轉錄激活或調控的途徑。KLF8 的有效核定位需要兩個核定位序列介導其核輸入，這對于其細胞功能至關重要。Mehta 等[18]發現了 KLF8 中的兩個核定位序列，第一個是位于 ZF 域中的 ZF1 和 ZF2，第二個功能性核定位序列是位于氨基酸（aa）151～200 之間的 N 末端激活域內，該區域的缺失會導致細胞質定位錯誤。此外，該區域包含兩個殘基 S165 和 K171，在其核轉錄中也起著作用，其任一殘基突變均會導致 KLF8 的細胞質定位。既往的免疫組織化學檢測結果提示，KLF8 在乳腺癌[17]、肝癌[20]、肺癌[8]、結直腸癌[21]、腦膠質瘤[22]中的胞漿及胞核均有表達，而在胰腺癌[23]中，當 KLF8 低或中度表達時其表達主要位于胞漿，當表達強度較強時才可見 KLF8 的胞核陽性表達。在胃癌的研究[24]中發現，與腸型胃腺癌相比，彌漫型胃腺癌中 KLF8 的核表達明顯更高（P=0.036），且 Kaplan-Meier 分析結果表明，胞核 KLF8 陽性患者的總生存率明顯低于胞核 KLF8 陰性的患者（P=0.011）。關于 KLF8 在乳腺癌細胞中的亞細胞定位與乳腺癌細胞的惡性生物學行為及患者的預后相關性尚缺乏相關研究，但其家族的另一成員 KLF4 已有相關研究。Pandya等[25]通過對 146 例乳腺原發浸潤性導管癌進行免疫組織化學檢測 KLF4 的染色表達模式并分析其與臨床預后的關系發現，KLF4 的優先核定位可能與乳腺癌患者的不良結局相關；但另一項 60 例患者的回顧性研究[26]卻發現 KLF4 的細胞質定位與乳腺癌細胞的分化不良有關。那么作為同一家族的另一成員 KLF8 在乳腺癌細胞中表達的亞細胞定位與乳腺癌的惡性生物學行為或預后究竟是怎樣的關系，這還有待進一步的研究。
此外，我們對包含 139 例乳腺癌組織的芯片進行免疫組織化學檢測并分析 KLF8 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系，結果發現，KLF8 蛋白高或低表達患者的 ER 和 PR 狀態比較差異有統計學意義（P<0.05），而二者的年齡、病理分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期及 HER-2 狀態方面比較差異未見有統計學意義（P>0.05）。ER 在乳腺癌的發生和發展中起著關鍵作用，乳腺癌內分泌治療主要是通過抑制或阻斷激素對腫瘤的“營養供給”，從而達到抑制或阻止癌細胞增長的目的，從而有效提高乳腺癌患者的生存質量。Akaogi 等[27]發現，使用 ERα 陽性乳腺癌細胞系 MCF-7 進行體外實驗，發現 KLF4 的表達可通過抑制 ERα 的轉錄活性進而抑制了雌激素依賴性細胞的生長，還發現 p53 的激活通過提高 KLF4 的表達降低了 ERα 的轉錄活性。但是另有研究[28]發現，同為 KLF 家族的 KLF6 卻被證實可通過抑制 c-Src 進而抑制乳腺癌中 ER 介導的細胞生長。在乳腺癌中 KLF8 與 ER 的關系目前尚缺乏相關研究，這也為我們下一步的研究提供了方向。最后我們還通過 Kaplan-Meier 生存分析發現 KLF8 高表達患者的預后較低表達患者差，并且單因素及多因素 Cox 比例風險回歸分析發現乳腺癌患者的 TNM 分期晚及 KLF8 高表達是影響預后的獨立危險因素。
從本研究結果發現，KLF8 在乳腺癌組織及乳腺癌細胞中均高表達，其可能作為促癌基因參與了乳腺癌的進展，因而 KLF8 有望成為預測乳腺癌預后的一個重要生物標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：翟秧秧是本研究的主要設計者和執行人，完成數據分析，論文的寫作；師鑫鵬參與研究設計并執行；羅曉勇是項目的構思者及負責人，指導研究設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。
倫理聲明：本研究通過了洛陽市中心醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：LWLL-2018-11-28）。
乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤，也是中國女性第六大主要的惡性腫瘤死因，發病率約為 46.74/10 萬[1]，遠處轉移是患者死亡的主要原因之一[2]。因而研究乳腺癌的發病機制，尋找參與乳腺癌發生、發展的相關基因，以幫助提高乳腺癌患者生存率、延長其生存期。Krüppel 樣轉錄因子（Krüppel like factors，KLFs）首次于果蠅中被發現，是一類具有鋅指結構（即 DNA 結合結構域）的基本轉錄因子，可通過結合 DNA 中的 CC 盒或相關的 CACCC 元件，調控富含 CC 啟動子的基因表達[3-4]，至今在人類組織中已發現 17 個該家族的成員。KLFs 家族成員的 C 末端區域高度保守，由 3 個與 DNA 結合的鋅指組成，其 N 末端區域包含轉錄調控域，可以結合輔助因子并促進不同功能的 KLFs。有研究[5]發現，KLFs 參與了上皮-間質轉化、細胞外基質改變、侵襲、血管生成等轉移過程。KLF8 作為該家族的一名新成員，被證實參與了多種惡性腫瘤如肝癌[6]、結直腸癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]等的發生及發展，且 KLF8 蛋白具有很強的上皮-間質轉化作用[10]。然而對于 KLF8 在乳腺癌組織中的表達及意義的研究較少。本研究旨在通過檢測 KLF8 在乳腺癌中的表達及亞細胞定位情況，以了解 KLF8 的表達與乳腺癌患者臨床病理特征及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 臨床資料
選取 2019 年 1～6 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院甲乳外科經手術切除的乳腺癌患者 16 例，年齡 42～69 歲。所有納入本研究的病例術前均未接受過放療、化療或免疫治療。術后經組織學病理切片證實為浸潤性乳腺癌。本研究所有患者對本研究內容知情并已簽署知情同意書，并且通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學倫理委員會審批。
1.1.2 細胞及組織芯片
① 人正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 和 7 種乳腺癌細胞系 MDA-MB-231、MCF-12A、Hs-578T、MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、ZR-75-30 均購自ATCC細胞庫。② 乳腺癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，芯片編號為［乳腺癌，139］HBre-D139Su-01。該組織芯片共包含 139 例乳腺癌患者的癌組織，對該組織芯片行免疫組織化學檢測，檢測后脫片 4 例，其余 135 例用于預后分析。
1.1.3 數據庫中的數據
① 登錄 Oncomine 數據庫（https://www.oncomine.org/），設定如下篩選條件選擇病例：Gene：KLF8；Cancer Type：Breast Cancer；Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；Date Type：mRNA；選擇數據集 Finak，分析 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況，結果以箱狀圖展示。② 利用 Kaplan-Meier Plotter 數據庫（http://kmplot.com/analysis/）基因芯片數據在線分析 KLF8 mRNA 高或低表達與乳腺癌患者生存情況的關系。設定篩選條件如下：Cancer Type：Breast Cancer；Gene：KLF8；Analysis：RFS（無復發生存率）、OS（總生存率）、PPS（ 后進展生存率）、DMFS（無遠處轉移生存率），KLF8 mRNA 高或低表達分組截點選擇中位數，其他為數據庫默認設定。
1.2 實時定量 PCR（qRT-PCR）技術檢測 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達
根據 GeneBank 提供的基因序列，設計 KLF8 和 GAPDH 的引物，KLF8 上游引物序列為 5′ -GCTCACCGCAGAATCCATACA-3′ ，下游引物序列為 5′ -GTGCACCGAAAAGGCTTGAT-3′ ，擴增片段長度為 134 bp；內參基因 GAPDH 的上游引物序列為 5′ -TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′ ，下游引物序列為 5′ -CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′ ，擴增片段長度為 132 bp。用 TRIzol 試劑提取組織的總 RNA，用 Nano Drop 2000 分光光度計測定 RNA 濃度，以組織 RNA 為模板，使用一步法高效 RT-PCR 試劑盒（HiScript? ⅡOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit），根據其說明書配制反應體系，PCR 擴增條件：95 ℃ 變性 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進行 40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，采集溶解曲線，數據以 2–ΔΔCt法計算基因表達的倍數改變。
1.3 Western blot 法檢測 KLF8 蛋白在臨床病例乳腺癌組織及細胞系中的表達
鄭州大學附屬洛陽中心醫院手術切除的 16 例乳腺癌及其相應的癌旁正常組織樣本和細胞在低溫 RIPA 裂解緩沖液中裂解并提取全蛋白。使用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每個泳道裝載 20 μg 蛋白質樣品，用 12% 的 SDS-PAGE 進一步分離，轉移到 PVDF 膜。在 5% 脫脂牛奶中室溫封閉 1 h 后，膜與 KLF8 抗體（美國加州，博士德，1∶400）在室溫下孵育 2 h，洗脫后與同種屬二抗（1∶1 000）在室溫下孵育 1 h。最后再次洗脫后通過化學發光法檢測印跡。使用 GAPDH（中國上海，碧云天，1∶2 000）作為內參，并通過 Image pro plus 6.0 圖像分析系統對 Western blot 結果條帶進行灰度值分析。
1.4 免疫熒光技術檢測 KLF8 表達在 KLF8 表達量較高的乳腺癌細胞中的定位情況
在 24 孔板底滴一滴培養基，將滅菌后 14 mm 直徑圓形蓋玻片置于孔內，趕出蓋玻片下的培養基，使其與孔板底部緊密結合。將 KLF8 表達量較高的乳腺癌細胞懸液按每孔 500 μL 的體積加入處理好的 24 孔板中，每個細胞系鋪 6 孔，在 37 ℃、5% 的培養箱中培養至次日。取出 24 孔板，用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5 min，隨后使用預冷的 4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，再次清洗后使用 0.3% Triton-X-100 破膜處理，清洗后進行封閉（Beyotime，免疫染色封閉液）1 h，一抗（Bioss，Rabbit Anti-KLF8 Polyclonal Antibody，濃度 1∶100）4 ℃ 過夜，清洗后避光 37 ℃ 孵育二抗 1 h（Bioss，Goat Anti-Mouse IgG/FITC，1∶100），隨后使用 DAPI 染液 37 ℃ 避光條件下染細胞核 5 min，清洗后從孔板中取出蓋玻片，滴加一滴封片劑封于載玻片上。隨后在熒光顯微鏡下進行觀察并采圖。
1.5 免疫組織化學方法檢測 KLF8 蛋白在乳腺癌組織芯片中的表達
組織芯片烤片 3 h 后二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，于檸檬酸鹽緩沖液中 95～97 ℃ 處理 25 min 進行抗原修復。3% H2O2 室溫孵育消除內源性過氧化物酶的活性，10% 山羊血清孵育封閉非特異性免疫球蛋白后用 PBS 沖洗，滴加 KLF8 抗體工作液（美國加州，博士德，1∶400）4 ℃ 過夜。PBS 沖洗 3 次后滴加抗兔二抗孵育 1 h，然后與 DAB 反應，以蘇木精染細胞核，鹽酸乙醇分化、清水返藍，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。免疫組織化學檢測結果采用 H-Score 評分，即 H-score=Σpi（i+1），pi 表示陽性細胞數量占切片中所有細胞數量的百分數；i 代表著色強度。以 75 分為截點判定 KLF8 蛋白表達水平的高低，>75 分為 KLF8 蛋白高表達，≤75 分則為 KLF8 蛋白低表達；同時分析 KLF8 蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件對數據進行分析。乳腺癌與癌旁組織 KLF8 的相對表達分析采用配對 t 檢驗；KLF8 表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系采用 χ2 檢驗；采用 Kaplan-Meier 法 log-rank 檢驗分析患者的總生存期與 KLF8 蛋白表達水平的關系；采用單因素及 Cox 比例風險回歸多因素分析患者 KLF8 蛋白表達及其他臨床病理特征與預后的關系。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 數據庫中 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況以及患者生存分析結果
2.1.1 Oncomine 數據庫中 KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達情況
在 Oncomine 數據庫中的 Finak 基因芯片數據中共包含 53 例乳腺癌組織及 6 例正常乳腺組織的 KLF8 mRNA 表達數據，其結果顯示，KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中的表達較正常乳腺組織明顯升高（t=6.024，P<0.001），見圖 1a。
圖1
示主要研究結果
a–e：分別為 Oncomine 數據庫中乳腺癌患者組織中 KLF8 mRNA 的表達情況（a；*：
2.1.2 Kaplan-Meier Plotter 數據庫中 KLF8 mRNA 表達與乳腺癌患者的生存關系
Kaplan-Meier Plotter 數據庫中提供的基因芯片 mRNA 表達數據進行的生存分析結果顯示，KLF8 mRNA 低表達組患者的無復發生存率、總生存率、后進展生存率、無遠處轉移生存率均優于KLF8 mRNA 高表達組（P<0.05），見圖 1b–1e。
2.2 臨床數據中 KLF8 蛋白和 mRNA 在乳腺癌組織中以及 KLF8 蛋白在乳腺癌細胞系中的表達情況
2.2.1 KLF8 在臨床乳腺癌組織中的表達情況
分別采用 Western blot 和 qRT-PCR 法對我院 16 例乳腺癌患者的癌組織及其相應的癌旁正常組織中 KLF8 蛋白和 mRNA 表達檢測結果見圖 1f–1h，結果顯示，乳腺癌患者的癌組織中 KLF8 蛋白和 mRNA 均高于其相應的癌旁正常組織（13.284±0.830比7.160±0.448，t=–5.900，P<0.001；47.229±2.952比19.014比1.188，t=–3.839，P=0.002）。
2.2.2 KLF8 蛋白在乳腺癌細胞系中的表達及定位情況
采用 Western blot 法檢測了正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 及乳腺癌細胞系 MDA-MB-231、MCF-12A、HS-578T、MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、ZR-75-30 中 KLF8 蛋白表達的結果顯示，KLF8 蛋白在 7 個乳腺癌細胞系中的表達均高于正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A，并且從高到低依次是：BT-474、HS-578T、MCF-7、ZR-75-30、MDA-MB-453、MCF-12A、MDA-MB-231、MCF-10A，見圖 1i、1j。同時采用免疫熒光技術檢測 KLF8 表達量較高的 MCF-7 及 HS-578T 兩種乳腺癌細胞中 KLF8 在乳腺癌細胞中的定位情況，結果見圖 1k、1l，可見 KLF8 在乳腺癌細胞系的細胞漿、細胞核及細胞膜中均有表達，且在多數細胞中為細胞漿表達為主，僅在少數細胞的細胞核中表達較高。
2.3 免疫組織化學方法檢測乳腺癌芯片組織中 KLF8 蛋白表達結果及其與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系
2.3.1 KLF8 蛋白表達情況及其與乳腺癌患者臨床病理特征的關系
免疫組織化學方法檢測 KLF8 蛋白在 135 例乳腺癌組織芯片中的表達結果（圖 1m、1n）顯示，KLF8 蛋白高表達 63 例，KLF8 蛋白低表達 72 例。KLF8 蛋白高低表達與患者的年齡、病理分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移、TNM 分期及 HER-2 表達情況均無關（P>0.05），而與雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達情況有關（P<0.05），見表 1。
表1
乳腺癌芯片組織中 KLF8 蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征和預后的關系
2.3.2 KLF8 蛋白表達情況與乳腺癌患者預后的關系
隨訪時間 2～140 個月、中位隨訪時間 107 個月。KLF8 蛋白高表達組的 3、5 年生存率分別為 81.0%（51/63）、74.6%（47/63），KLF8 蛋白低表達組 3、5 年生存率分別為 94.4%（68/72）、91.7%蛋白（66/72）。經 Kaplan-Meier 生存曲線（圖 1o）分析結果顯示，KLF8 蛋白高表達患者的預后情況劣于 KLF8 蛋白低表達患者（χ2=9.476，P=0.002）。單因素分析結果顯示，乳腺癌患者的總生存預后與患者的年齡、病理分級、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移及 HER-2 表達情況均無關，而 TNM 分期Ⅲ期（P=0.004）、ER 表達陰性（P=0.011）、PR 表達陰性（P=0.043）及 KLF8 蛋白高表達（P=0.003）患者的中位生存時間明顯短于 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、ER 表達陽性、PR 表達陽性及 KLF8 蛋白低表達者，見表 1；Cox 比例風險回歸多因素分析結果顯示，乳腺癌 TNM 分期晚及 KLF8 蛋白高表達是乳腺癌患者生存預后的獨立危險因素（OR=2.523、P=0.036；OR=2.764、P=0.004），見表 2。
表2
影響乳腺癌患者生存預后的多因素分析結果
3 討論
乳腺癌發生是多階段、多因素、多基因共同作用的復雜過程，涉及腫瘤細胞自身生長優勢、細胞間黏附能力降低、細胞骨架重構導致細胞運動和遷移、細胞凋亡、免疫殺傷、腫瘤血管和淋巴管形成等多種因素。有研究[11-15]報道，KLF8 可通過促進基質金屬蛋白 9 和 14、上皮基質相互作用蛋白 1、CXC 趨化因子受體 4 的表達而促進了乳腺癌的侵襲或轉移；還有研究[16]發現，KLF8 可促進乳腺癌細胞 DNA 修復而導致其對阿霉素治療耐藥；Li 等[17]還發現 KLF8 可通過抑制 miR-141 的表達而間接促進乳腺癌細胞表皮生長因子受體的表達。本研究探討了 KLF8 在乳腺癌中表達與其患者臨床病理特征及預后關系。
本研究通過 Oncomine 數據庫中的數據分析發現，KLF8 mRNA 在乳腺癌組織中表達較正常乳腺組織升高（P<0.001），Kaplan-Meier Plotter 數據庫中的數據分析結果顯示，KLF8 mRNA 低表達患者的無復發生存、總生存、后進展生存及無遠處轉移生存情況均優于高表達患者（P<0.05）。然后本研究通過對臨床乳腺癌組織樣本及乳腺癌細胞系進行 qRT-PCR 及 Western blot 檢測結果發現，KLF8 表達水平在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中均較乳腺癌旁正常組織及正常乳腺上皮細胞系 MCF-10A 中升高（P<0.05），而且進一步了解了 KLF8 蛋白表達在 KLF8 表達量較高的 HS-578T 及 MCF-7 乳腺癌細胞系中的定位情況，發現以在細胞漿表達為主，僅在少量細胞中以核表達為主。
KLF8 作為轉錄因子和其他細胞蛋白一樣，在細胞質中產生。一些轉錄因子可以通過蛋白序列中的核定位序列從細胞質轉運到細胞核[18]，而另有一些轉錄因子則通過磷酸化、乙酰化、甲基化或其他特殊反應進行修飾，使它們從細胞質轉運到細胞核[19]，在細胞核中，這些轉錄因子在其靶基因的啟動子區域找到轉錄激活或調控的途徑。KLF8 的有效核定位需要兩個核定位序列介導其核輸入，這對于其細胞功能至關重要。Mehta 等[18]發現了 KLF8 中的兩個核定位序列，第一個是位于 ZF 域中的 ZF1 和 ZF2，第二個功能性核定位序列是位于氨基酸（aa）151～200 之間的 N 末端激活域內，該區域的缺失會導致細胞質定位錯誤。此外，該區域包含兩個殘基 S165 和 K171，在其核轉錄中也起著作用，其任一殘基突變均會導致 KLF8 的細胞質定位。既往的免疫組織化學檢測結果提示，KLF8 在乳腺癌[17]、肝癌[20]、肺癌[8]、結直腸癌[21]、腦膠質瘤[22]中的胞漿及胞核均有表達，而在胰腺癌[23]中，當 KLF8 低或中度表達時其表達主要位于胞漿，當表達強度較強時才可見 KLF8 的胞核陽性表達。在胃癌的研究[24]中發現，與腸型胃腺癌相比，彌漫型胃腺癌中 KLF8 的核表達明顯更高（P=0.036），且 Kaplan-Meier 分析結果表明，胞核 KLF8 陽性患者的總生存率明顯低于胞核 KLF8 陰性的患者（P=0.011）。關于 KLF8 在乳腺癌細胞中的亞細胞定位與乳腺癌細胞的惡性生物學行為及患者的預后相關性尚缺乏相關研究，但其家族的另一成員 KLF4 已有相關研究。Pandya等[25]通過對 146 例乳腺原發浸潤性導管癌進行免疫組織化學檢測 KLF4 的染色表達模式并分析其與臨床預后的關系發現，KLF4 的優先核定位可能與乳腺癌患者的不良結局相關；但另一項 60 例患者的回顧性研究[26]卻發現 KLF4 的細胞質定位與乳腺癌細胞的分化不良有關。那么作為同一家族的另一成員 KLF8 在乳腺癌細胞中表達的亞細胞定位與乳腺癌的惡性生物學行為或預后究竟是怎樣的關系，這還有待進一步的研究。
此外，我們對包含 139 例乳腺癌組織的芯片進行免疫組織化學檢測并分析 KLF8 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系，結果發現，KLF8 蛋白高或低表達患者的 ER 和 PR 狀態比較差異有統計學意義（P<0.05），而二者的年齡、病理分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期及 HER-2 狀態方面比較差異未見有統計學意義（P>0.05）。ER 在乳腺癌的發生和發展中起著關鍵作用，乳腺癌內分泌治療主要是通過抑制或阻斷激素對腫瘤的“營養供給”，從而達到抑制或阻止癌細胞增長的目的，從而有效提高乳腺癌患者的生存質量。Akaogi 等[27]發現，使用 ERα 陽性乳腺癌細胞系 MCF-7 進行體外實驗，發現 KLF4 的表達可通過抑制 ERα 的轉錄活性進而抑制了雌激素依賴性細胞的生長，還發現 p53 的激活通過提高 KLF4 的表達降低了 ERα 的轉錄活性。但是另有研究[28]發現，同為 KLF 家族的 KLF6 卻被證實可通過抑制 c-Src 進而抑制乳腺癌中 ER 介導的細胞生長。在乳腺癌中 KLF8 與 ER 的關系目前尚缺乏相關研究，這也為我們下一步的研究提供了方向。最后我們還通過 Kaplan-Meier 生存分析發現 KLF8 高表達患者的預后較低表達患者差，并且單因素及多因素 Cox 比例風險回歸分析發現乳腺癌患者的 TNM 分期晚及 KLF8 高表達是影響預后的獨立危險因素。
從本研究結果發現，KLF8 在乳腺癌組織及乳腺癌細胞中均高表達，其可能作為促癌基因參與了乳腺癌的進展，因而 KLF8 有望成為預測乳腺癌預后的一個重要生物標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：翟秧秧是本研究的主要設計者和執行人，完成數據分析，論文的寫作；師鑫鵬參與研究設計并執行；羅曉勇是項目的構思者及負責人，指導研究設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。
倫理聲明：本研究通過了洛陽市中心醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：LWLL-2018-11-28）。
