引用本文： 汪濤, 范隆華, 陳斌, 劉堅軍, 李旭, 陶悅, 王曉俊, 黎力夢. NLRP3炎癥小體與下肢靜脈性潰瘍創面炎癥反應的相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(10): 1287-1293. doi: 10.7507/1007-9424.202101029 復制
下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcer，VLU）是下肢靜脈功能不全晚期嚴重并發癥之一，占下肢慢性潰瘍的 80%[1-2]。目前 VLU 的治療效果仍不滿意，一旦形成潰瘍，傷口難以愈合，在世界范圍內仍是導致患者住院時間延長、勞動力降低和致殘率增高的重要原因[3-4]。
近年來發現，炎癥反應在 VLU 的發生發展中發揮了極為重要的作用[5]。Coleridge Smith等[6]研究發現，下肢靜脈高壓導致白細胞易介導黏附分子與內皮細胞的黏附，激活釋放炎癥介質、氧自由基等，破壞傷口愈合正常進程，VLU 是一種系統性炎癥反應的結果。Signorelli 等[7]發現，VLU 可激活單核吞噬細胞，上調白細胞介素（IL）-1β、IL-6 等炎癥蛋白水平，致傷口持續炎癥和肉芽組織新生障礙，引起 VLU 傷口的延遲愈合或不愈合，提示下肢靜脈高壓狀態下過量炎癥反應可能是引起 VLU 傷口愈合障礙的重要機制之一。但是目前 VLU 通過何種路徑來加重炎癥反應仍不清楚。
IL-1β 和 IL-18 細胞因子是 IL 家族重要成員，在炎癥反應中發揮重要作用[8-9]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3（NLRP3）炎癥小體是目前研究最為廣泛且深入的炎癥小體之一，由多種蛋白聚合形成的復合體，調控 IL-1β、IL-6 等多種炎癥介質的合成[10-11]。但在 VLU 患者傷口中 NLRP3 炎癥小體表達如何目前仍不明確。本研究通過對 VLU 傷口區域皮膚組織炎癥因子、NLRP3 炎癥小體以及下游蛋白標志物的檢測，以探討 NLRP3 炎癥小體在 VLU 潰瘍傷口發生發展中的潛在作用機制。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入 2017 年 7 月至 2020 年 11 月期間在復旦大學附屬中山醫院青浦分院診治的 VLU 患者作為研究對象，其中活動性 VLU 患者 24 例（活動性潰瘍組），無滲出 VLU 患者 24 例作為陽性對照（非活動性潰瘍組），同時納入 24 例創傷傷口患者作為陰性對照（外傷傷口組）。活動性靜脈性潰瘍診斷標準：① 以小腿足靴區潰瘍為典型潰瘍區域，伴有色素沉著和傷口大量滲出；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜返流。非活動性靜脈性潰瘍診斷標準：① 以小腿足靴區潰瘍為典型潰瘍區域，伴有色素沉著但傷口無滲出；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜返流。外傷傷口診斷標準：① 以小腿足靴區傷口；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜無反流。本研究病例納入標準：① 靜脈性潰瘍患者符合靜脈性潰瘍診斷標準且臨床病因解剖病理生理學（CEAP ）分級為 C5～6 級；② 深靜脈瓣膜關閉功能不全或小腿交通支反流；③ 潰瘍形成時間超過 1 個月；④ 外傷傷口組患者符合外傷傷口的診斷標準。排除標準：① 伴有嚴重心肺肝腎等功能異常者；② 合并糖尿病或接受免疫抑制劑及糖皮質激素治療者；③ 患有精神類等疾病無法合作者；④ 踝肱指數小于 0.8。本研究是單中心前瞻性非隨機隊列研究，研究方案由復旦大學附屬中山醫院青浦分院醫學倫理委員會批準通過（批文編號：2020-03），所有患者均簽署知情同意書。
1.2 資料及標本收集
根據上述納入以及排除標準，本研究納入 48 例 VLU 患者和 24 例下肢外傷傷口患者，記錄所有患者入院時的基線資料，包括年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血糖、白蛋白、病程、傷口面積大小（創面大小）、合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒情況。采集 3 組患者創面組織標本 1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小，所取組織的一半予以 10% 甲醛固定，石蠟包埋切片備用；另一半組織予以?80 ℃ 冷凍保存備檢。
1.3 主要材料及試劑
牛血清白蛋白（BSA），北京索萊寶生物科技有限公司；SYBR Green PCR 試劑盒和逆轉錄試劑盒，Thermo 公司產品；DAB 濃縮型試劑盒和羊抗兔二抗，上海長島生物技術有限公司；PCR 引物由上海捷瑞合成；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，eBioscience 公司（美國）；RNaseⅠ，Fermentas 公司產品；兔抗鼠 NLRP3，Abcam 公司；Trizol，Invitrogen 公司。磷酸鹽緩沖溶液（PBS），600 mL 的 ddH2O 中溶解 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4，調節溶液 pH 至 7.4。
1.4 HE 及免疫組織化學染色
取 3 組患者入院當天創面組織包埋切片，HE 染色后觀察創面組織炎癥反應情況（包括中性粒細胞浸潤情況）。同時取組織切片經丙酮固定后，37 ℃ 孵育 15 min，加入一抗（兔抗鼠 NLRP3），孵育 1 h，PBS 沖洗，加羊抗兔二抗，37 ℃ 孵育 1 h，顯微鏡下觀察，以細胞質呈黃色或棕黃色染色為 NLRP3 蛋白陽性表達。
1.5 ELISA 檢測創面組織中 IL-1β 及 IL-18 蛋白水平
取 3 組患者冷凍組織剪碎并制成組織溶漿后，按照 ELISA 試劑盒說明書操作，檢測創面組織中 IL-1β 及 IL-18 蛋白水平，酶標儀測定 450 nm 處吸光度值（A值），以空白對照孔調零后測各孔A值，最后根據標準品的濃度與A值作標準曲線，計算 IL-1β 及 IL-18 蛋白表達水平。
1.6 Western blotting 法檢測創面組織中 NLRP3 蛋白的表達
提取 3 組患者創面組織的總蛋白，蛋白定量（二辛丁酸法）后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后 TBST 緩沖液洗膜 3 次。加一抗（兔抗鼠 NLRP3），37 ℃ 孵育過夜；加二抗（羊抗兔），37 ℃ 孵育 1 h，顯色劑顯色；FlourChem V 軟件分析電泳條帶灰度值，該灰度值代表各組 NLRP3 蛋白相對表達量。
1.7 RT-PCR 檢測創面組織中 NLRP3 下游蛋白標志物的 mRNA 表達水平
通過 Trizol 法提取 3 組患者創面組織的 RNA，以分光光度計定量。提取標本組織 RNA 后，參照逆轉錄試劑盒說明步驟，將 RNA 逆轉錄成 cDNA。通過 Invitrogen 軟件設計 PCR 引物，其引物序列見表 1。采用 RT-PCR 法檢測 3 組患者創面組織中凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）、C-Jun 氨基端激酶（JNK）、絲裂原活化蛋白激酶p38、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） p65以及 NF-κB 抑制蛋白α（NF-κB inhibitor alpha，NF-κB IkBα）的 mRNA 表達水平。
表1
本研究使用的 PCR 引物
1.8 統計學方法
采用 SPSS 17.0 進行數據分析。計量數據符合正態分布，用均數±標準差（
±s）表示，采用完全隨機設計資料的方差分析比較 3 組間計量數據的差異（年齡、BMI、ALT、肌酐、TC、血糖、白蛋白、病程和創面大小），兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；計數資料（性別、合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒）用“例（率）”表示，采用列聯表卡方（χ2）檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3 組患者的一般資料
3 組患者在年齡、性別、BMI、ALT、肌酐、TC、創面大小、病程、白蛋白、血糖以及合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒方面比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表 2。3 組患者的典型創面情況見圖 1a-1c。
表2
3 組患者入院時的基線資料比較
圖1
示 3 組患者的典型創面情況、創面組織炎癥反應情況及其 NLRP3 蛋白表達情況
a–c：典型創面情況；d–f：創面組織炎癥反應情況（HE ×100）；g–i：NLRP3 蛋白表達情況（免疫組織化學染色 ×100）
2.2 3 組患者創面組織炎癥反應情況
HE 染色結果見所有患者入院時其創面均存在不同程度肉芽增生；外傷傷口組和非活動性潰瘍組患者創面組織中含有少量炎性細胞浸潤，活動性潰瘍組患者創面組織中中性粒細胞浸潤更加明顯（圖 1d-1f）。
2.3 3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白免疫組織化學檢測結果
NLRP3 蛋白陽性表達顯示為棕黃色，主要定位于細胞質內，藍色顯示為細胞核。活動性潰瘍組創面組織中 NLRP3 蛋白表達陽性物質較外傷傷口組以及非活動性潰瘍組明顯增多（圖 1g-1i）。
2.4 3 組患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平總體比較差異有統計學意義（F=136.200，P<0.001；F=167.910，P<0.001），活動性潰瘍組創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平均高于外傷傷口組（P<0.05）和非活動性潰瘍組（P<0.05）。具體見表 3。
表3
3 組患者創面組織中各指標蛋白或 mRNA 表達水平檢測結果（
）
2.5 3 組患者創面組織中 NLRP3 下游蛋白標志物的 mRNA 表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 p38 mRNA 表達水平總體比較差異有統計學意義（F=10.949，P<0.001），活動性潰瘍組創面組織中 p38 mRNA 表達水平低于非活動性潰瘍組（P<0.05），與外傷傷口組比較差異無統計學意義（P>0.05）。ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB IkB-α 和 JNK 的 mRNA 表達水平均高于外傷傷口組（P<0.05）和非活動性潰瘍組（P<0.05）。具體見表 3。
2.6 3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白相對表達量總體比較差異有統計學意義（F=4.804，P=0.012），活動性潰瘍組創面組織中 NLRP3 蛋白相對表達量高于外傷傷口組（P<0.05）及非活動性潰瘍組（P<0.05），見表 3。
3 討論
難愈性 VLU 的發病機制仍不明確。目前認為，VLU 患者一般存在不同程度的下肢靜脈高壓，導致毛細血管內皮細胞間隙的增寬，致使血管內的纖維蛋白原等物質從間歇滲出并沉積在血管周圍，激活炎癥反應，因此在 VLU 患者中，創面組織長期處于慢性炎癥反應狀態[12-13]。在正常早期的創面愈合過程中，各類炎癥細胞趨化游走至創面周圍組織，可有效殺滅并清除創面的細菌等有害物質[14-15]。但是同時炎癥細胞通過釋放炎癥介質等直接或間接損傷創面組織，其中Ⅰ型巨噬細胞浸潤可導致創面組織長期處于慢性炎癥狀態，進而引起創面的延遲愈合或不愈合[4,16]。但目前就 VLU 創面長期炎癥因子過量表達的作用機制仍不明確。本研究結果發現，活動性潰瘍組 VLU 創面的炎癥反應較外傷傷口組重，NLRP3、ASC、caspase-1、JNK、NF-κB p65 以及 NF-κB IkB-α 炎癥指標的表達明顯上調，提示慢性炎癥反應可能是導致 VLU 創面不愈合或延遲愈合的機制，NLRP3 炎癥小體與 VLU 創面炎癥反應密切相關，可能為 VLU 的治療提供新的靶點。類似結果也出現在 Cavassan 等[17]的研究中，在納入的 37 例 VLU 患者其創面滲出液中發現炎癥介質水平升高。提示在 VLU 創面愈合過程中，炎性介質浸潤并貫穿整個創面愈合過程，是導致 VLU 創面發生發展的主要機制之一。
眾所周知，IL-1β 和 IL-18 是炎癥反應中重要的炎癥介質，在免疫調節以及慢性炎癥過程中發揮重要作用[18]。據文獻[18]報道，下肢靜脈高壓狀態可誘導巨噬細胞分泌 IL-1β 和 IL-18，同時 IL-1β 的合成可進一步誘導創面炎癥細胞分泌更多炎癥細胞因子，形成正反饋環路，加劇 VLU 創面炎癥反應，延遲創面愈合。本研究發現，活動性潰瘍組患者 VLU 創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平高于外傷傷口組，提示 VLU 創面存在過度的炎癥反應。該結果與 Zhu 等[9]的研究結果相似。提示 IL-1 等炎癥介質的高表達可能是 VLU 創面過度炎癥反應的重要因素。
NLRP3 炎癥小體是指由胞漿內模式識別受體（如 NLR）識別配體后，招募并活化促炎癥蛋白酶 caspase-1，酶切 IL-1β 和 IL-18 的前體，生成相應的成熟的炎癥分子，參與炎癥反應。NLRP3 炎癥小體由 NLRP3、caspase-1 和 ASC 組成，作為固有免疫中重要組成部分，在機體免疫過程中具有及其重要的作用[19-21]。細菌、病毒等外源性刺激物的多種成分誘導 NLRP3 活化，可誘導 IL-1β、IL-18 等促炎細胞因子產生。由于能被多種病原體所激活，NLRP3 炎癥小體目前被確認在家族性自身炎癥反應性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病過程中均發揮了關鍵作用[22]。作為炎癥反應的核心，NLRP3 炎癥小體在 VLU 患者中是否參與潰瘍創面的延遲愈合或不愈合目前尚不明確。本研究結果顯示，活動性潰瘍組患者的 VLU 創面組織中 NLRP3 的表達水平高于非活動性潰瘍組及外傷傷口組，且 caspase-1 及 ASC 的 mRNA 相對表達量也高于非活動性潰瘍組及外傷傷口組，提示 VLU 患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 的高表達可能與 NLRP3 炎癥小體的活化相關。
NF-κB 是一種具有轉錄調節功能的蛋白，一般以 p50/p65 異源二聚體形成存在，廣泛參與炎癥反應過程中基因轉錄的調節[23]。NF-κB 與 IκB 結合成無活性復合物，抑制基因轉錄[24]。本研究結果顯示，活動性潰瘍組患者 VLU 創面組織中 NF-κB p65 及 NF-κB p65 IκB-α 的 mRNA 表達水平均較外傷傷口組增高，這可能與 NLRP3 炎癥小體在靜脈高壓狀態下持續活化有關，下調 VLU 創面組織細胞 IκB 的表達，活化 NF-κB，提高 IL-1β、IL-18 等促炎細胞因子的表達，加重炎癥反應，使機體組織處于慢性炎癥狀態，延緩創面愈合[25]。
綜上所述，VLU 創面存在長期慢性炎癥反應，且 NLRP3 炎癥小體與 VLU 創面組織的過度炎癥反應密切相關，可能為 VLU 創面的治療提供新的靶點。本研究存在的不足是未進行 NLRP3 抑制劑應用的驗證，因此我們將進一步開展 NLRP3 抑制劑的 VLU 動物驗證研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：汪濤和陳斌負責資料的查閱和文章的撰寫；李旭、陶悅、王曉俊和黎力夢負責標本獲取、管理和統計；劉堅軍和范隆華負責文章內容的審閱及提出修改意見。
倫理聲明：本研究通過了復旦大學附屬中山醫院青浦分院醫學倫理委員會的倫理審核批準（批文編號：2020-03）。
下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcer，VLU）是下肢靜脈功能不全晚期嚴重并發癥之一，占下肢慢性潰瘍的 80%[1-2]。目前 VLU 的治療效果仍不滿意，一旦形成潰瘍，傷口難以愈合，在世界范圍內仍是導致患者住院時間延長、勞動力降低和致殘率增高的重要原因[3-4]。
近年來發現，炎癥反應在 VLU 的發生發展中發揮了極為重要的作用[5]。Coleridge Smith等[6]研究發現，下肢靜脈高壓導致白細胞易介導黏附分子與內皮細胞的黏附，激活釋放炎癥介質、氧自由基等，破壞傷口愈合正常進程，VLU 是一種系統性炎癥反應的結果。Signorelli 等[7]發現，VLU 可激活單核吞噬細胞，上調白細胞介素（IL）-1β、IL-6 等炎癥蛋白水平，致傷口持續炎癥和肉芽組織新生障礙，引起 VLU 傷口的延遲愈合或不愈合，提示下肢靜脈高壓狀態下過量炎癥反應可能是引起 VLU 傷口愈合障礙的重要機制之一。但是目前 VLU 通過何種路徑來加重炎癥反應仍不清楚。
IL-1β 和 IL-18 細胞因子是 IL 家族重要成員，在炎癥反應中發揮重要作用[8-9]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白 3（NLRP3）炎癥小體是目前研究最為廣泛且深入的炎癥小體之一，由多種蛋白聚合形成的復合體，調控 IL-1β、IL-6 等多種炎癥介質的合成[10-11]。但在 VLU 患者傷口中 NLRP3 炎癥小體表達如何目前仍不明確。本研究通過對 VLU 傷口區域皮膚組織炎癥因子、NLRP3 炎癥小體以及下游蛋白標志物的檢測，以探討 NLRP3 炎癥小體在 VLU 潰瘍傷口發生發展中的潛在作用機制。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入 2017 年 7 月至 2020 年 11 月期間在復旦大學附屬中山醫院青浦分院診治的 VLU 患者作為研究對象，其中活動性 VLU 患者 24 例（活動性潰瘍組），無滲出 VLU 患者 24 例作為陽性對照（非活動性潰瘍組），同時納入 24 例創傷傷口患者作為陰性對照（外傷傷口組）。活動性靜脈性潰瘍診斷標準：① 以小腿足靴區潰瘍為典型潰瘍區域，伴有色素沉著和傷口大量滲出；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜返流。非活動性靜脈性潰瘍診斷標準：① 以小腿足靴區潰瘍為典型潰瘍區域，伴有色素沉著但傷口無滲出；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜返流。外傷傷口診斷標準：① 以小腿足靴區傷口；② 多普勒超聲提示下肢淺靜脈瓣膜無反流。本研究病例納入標準：① 靜脈性潰瘍患者符合靜脈性潰瘍診斷標準且臨床病因解剖病理生理學（CEAP ）分級為 C5～6 級；② 深靜脈瓣膜關閉功能不全或小腿交通支反流；③ 潰瘍形成時間超過 1 個月；④ 外傷傷口組患者符合外傷傷口的診斷標準。排除標準：① 伴有嚴重心肺肝腎等功能異常者；② 合并糖尿病或接受免疫抑制劑及糖皮質激素治療者；③ 患有精神類等疾病無法合作者；④ 踝肱指數小于 0.8。本研究是單中心前瞻性非隨機隊列研究，研究方案由復旦大學附屬中山醫院青浦分院醫學倫理委員會批準通過（批文編號：2020-03），所有患者均簽署知情同意書。
1.2 資料及標本收集
根據上述納入以及排除標準，本研究納入 48 例 VLU 患者和 24 例下肢外傷傷口患者，記錄所有患者入院時的基線資料，包括年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血糖、白蛋白、病程、傷口面積大小（創面大小）、合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒情況。采集 3 組患者創面組織標本 1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小，所取組織的一半予以 10% 甲醛固定，石蠟包埋切片備用；另一半組織予以?80 ℃ 冷凍保存備檢。
1.3 主要材料及試劑
牛血清白蛋白（BSA），北京索萊寶生物科技有限公司；SYBR Green PCR 試劑盒和逆轉錄試劑盒，Thermo 公司產品；DAB 濃縮型試劑盒和羊抗兔二抗，上海長島生物技術有限公司；PCR 引物由上海捷瑞合成；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，eBioscience 公司（美國）；RNaseⅠ，Fermentas 公司產品；兔抗鼠 NLRP3，Abcam 公司；Trizol，Invitrogen 公司。磷酸鹽緩沖溶液（PBS），600 mL 的 ddH2O 中溶解 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4，調節溶液 pH 至 7.4。
1.4 HE 及免疫組織化學染色
取 3 組患者入院當天創面組織包埋切片，HE 染色后觀察創面組織炎癥反應情況（包括中性粒細胞浸潤情況）。同時取組織切片經丙酮固定后，37 ℃ 孵育 15 min，加入一抗（兔抗鼠 NLRP3），孵育 1 h，PBS 沖洗，加羊抗兔二抗，37 ℃ 孵育 1 h，顯微鏡下觀察，以細胞質呈黃色或棕黃色染色為 NLRP3 蛋白陽性表達。
1.5 ELISA 檢測創面組織中 IL-1β 及 IL-18 蛋白水平
取 3 組患者冷凍組織剪碎并制成組織溶漿后，按照 ELISA 試劑盒說明書操作，檢測創面組織中 IL-1β 及 IL-18 蛋白水平，酶標儀測定 450 nm 處吸光度值（A值），以空白對照孔調零后測各孔A值，最后根據標準品的濃度與A值作標準曲線，計算 IL-1β 及 IL-18 蛋白表達水平。
1.6 Western blotting 法檢測創面組織中 NLRP3 蛋白的表達
提取 3 組患者創面組織的總蛋白，蛋白定量（二辛丁酸法）后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后 TBST 緩沖液洗膜 3 次。加一抗（兔抗鼠 NLRP3），37 ℃ 孵育過夜；加二抗（羊抗兔），37 ℃ 孵育 1 h，顯色劑顯色；FlourChem V 軟件分析電泳條帶灰度值，該灰度值代表各組 NLRP3 蛋白相對表達量。
1.7 RT-PCR 檢測創面組織中 NLRP3 下游蛋白標志物的 mRNA 表達水平
通過 Trizol 法提取 3 組患者創面組織的 RNA，以分光光度計定量。提取標本組織 RNA 后，參照逆轉錄試劑盒說明步驟，將 RNA 逆轉錄成 cDNA。通過 Invitrogen 軟件設計 PCR 引物，其引物序列見表 1。采用 RT-PCR 法檢測 3 組患者創面組織中凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（caspase-1）、C-Jun 氨基端激酶（JNK）、絲裂原活化蛋白激酶p38、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） p65以及 NF-κB 抑制蛋白α（NF-κB inhibitor alpha，NF-κB IkBα）的 mRNA 表達水平。
表1
本研究使用的 PCR 引物
1.8 統計學方法
采用 SPSS 17.0 進行數據分析。計量數據符合正態分布，用均數±標準差（±s）表示，采用完全隨機設計資料的方差分析比較 3 組間計量數據的差異（年齡、BMI、ALT、肌酐、TC、血糖、白蛋白、病程和創面大小），兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；計數資料（性別、合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒）用“例（率）”表示，采用列聯表卡方（χ2）檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3 組患者的一般資料
3 組患者在年齡、性別、BMI、ALT、肌酐、TC、創面大小、病程、白蛋白、血糖以及合并高血壓、合并糖尿病、當前吸煙和當前飲酒方面比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表 2。3 組患者的典型創面情況見圖 1a-1c。
表2
3 組患者入院時的基線資料比較
圖1
示 3 組患者的典型創面情況、創面組織炎癥反應情況及其 NLRP3 蛋白表達情況
a–c：典型創面情況；d–f：創面組織炎癥反應情況（HE ×100）；g–i：NLRP3 蛋白表達情況（免疫組織化學染色 ×100）
2.2 3 組患者創面組織炎癥反應情況
HE 染色結果見所有患者入院時其創面均存在不同程度肉芽增生；外傷傷口組和非活動性潰瘍組患者創面組織中含有少量炎性細胞浸潤，活動性潰瘍組患者創面組織中中性粒細胞浸潤更加明顯（圖 1d-1f）。
2.3 3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白免疫組織化學檢測結果
NLRP3 蛋白陽性表達顯示為棕黃色，主要定位于細胞質內，藍色顯示為細胞核。活動性潰瘍組創面組織中 NLRP3 蛋白表達陽性物質較外傷傷口組以及非活動性潰瘍組明顯增多（圖 1g-1i）。
2.4 3 組患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平總體比較差異有統計學意義（F=136.200，P<0.001；F=167.910，P<0.001），活動性潰瘍組創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平均高于外傷傷口組（P<0.05）和非活動性潰瘍組（P<0.05）。具體見表 3。
表3
3 組患者創面組織中各指標蛋白或 mRNA 表達水平檢測結果（）
2.5 3 組患者創面組織中 NLRP3 下游蛋白標志物的 mRNA 表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 p38 mRNA 表達水平總體比較差異有統計學意義（F=10.949，P<0.001），活動性潰瘍組創面組織中 p38 mRNA 表達水平低于非活動性潰瘍組（P<0.05），與外傷傷口組比較差異無統計學意義（P>0.05）。ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB IkB-α 和 JNK 的 mRNA 表達水平均高于外傷傷口組（P<0.05）和非活動性潰瘍組（P<0.05）。具體見表 3。
2.6 3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白表達水平檢測結果
3 組患者創面組織中 NLRP3 蛋白相對表達量總體比較差異有統計學意義（F=4.804，P=0.012），活動性潰瘍組創面組織中 NLRP3 蛋白相對表達量高于外傷傷口組（P<0.05）及非活動性潰瘍組（P<0.05），見表 3。
3 討論
難愈性 VLU 的發病機制仍不明確。目前認為，VLU 患者一般存在不同程度的下肢靜脈高壓，導致毛細血管內皮細胞間隙的增寬，致使血管內的纖維蛋白原等物質從間歇滲出并沉積在血管周圍，激活炎癥反應，因此在 VLU 患者中，創面組織長期處于慢性炎癥反應狀態[12-13]。在正常早期的創面愈合過程中，各類炎癥細胞趨化游走至創面周圍組織，可有效殺滅并清除創面的細菌等有害物質[14-15]。但是同時炎癥細胞通過釋放炎癥介質等直接或間接損傷創面組織，其中Ⅰ型巨噬細胞浸潤可導致創面組織長期處于慢性炎癥狀態，進而引起創面的延遲愈合或不愈合[4,16]。但目前就 VLU 創面長期炎癥因子過量表達的作用機制仍不明確。本研究結果發現，活動性潰瘍組 VLU 創面的炎癥反應較外傷傷口組重，NLRP3、ASC、caspase-1、JNK、NF-κB p65 以及 NF-κB IkB-α 炎癥指標的表達明顯上調，提示慢性炎癥反應可能是導致 VLU 創面不愈合或延遲愈合的機制，NLRP3 炎癥小體與 VLU 創面炎癥反應密切相關，可能為 VLU 的治療提供新的靶點。類似結果也出現在 Cavassan 等[17]的研究中，在納入的 37 例 VLU 患者其創面滲出液中發現炎癥介質水平升高。提示在 VLU 創面愈合過程中，炎性介質浸潤并貫穿整個創面愈合過程，是導致 VLU 創面發生發展的主要機制之一。
眾所周知，IL-1β 和 IL-18 是炎癥反應中重要的炎癥介質，在免疫調節以及慢性炎癥過程中發揮重要作用[18]。據文獻[18]報道，下肢靜脈高壓狀態可誘導巨噬細胞分泌 IL-1β 和 IL-18，同時 IL-1β 的合成可進一步誘導創面炎癥細胞分泌更多炎癥細胞因子，形成正反饋環路，加劇 VLU 創面炎癥反應，延遲創面愈合。本研究發現，活動性潰瘍組患者 VLU 創面組織中 IL-1β 和 IL-18 蛋白表達水平高于外傷傷口組，提示 VLU 創面存在過度的炎癥反應。該結果與 Zhu 等[9]的研究結果相似。提示 IL-1 等炎癥介質的高表達可能是 VLU 創面過度炎癥反應的重要因素。
NLRP3 炎癥小體是指由胞漿內模式識別受體（如 NLR）識別配體后，招募并活化促炎癥蛋白酶 caspase-1，酶切 IL-1β 和 IL-18 的前體，生成相應的成熟的炎癥分子，參與炎癥反應。NLRP3 炎癥小體由 NLRP3、caspase-1 和 ASC 組成，作為固有免疫中重要組成部分，在機體免疫過程中具有及其重要的作用[19-21]。細菌、病毒等外源性刺激物的多種成分誘導 NLRP3 活化，可誘導 IL-1β、IL-18 等促炎細胞因子產生。由于能被多種病原體所激活，NLRP3 炎癥小體目前被確認在家族性自身炎癥反應性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病過程中均發揮了關鍵作用[22]。作為炎癥反應的核心，NLRP3 炎癥小體在 VLU 患者中是否參與潰瘍創面的延遲愈合或不愈合目前尚不明確。本研究結果顯示，活動性潰瘍組患者的 VLU 創面組織中 NLRP3 的表達水平高于非活動性潰瘍組及外傷傷口組，且 caspase-1 及 ASC 的 mRNA 相對表達量也高于非活動性潰瘍組及外傷傷口組，提示 VLU 患者創面組織中 IL-1β 和 IL-18 的高表達可能與 NLRP3 炎癥小體的活化相關。
NF-κB 是一種具有轉錄調節功能的蛋白，一般以 p50/p65 異源二聚體形成存在，廣泛參與炎癥反應過程中基因轉錄的調節[23]。NF-κB 與 IκB 結合成無活性復合物，抑制基因轉錄[24]。本研究結果顯示，活動性潰瘍組患者 VLU 創面組織中 NF-κB p65 及 NF-κB p65 IκB-α 的 mRNA 表達水平均較外傷傷口組增高，這可能與 NLRP3 炎癥小體在靜脈高壓狀態下持續活化有關，下調 VLU 創面組織細胞 IκB 的表達，活化 NF-κB，提高 IL-1β、IL-18 等促炎細胞因子的表達，加重炎癥反應，使機體組織處于慢性炎癥狀態，延緩創面愈合[25]。
綜上所述，VLU 創面存在長期慢性炎癥反應，且 NLRP3 炎癥小體與 VLU 創面組織的過度炎癥反應密切相關，可能為 VLU 創面的治療提供新的靶點。本研究存在的不足是未進行 NLRP3 抑制劑應用的驗證，因此我們將進一步開展 NLRP3 抑制劑的 VLU 動物驗證研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：汪濤和陳斌負責資料的查閱和文章的撰寫；李旭、陶悅、王曉俊和黎力夢負責標本獲取、管理和統計；劉堅軍和范隆華負責文章內容的審閱及提出修改意見。
倫理聲明：本研究通過了復旦大學附屬中山醫院青浦分院醫學倫理委員會的倫理審核批準（批文編號：2020-03）。
