引用本文： 劉家瑞, 肖衡, 杜成友. 肝細胞肝癌免疫分型的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(9): 1237-1242. doi: 10.7507/1007-9424.202011062 復制
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌類型，占原發性肝癌病例的 75%～85%[1]。全球每年新增 HCC 病例超 50 萬例[2]，其致死率位于惡性腫瘤的第 2 位，主要與病毒感染和肝纖維化密切相關[3]。在過去的 10 年中，基因測序技術的突破推動了腫瘤基因組的研究，闡明了肝癌發生發展的部分分子機制，為肝癌的治療提供了更多的選擇[4-5]。近年來，惡性腫瘤免疫治療取得了突破性進展[6]。在晚期肝癌的治療中，多種免疫檢查點抑制劑（ICIs），如納武單抗（nivolumab）、派姆單抗（pembrolizumab）、卡瑞利珠單抗等被國內外多個指南推薦作為肝癌的臨床治療選擇。遺憾的是，對當前現有的 ICIs 藥物在肝癌治療中效果的多項研究顯示出令人不滿意的功效：單藥低反應率[7-8]。肝癌作為一種免疫原性腫瘤，與相關病毒感染和形成的炎癥環境密切相關。在近 5 年里，研究人員開始聚焦于腫瘤微環境的探究，揭露了在肝臟這個免疫特赦器官中[9]免疫微環境與腫瘤的相互作用關系、免疫逃逸和治療抵抗的機制，以及挖掘潛在的免疫治療靶點。基于這些發現，研究人員將 HCC 進行了免疫分型，旨在更好地評估 HCC 患者的預后以及為免疫治療的決策提供指導，同時也是目前 HCC 治療趨向個性化的一項重要補充。筆者現就 HCC 基于腫瘤微環境的免疫分型及其臨床應用價值進行綜述。
1 目前 HCC 的診療現狀
HCC 患者的治療主要依據病理分類分型，根據綜合各因素的分期方案以指導治療決策。國外有多種分期方案，如：巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC 分期）、TNM 分期、Edmondson 分期、亞太肝病學會分期（APASL 分期）等，其中 BCLC 分期方案被國內外所廣泛認可。2019 年版《原發性肝癌診療規范》 [10]依據我國患者的一般情況、肝腫瘤情況以及肝功能情況，更新了中國肝癌的分期方案（China liver cancer staging，CNLC），包括：Ⅰ a 期、Ⅰ b 期、Ⅱa 期、Ⅱb 期、Ⅲa 期、Ⅲb 期和Ⅳ期。針對Ⅰ期和Ⅱa 期的患者，主要采用手術切除和肝移植治療；對于Ⅱb 期和Ⅲ期患者，除了肝動脈化療栓塞術（TACE）和手術切除外，還有推薦的一線藥物治療，如索拉菲尼、侖伐替尼等。隨著 2017 年美國食品藥品監督管理局（FDA）批準納武單抗用于晚期肝癌的二線治療[8]，更多的 ICIs 被推薦應用于晚期肝癌的治療。同時，近 20 年來，研究者通過基因技術對轉錄組分子進行分型，發現了許多 HCC 分子亞型與 HCC 的預后有顯著的相關性，這也為不同類型患者采用相應的分子靶向藥物奠定了基礎[11]。由于免疫治療在晚期肝癌中的治療效果未達預期，研究者開始將目光轉向腫瘤的免疫微環境，旨在揭露肝癌的免疫機制，進而對 HCC 患者進行更準確的分類，從而選擇更有效的個性化治療方案。
2 基于腫瘤微環境基因組的免疫分型
2017 年，TCGA 團隊[12]對 196 例肝癌的組織病理學資料的分析顯示，22% 的肝癌顯示出高度或中度的淋巴細胞浸潤；該團隊進一步對 66 種免疫標志物的基因表達結果進行無監督分層聚類，識別了 6 個腫瘤樣本簇，其中有兩個簇顯示免疫標志物的高表達，包括的免疫檢查點基因有：細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（CTLA-4）、程序性死亡受體 1（PD-1）和程序性死亡配體 1（PD-L1）。這可能說明了：ICIs 治療對含有中度或高度淋巴細胞浸潤，以及免疫抑制分子高表達的 HCC 能產生強烈的效應[13]。
同年，Sia 等[14]通過檢測 228 例 HCC 樣本中與免疫相關的基因組信號，進一步進行無監督聚類，最終發現了一個新類群，占總樣本數的 24%（55/228），他們將其定義為“免疫類（immune class）”。與非免疫類樣本比較，免疫類患者具有炎癥反應的標志，其特征包括免疫細胞的高度浸潤、增強的細胞溶解活性、PD-1 和 PD-L1 的高表達、活躍的干擾素-g（IFN-g）信號以及類似于對免疫治療有強反應的黑色素瘤的分子特征；再以 728 例患者的 HCC 樣本進行驗證，也發現近 25% 的患者有炎癥反應的標志，推測這類患者可能是接受免疫治療的理想人選；此外，在對腫瘤微環境免疫信號的進一步探究中，發現了 3 種特征性的樣本，具有不同的免疫浸潤細胞類型和免疫反應，可以進一步分為不同的亞型（圖 1）。
圖1
示基于腫瘤微環境基因組的免疫分型
2.1 免疫衰竭型（exhausted immune subtype）
在 33%（18/55）的免疫類患者中，其腫瘤微環境的免疫簇表現出抑制的免疫反應，以促瘤信號為特征，如 T 細胞衰竭，轉化生長因子-β（TGF-β）、M2 型巨噬細胞等免疫抑制成分富集，Sia 等[14]將具有該特征的免疫類患者定義為免疫衰竭型。值得一提的是，TGF-β 是一種在侵襲性癌癥中經常過度表達的有效免疫調節細胞因子，其活化后能調節腫瘤上皮-間質的相互作用、血管生成和轉移，并通過誘導 T 細胞衰竭[15-16]和促進 M2 型巨噬細胞形成[17]來抑制宿主免疫應答，提示免疫衰竭型是一種更具有侵襲性的免疫亞型。吳志超等[18]的研究顯示，TGF-β1的高表達與腫瘤大小、血管侵犯、AFP 水平、腫瘤數目和分化程度有相關性。因而該類患者通過TGF-β 抑制劑聯合 ICIs 治療獲得更多收益是可能的。
2.2 免疫激活型（active immune subtype）
在剩余的免疫類患者中（67%，37/55），其腫瘤微環境的免疫簇表現出抗腫瘤特征，如 T 細胞和干擾素（IFN）信號的富集以及適應性免疫反應基因的過度表達，Sia 等[14]將其稱為主動免疫反應，并將擁有該特征的免疫類患者定義為免疫激活型；同時將免疫衰竭型和免疫激活型的免疫簇與臨床參數相關聯，發現主動免疫反應組（免疫激活型）的腫瘤復發率更低且生存趨勢更好。
2.3 免疫豁免型（privileged immune subtype）
在總的患者樣本中，有一類始終被排除在免疫類之外，樊嘉等[19]將其定義為免疫豁免型，其特征是肝臟相關的 Wnt 靶基因過表達、核型 β-連環蛋白染色的富集和 CTNNB1 基因的突變。CTNNB1 途徑的激活與 T 細胞排斥相關。與免疫類患者和非免疫類其他類型患者相比較，免疫豁免型表現出更低水平的免疫特征信號富集，特別是 T 細胞浸潤的缺乏。
3 基于腫瘤微環境免疫細胞的免疫分型
2018 年，Kurebayashi 等[20]利用多重免疫組織化學染色方法，對來自 141 例患者的 158 份肝癌樣本的 919 個區域的免疫細胞進行了全面的聚類分析，將其分為了 3 種不同的免疫亞型：高免疫亞型（immune-high subtype）、中免疫亞型（immune-mid subtype）和低免疫亞型（immune-high subtype）。高免疫亞型以 B 細胞、漿細胞以及 T 細胞浸潤增多為特征，中免疫亞型的 T 細胞和其他免疫細胞浸潤中度增加、B 細胞和漿細胞浸潤較少，低免疫亞型的免疫細胞浸潤程度很低；同時，該研究還闡述了高免疫亞型和 B 細胞浸潤是獨立的預后因素。以高免疫亞型為主的高級別肝癌患者的預后明顯較好，特別是 CK19+ 或 SALL4+ 高級別 HCC[5, 21]。以高免疫亞型為主的 HCC 約占低分化 HCC 的 25%[20]，在低分化 HCC 中也發現高免疫亞型會獲得明顯更好的預后。特別地，高免疫亞型有一個富含 CXCL9、CXCL10 趨化因子以及 Th1、CTL 型細胞因子的免疫微環境，而 CXCL9 和 CXCL10 的表達與許多腫瘤的淋巴細胞浸潤有關[22-23]，這與上述基于基因組方法定義的“免疫類”相一致。
隨后，在 2019 年，Zhang 等[24]收集了來自 8 例 HCC 患者的 42 份樣本，通過聚集腫瘤微環境的免疫細胞，比較樣本之間的相似性并進行分層聚類，最終形成了 3 個聚類。接著，該研究還進一步揭示了不同亞型的免疫狀態、趨化因子和細胞因子表達水平以及細胞代謝的特征。同時，為了臨床實用性，該團隊利用兩種免疫組織化學檢測的標志物的密度界值定義了這 3 種免疫亞型（圖 2）。
圖2
示基于腫瘤微環境免疫細胞的免疫分型
3.1 免疫活性亞型（immunocompetent subtype）
將 HCC 組織進行免疫組織化學染色，以 CD45+ 細胞 ≥100 個/mm2 定義為 CD45 高表達，同時以 Foxp3+ 細胞 <25 個/mm2 定義為 Foxp3 低表達，CD45 高表達和 Foxp3 低表達定義為免疫活性亞型。免疫活性亞型有相對正常的 T 細胞浸潤水平 ［包含抗腫瘤 T 細胞（CD8+CD127+ T 細胞、CD4+CD127+ T 細胞和 γδT 細胞）］ 以及較少浸潤的 B 細胞特別是 Breg 細胞。而且該亞型特有的尿素循環代謝提供了更多的精氨酸，可通過增強 T 細胞存活能力及其抗腫瘤功能來增強免疫[25]。因而免疫活性亞型 HCC 患者具有相對較強的抗腫瘤免疫能力，預后更加良好。然而，該亞型的細胞毒性分子的釋放水平相對較低，這提示其浸潤性 T 細胞的抗腫瘤功能可被進一步激活，所以就免疫活性亞型患者而言，T 細胞反應激活劑（如 IL-12 和 CpG 寡核苷酸）和 ICIs 的聯合使用可能是有效的治療方案[26-28]。
3.2 免疫缺陷亞型（immunodeficient subtype）
以 CD45+ 細胞 <100 個/mm2定義為 CD45 低表達，此類患者歸為免疫缺陷亞型，其特點是樹突狀細胞（DC 細胞）和自然殺傷細胞（NK 細胞）的富集，淋巴細胞浸潤的減少以及 CD45+ 細胞的缺乏（與其他 2 個亞型相比減少約 40%[24]）。在免疫缺陷亞型樣本中發現髓系抑制細胞（MDSCs）的增加，同時所有與免疫抑制相關的標記信號：如淋巴細胞活化基因-3（LAG3）、程序性細胞死亡基因（PDCD1）、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）、帶有免疫球蛋白及 ITIM 結構域的 T 細胞免疫受體（TIGIT）、腫瘤壞死因子受體超家族 9（TNFRSF9）以及功能基因 ［如顆粒酶 A（GZMA）和顆粒酶 B（GZMB）］ 的表達水平均上調，所有趨化因子和細胞因子的表達水平都很低，這些特點與其免疫缺陷相符合。免疫缺陷亞型肝癌更像是所謂的“冷”腫瘤，幾乎沒有浸潤的淋巴細胞，這限制了 ICIs 的療效。因此，ICIs 與溶瘤病毒（如 JX-594）或多肽（如 LTX-315）聯合應用可顯著增強淋巴細胞浸潤[29-31]，對該亞型肝癌有較好的治療前景。抗腫瘤血管生成的靶向藥物（如索拉非尼或貝伐單抗）通過促進 T 細胞轉運或抑制 MDSCs 也可能提高 ICIs 對該亞型患者的療效[32-33]。
3.3 免疫抑制亞型（immunosuppressive subtype）
CD45 高表達和 Foxp3 高表達者定義為免疫抑制亞型。該亞型以 Treg 細胞和免疫抑制性 CD4+ T 細胞（CD4+CD25+CD127–Foxp3+ T 細胞）增多為特征[34]，免疫抑制亞型樣本顯示為高密度的 Treg 細胞、Breg 細胞和 M2 型巨噬細胞，這些細胞都是免疫抑制細胞，且包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4在內的免疫抑制分子的表達水平顯著上調；同時，還觀察到血管內皮生長因子 A（VEGFA）和許多編碼抑制腫瘤的趨化因子或細胞因子的基因（如 TGF-β1、CCL8 和 IL-10）的過度表達。免疫抑制型 HCC 患者具有正常的淋巴細胞浸潤，但免疫抑制細胞的數目顯著增加。然而，值得注意的是，盡管免疫抑制成分在 RNA 和蛋白質水平上都被檢測到過表達，但具有細胞毒功能的基因（如顆粒酶家族成員和 IFN-g）的上調表明抑制的細胞毒性 T 細胞是在激活時誘導的，而不是由固有缺陷誘導的[35]。所以在這種情況下，多種 ICIs 治療可以恢復這些抑制性 T 細胞的抗腫瘤效力，提高免疫治療反應效率；而且，VEGFA 和 TGF-β1 的過度表達提示 ICIs 聯合抗血管生成藥物可能使患者獲益更多。
4 免疫分型在臨床中的應用價值
目前，基于免疫治療的精準識別主要依賴生物標志物（biomarker），以預測免疫治療反應，確定哪些患者將從治療中受益最大，從而提供有價值的決策和預后信息。腫瘤細胞或浸潤性免疫細胞的PD-L1 表達上調、高腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞密度增加是最被認可的與治療反應相關的生物標志物。在 2015 和 2016 年，美國 FDA 將 PD-L1 的免疫組織化學染色分別納入肺癌和黑色素瘤的輔助檢查中，肯定了 PD-L1 的表達在兩種疾病診斷和治療中的價值。但在 CheckMate 040 研究中[8]，納武單抗治療晚期 HCC 患者的亞組分析結果顯示，PD-L1 表達陽性（PD-L1≥1%）患者的有效率比 PD-L1 陰性患者（PD-L1<1%）略高（爬坡組：27% 比 12%；擴展組：26% 比 19%），表明對 HCC 而言，PD-L1 作為反應生物標志物的能力一般。Yarchoan 等[36]匯總了公開發表的臨床試驗中接受過 PD-1/PD-L1 抑制劑治療的 27 種腫瘤（包括 HCC）的結果，發現各腫瘤的免疫應答率與 TMB 呈線性關系：TMB 越大，PD-1 抑制劑有效率越高。最近，Samstein 等[37]還證實了 TMB 能預測多種腫瘤免疫治療后的生存率，并與接受 ICIs 治療的患者的存活率提高有關，ICIs 的療效隨著 TMB 值的增加而增高。遺憾的是，該研究沒有納入 HCC 患者，高突變是否與接受 ICIs 的 HCC 患者的預后呈正相關有待進一步研究。此外，一些臨床試驗也評估了 CD8+ T 細胞密度與抗PD-1/PD-L1 治療的臨床療效之間的相關性。例如，在抗 PD1 治療黑色素瘤的一項研究中[38]，CD8+ T 細胞密度與抗 PD1 治療的反應呈正相關。最近的一項研究[39]顯示，抑制性的高表達 PD-1 的 CD8+ T 細胞密度與 HCC 的臨床預后不良相關，其密度隨腫瘤分期的增加而增加，提示抑制性的 CD8+ T 細胞密度與 HCC 的進展有關，可作為一個潛在的免疫治療靶點。此外，病毒相關腫瘤對 PD-1 通路阻斷有很高的反應率，HBV 和 HCV 導致的 HCC 對抗 PD-1 治療的有效應答率已有報道。Yarchoan 等[36]的研究也顯示一些與病毒相關的腫瘤（包括 HCC）的客觀應答率高于預期，這表明在某些腫瘤類型中出現病毒抗原可能會增加抗 PD-1 治療的應答率。這可能是因為致癌病毒的整合代表了腫瘤的另一種基因改變，賦予了新的抗原性，亦或是病毒感染與慢性炎癥的作用賦予了上述相關的免疫類型。
腫瘤特異性突變可導致編碼新抗原，基因突變負荷較大的腫瘤可能擁有更多的新抗原，因此患者擁有更多浸潤的腫瘤特異性 T 細胞。由此可見，PD-L1 的表達、TMB 以及腫瘤浸潤性淋巴細胞在功能上是相互關聯的，并且經常在單個腫瘤標本中協同發現。同樣，基于分子水平和細胞水平的兩種免疫分型方法，在免疫類型的特征上有高度相似的地方，說明了在異質性很強的 HCC 中，其免疫微環境是相對穩定的，這使 HCC 的免疫分型成為可能。此外，與單因素標記相比，多因素標記具有更強的預測能力，這奠定了 HCC 免疫分型的臨床應用基礎。對腫瘤微環境進行廣泛的免疫分析，從不同水平并綜合多因素進行分類分型，可以更全面地指導 HCC 的治療，從而改善預后。例如：在免疫激活亞型中，其正常的 T 淋巴細胞浸潤以及較少的細胞毒性分子提示 ICIs 與 T 細胞反應激活劑聯合應用可能有效。免疫豁免型或免疫缺陷亞型的 HCC 患者由于缺乏 T 細胞的浸潤而限制了 ICIs 的療效，這與腫瘤浸潤性淋巴細胞密度作為生物標志物的研究結果相一致，對該類患者采用 ICIs 與增強淋巴細胞浸潤的溶瘤病毒或者促進 T 細胞轉運的抗腫瘤血管生成的靶向藥物（索拉非尼或貝伐單抗）聯合治療可能會提高反應率。同樣地，在免疫抑制亞型的 HCC 患者中，包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4 在內的免疫抑制性分子的表達水平增加，且 VEGFA 和 TGF-β1 過表達，提示多種 ICIs 聯用可能對逆轉免疫抑制性 T 細胞更有效，ICIs 聯合抗血管生成藥物也可能帶來更多獲益。樊嘉團隊[40]篩選出了幾個特定的肝癌微環境免疫生物標志物（包括 CD3、CD27、CD68、CD103 和PD-1），并聯合腫瘤大小、分化程度和 γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）構建了一個預后模型，其準確性顯著優于傳統的臨床分期。另一項研究[41]建立了一個整合免疫類型、病理表現（腫瘤出芽）、AFP 水平、HBV 感染、微血管侵犯（MVI）和腫瘤分級信息的預后模型，該模型在試驗組和驗證組均顯示出比單獨的 BCLC 或 TNM 分期更好的預后能力。所以，基于 HCC 腫瘤微環境的免疫分型在生物標志物的基礎上，還綜合了更多影響患者治療效應以及生存預后的因素，對未來 HCC 的治療和預后有更全面、更準確的臨床指導作用。
5 小結與展望
免疫治療為晚期肝癌患者帶來了新的治療途徑，而如今較低的客觀反應率以及治療效果阻礙了它的發展。基于腫瘤免疫微環境的免疫分型與 HCC 患者的抗腫瘤能力以及生存有顯著的關聯，能夠更全面指導 HCC 患者免疫治療的篩選和決策，以提高免疫治療的療效和預后評估，讓更多的患者從中獲益。近幾年，腫瘤微環境成為國內外研究的熱點，基于它對 HCC 進行免疫分型還在研究初期，其潛在的臨床應用價值需要進一步的大規模隊列研究來驗證。同時可以發現，不管是目前發現的生物標志物，還是各種免疫分型方案，它們都有顯著的共性，因而尋找制定出統一規范的 HCC 免疫微環境評估方案是可行的，相信這是 HCC 免疫治療未來的研究方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉家瑞和肖衡參與了文章的起草和修改，以及圖的制作；杜成友對文章進行了審閱。
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌類型，占原發性肝癌病例的 75%～85%[1]。全球每年新增 HCC 病例超 50 萬例[2]，其致死率位于惡性腫瘤的第 2 位，主要與病毒感染和肝纖維化密切相關[3]。在過去的 10 年中，基因測序技術的突破推動了腫瘤基因組的研究，闡明了肝癌發生發展的部分分子機制，為肝癌的治療提供了更多的選擇[4-5]。近年來，惡性腫瘤免疫治療取得了突破性進展[6]。在晚期肝癌的治療中，多種免疫檢查點抑制劑（ICIs），如納武單抗（nivolumab）、派姆單抗（pembrolizumab）、卡瑞利珠單抗等被國內外多個指南推薦作為肝癌的臨床治療選擇。遺憾的是，對當前現有的 ICIs 藥物在肝癌治療中效果的多項研究顯示出令人不滿意的功效：單藥低反應率[7-8]。肝癌作為一種免疫原性腫瘤，與相關病毒感染和形成的炎癥環境密切相關。在近 5 年里，研究人員開始聚焦于腫瘤微環境的探究，揭露了在肝臟這個免疫特赦器官中[9]免疫微環境與腫瘤的相互作用關系、免疫逃逸和治療抵抗的機制，以及挖掘潛在的免疫治療靶點。基于這些發現，研究人員將 HCC 進行了免疫分型，旨在更好地評估 HCC 患者的預后以及為免疫治療的決策提供指導，同時也是目前 HCC 治療趨向個性化的一項重要補充。筆者現就 HCC 基于腫瘤微環境的免疫分型及其臨床應用價值進行綜述。
1 目前 HCC 的診療現狀
HCC 患者的治療主要依據病理分類分型，根據綜合各因素的分期方案以指導治療決策。國外有多種分期方案，如：巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC 分期）、TNM 分期、Edmondson 分期、亞太肝病學會分期（APASL 分期）等，其中 BCLC 分期方案被國內外所廣泛認可。2019 年版《原發性肝癌診療規范》 [10]依據我國患者的一般情況、肝腫瘤情況以及肝功能情況，更新了中國肝癌的分期方案（China liver cancer staging，CNLC），包括：Ⅰ a 期、Ⅰ b 期、Ⅱa 期、Ⅱb 期、Ⅲa 期、Ⅲb 期和Ⅳ期。針對Ⅰ期和Ⅱa 期的患者，主要采用手術切除和肝移植治療；對于Ⅱb 期和Ⅲ期患者，除了肝動脈化療栓塞術（TACE）和手術切除外，還有推薦的一線藥物治療，如索拉菲尼、侖伐替尼等。隨著 2017 年美國食品藥品監督管理局（FDA）批準納武單抗用于晚期肝癌的二線治療[8]，更多的 ICIs 被推薦應用于晚期肝癌的治療。同時，近 20 年來，研究者通過基因技術對轉錄組分子進行分型，發現了許多 HCC 分子亞型與 HCC 的預后有顯著的相關性，這也為不同類型患者采用相應的分子靶向藥物奠定了基礎[11]。由于免疫治療在晚期肝癌中的治療效果未達預期，研究者開始將目光轉向腫瘤的免疫微環境，旨在揭露肝癌的免疫機制，進而對 HCC 患者進行更準確的分類，從而選擇更有效的個性化治療方案。
2 基于腫瘤微環境基因組的免疫分型
2017 年，TCGA 團隊[12]對 196 例肝癌的組織病理學資料的分析顯示，22% 的肝癌顯示出高度或中度的淋巴細胞浸潤；該團隊進一步對 66 種免疫標志物的基因表達結果進行無監督分層聚類，識別了 6 個腫瘤樣本簇，其中有兩個簇顯示免疫標志物的高表達，包括的免疫檢查點基因有：細胞毒性 T 淋巴細胞相關蛋白 4（CTLA-4）、程序性死亡受體 1（PD-1）和程序性死亡配體 1（PD-L1）。這可能說明了：ICIs 治療對含有中度或高度淋巴細胞浸潤，以及免疫抑制分子高表達的 HCC 能產生強烈的效應[13]。
同年，Sia 等[14]通過檢測 228 例 HCC 樣本中與免疫相關的基因組信號，進一步進行無監督聚類，最終發現了一個新類群，占總樣本數的 24%（55/228），他們將其定義為“免疫類（immune class）”。與非免疫類樣本比較，免疫類患者具有炎癥反應的標志，其特征包括免疫細胞的高度浸潤、增強的細胞溶解活性、PD-1 和 PD-L1 的高表達、活躍的干擾素-g（IFN-g）信號以及類似于對免疫治療有強反應的黑色素瘤的分子特征；再以 728 例患者的 HCC 樣本進行驗證，也發現近 25% 的患者有炎癥反應的標志，推測這類患者可能是接受免疫治療的理想人選；此外，在對腫瘤微環境免疫信號的進一步探究中，發現了 3 種特征性的樣本，具有不同的免疫浸潤細胞類型和免疫反應，可以進一步分為不同的亞型（圖 1）。
圖1
示基于腫瘤微環境基因組的免疫分型
2.1 免疫衰竭型（exhausted immune subtype）
在 33%（18/55）的免疫類患者中，其腫瘤微環境的免疫簇表現出抑制的免疫反應，以促瘤信號為特征，如 T 細胞衰竭，轉化生長因子-β（TGF-β）、M2 型巨噬細胞等免疫抑制成分富集，Sia 等[14]將具有該特征的免疫類患者定義為免疫衰竭型。值得一提的是，TGF-β 是一種在侵襲性癌癥中經常過度表達的有效免疫調節細胞因子，其活化后能調節腫瘤上皮-間質的相互作用、血管生成和轉移，并通過誘導 T 細胞衰竭[15-16]和促進 M2 型巨噬細胞形成[17]來抑制宿主免疫應答，提示免疫衰竭型是一種更具有侵襲性的免疫亞型。吳志超等[18]的研究顯示，TGF-β1的高表達與腫瘤大小、血管侵犯、AFP 水平、腫瘤數目和分化程度有相關性。因而該類患者通過TGF-β 抑制劑聯合 ICIs 治療獲得更多收益是可能的。
2.2 免疫激活型（active immune subtype）
在剩余的免疫類患者中（67%，37/55），其腫瘤微環境的免疫簇表現出抗腫瘤特征，如 T 細胞和干擾素（IFN）信號的富集以及適應性免疫反應基因的過度表達，Sia 等[14]將其稱為主動免疫反應，并將擁有該特征的免疫類患者定義為免疫激活型；同時將免疫衰竭型和免疫激活型的免疫簇與臨床參數相關聯，發現主動免疫反應組（免疫激活型）的腫瘤復發率更低且生存趨勢更好。
2.3 免疫豁免型（privileged immune subtype）
在總的患者樣本中，有一類始終被排除在免疫類之外，樊嘉等[19]將其定義為免疫豁免型，其特征是肝臟相關的 Wnt 靶基因過表達、核型 β-連環蛋白染色的富集和 CTNNB1 基因的突變。CTNNB1 途徑的激活與 T 細胞排斥相關。與免疫類患者和非免疫類其他類型患者相比較，免疫豁免型表現出更低水平的免疫特征信號富集，特別是 T 細胞浸潤的缺乏。
3 基于腫瘤微環境免疫細胞的免疫分型
2018 年，Kurebayashi 等[20]利用多重免疫組織化學染色方法，對來自 141 例患者的 158 份肝癌樣本的 919 個區域的免疫細胞進行了全面的聚類分析，將其分為了 3 種不同的免疫亞型：高免疫亞型（immune-high subtype）、中免疫亞型（immune-mid subtype）和低免疫亞型（immune-high subtype）。高免疫亞型以 B 細胞、漿細胞以及 T 細胞浸潤增多為特征，中免疫亞型的 T 細胞和其他免疫細胞浸潤中度增加、B 細胞和漿細胞浸潤較少，低免疫亞型的免疫細胞浸潤程度很低；同時，該研究還闡述了高免疫亞型和 B 細胞浸潤是獨立的預后因素。以高免疫亞型為主的高級別肝癌患者的預后明顯較好，特別是 CK19+ 或 SALL4+ 高級別 HCC[5, 21]。以高免疫亞型為主的 HCC 約占低分化 HCC 的 25%[20]，在低分化 HCC 中也發現高免疫亞型會獲得明顯更好的預后。特別地，高免疫亞型有一個富含 CXCL9、CXCL10 趨化因子以及 Th1、CTL 型細胞因子的免疫微環境，而 CXCL9 和 CXCL10 的表達與許多腫瘤的淋巴細胞浸潤有關[22-23]，這與上述基于基因組方法定義的“免疫類”相一致。
隨后，在 2019 年，Zhang 等[24]收集了來自 8 例 HCC 患者的 42 份樣本，通過聚集腫瘤微環境的免疫細胞，比較樣本之間的相似性并進行分層聚類，最終形成了 3 個聚類。接著，該研究還進一步揭示了不同亞型的免疫狀態、趨化因子和細胞因子表達水平以及細胞代謝的特征。同時，為了臨床實用性，該團隊利用兩種免疫組織化學檢測的標志物的密度界值定義了這 3 種免疫亞型（圖 2）。
圖2
示基于腫瘤微環境免疫細胞的免疫分型
3.1 免疫活性亞型（immunocompetent subtype）
將 HCC 組織進行免疫組織化學染色，以 CD45+ 細胞 ≥100 個/mm2 定義為 CD45 高表達，同時以 Foxp3+ 細胞 <25 個/mm2 定義為 Foxp3 低表達，CD45 高表達和 Foxp3 低表達定義為免疫活性亞型。免疫活性亞型有相對正常的 T 細胞浸潤水平 ［包含抗腫瘤 T 細胞（CD8+CD127+ T 細胞、CD4+CD127+ T 細胞和 γδT 細胞）］ 以及較少浸潤的 B 細胞特別是 Breg 細胞。而且該亞型特有的尿素循環代謝提供了更多的精氨酸，可通過增強 T 細胞存活能力及其抗腫瘤功能來增強免疫[25]。因而免疫活性亞型 HCC 患者具有相對較強的抗腫瘤免疫能力，預后更加良好。然而，該亞型的細胞毒性分子的釋放水平相對較低，這提示其浸潤性 T 細胞的抗腫瘤功能可被進一步激活，所以就免疫活性亞型患者而言，T 細胞反應激活劑（如 IL-12 和 CpG 寡核苷酸）和 ICIs 的聯合使用可能是有效的治療方案[26-28]。
3.2 免疫缺陷亞型（immunodeficient subtype）
以 CD45+ 細胞 <100 個/mm2定義為 CD45 低表達，此類患者歸為免疫缺陷亞型，其特點是樹突狀細胞（DC 細胞）和自然殺傷細胞（NK 細胞）的富集，淋巴細胞浸潤的減少以及 CD45+ 細胞的缺乏（與其他 2 個亞型相比減少約 40%[24]）。在免疫缺陷亞型樣本中發現髓系抑制細胞（MDSCs）的增加，同時所有與免疫抑制相關的標記信號：如淋巴細胞活化基因-3（LAG3）、程序性細胞死亡基因（PDCD1）、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）、帶有免疫球蛋白及 ITIM 結構域的 T 細胞免疫受體（TIGIT）、腫瘤壞死因子受體超家族 9（TNFRSF9）以及功能基因 ［如顆粒酶 A（GZMA）和顆粒酶 B（GZMB）］ 的表達水平均上調，所有趨化因子和細胞因子的表達水平都很低，這些特點與其免疫缺陷相符合。免疫缺陷亞型肝癌更像是所謂的“冷”腫瘤，幾乎沒有浸潤的淋巴細胞，這限制了 ICIs 的療效。因此，ICIs 與溶瘤病毒（如 JX-594）或多肽（如 LTX-315）聯合應用可顯著增強淋巴細胞浸潤[29-31]，對該亞型肝癌有較好的治療前景。抗腫瘤血管生成的靶向藥物（如索拉非尼或貝伐單抗）通過促進 T 細胞轉運或抑制 MDSCs 也可能提高 ICIs 對該亞型患者的療效[32-33]。
3.3 免疫抑制亞型（immunosuppressive subtype）
CD45 高表達和 Foxp3 高表達者定義為免疫抑制亞型。該亞型以 Treg 細胞和免疫抑制性 CD4+ T 細胞（CD4+CD25+CD127–Foxp3+ T 細胞）增多為特征[34]，免疫抑制亞型樣本顯示為高密度的 Treg 細胞、Breg 細胞和 M2 型巨噬細胞，這些細胞都是免疫抑制細胞，且包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4在內的免疫抑制分子的表達水平顯著上調；同時，還觀察到血管內皮生長因子 A（VEGFA）和許多編碼抑制腫瘤的趨化因子或細胞因子的基因（如 TGF-β1、CCL8 和 IL-10）的過度表達。免疫抑制型 HCC 患者具有正常的淋巴細胞浸潤，但免疫抑制細胞的數目顯著增加。然而，值得注意的是，盡管免疫抑制成分在 RNA 和蛋白質水平上都被檢測到過表達，但具有細胞毒功能的基因（如顆粒酶家族成員和 IFN-g）的上調表明抑制的細胞毒性 T 細胞是在激活時誘導的，而不是由固有缺陷誘導的[35]。所以在這種情況下，多種 ICIs 治療可以恢復這些抑制性 T 細胞的抗腫瘤效力，提高免疫治療反應效率；而且，VEGFA 和 TGF-β1 的過度表達提示 ICIs 聯合抗血管生成藥物可能使患者獲益更多。
4 免疫分型在臨床中的應用價值
目前，基于免疫治療的精準識別主要依賴生物標志物（biomarker），以預測免疫治療反應，確定哪些患者將從治療中受益最大，從而提供有價值的決策和預后信息。腫瘤細胞或浸潤性免疫細胞的PD-L1 表達上調、高腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞密度增加是最被認可的與治療反應相關的生物標志物。在 2015 和 2016 年，美國 FDA 將 PD-L1 的免疫組織化學染色分別納入肺癌和黑色素瘤的輔助檢查中，肯定了 PD-L1 的表達在兩種疾病診斷和治療中的價值。但在 CheckMate 040 研究中[8]，納武單抗治療晚期 HCC 患者的亞組分析結果顯示，PD-L1 表達陽性（PD-L1≥1%）患者的有效率比 PD-L1 陰性患者（PD-L1<1%）略高（爬坡組：27% 比 12%；擴展組：26% 比 19%），表明對 HCC 而言，PD-L1 作為反應生物標志物的能力一般。Yarchoan 等[36]匯總了公開發表的臨床試驗中接受過 PD-1/PD-L1 抑制劑治療的 27 種腫瘤（包括 HCC）的結果，發現各腫瘤的免疫應答率與 TMB 呈線性關系：TMB 越大，PD-1 抑制劑有效率越高。最近，Samstein 等[37]還證實了 TMB 能預測多種腫瘤免疫治療后的生存率，并與接受 ICIs 治療的患者的存活率提高有關，ICIs 的療效隨著 TMB 值的增加而增高。遺憾的是，該研究沒有納入 HCC 患者，高突變是否與接受 ICIs 的 HCC 患者的預后呈正相關有待進一步研究。此外，一些臨床試驗也評估了 CD8+ T 細胞密度與抗PD-1/PD-L1 治療的臨床療效之間的相關性。例如，在抗 PD1 治療黑色素瘤的一項研究中[38]，CD8+ T 細胞密度與抗 PD1 治療的反應呈正相關。最近的一項研究[39]顯示，抑制性的高表達 PD-1 的 CD8+ T 細胞密度與 HCC 的臨床預后不良相關，其密度隨腫瘤分期的增加而增加，提示抑制性的 CD8+ T 細胞密度與 HCC 的進展有關，可作為一個潛在的免疫治療靶點。此外，病毒相關腫瘤對 PD-1 通路阻斷有很高的反應率，HBV 和 HCV 導致的 HCC 對抗 PD-1 治療的有效應答率已有報道。Yarchoan 等[36]的研究也顯示一些與病毒相關的腫瘤（包括 HCC）的客觀應答率高于預期，這表明在某些腫瘤類型中出現病毒抗原可能會增加抗 PD-1 治療的應答率。這可能是因為致癌病毒的整合代表了腫瘤的另一種基因改變，賦予了新的抗原性，亦或是病毒感染與慢性炎癥的作用賦予了上述相關的免疫類型。
腫瘤特異性突變可導致編碼新抗原，基因突變負荷較大的腫瘤可能擁有更多的新抗原，因此患者擁有更多浸潤的腫瘤特異性 T 細胞。由此可見，PD-L1 的表達、TMB 以及腫瘤浸潤性淋巴細胞在功能上是相互關聯的，并且經常在單個腫瘤標本中協同發現。同樣，基于分子水平和細胞水平的兩種免疫分型方法，在免疫類型的特征上有高度相似的地方，說明了在異質性很強的 HCC 中，其免疫微環境是相對穩定的，這使 HCC 的免疫分型成為可能。此外，與單因素標記相比，多因素標記具有更強的預測能力，這奠定了 HCC 免疫分型的臨床應用基礎。對腫瘤微環境進行廣泛的免疫分析，從不同水平并綜合多因素進行分類分型，可以更全面地指導 HCC 的治療，從而改善預后。例如：在免疫激活亞型中，其正常的 T 淋巴細胞浸潤以及較少的細胞毒性分子提示 ICIs 與 T 細胞反應激活劑聯合應用可能有效。免疫豁免型或免疫缺陷亞型的 HCC 患者由于缺乏 T 細胞的浸潤而限制了 ICIs 的療效，這與腫瘤浸潤性淋巴細胞密度作為生物標志物的研究結果相一致，對該類患者采用 ICIs 與增強淋巴細胞浸潤的溶瘤病毒或者促進 T 細胞轉運的抗腫瘤血管生成的靶向藥物（索拉非尼或貝伐單抗）聯合治療可能會提高反應率。同樣地，在免疫抑制亞型的 HCC 患者中，包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4 在內的免疫抑制性分子的表達水平增加，且 VEGFA 和 TGF-β1 過表達，提示多種 ICIs 聯用可能對逆轉免疫抑制性 T 細胞更有效，ICIs 聯合抗血管生成藥物也可能帶來更多獲益。樊嘉團隊[40]篩選出了幾個特定的肝癌微環境免疫生物標志物（包括 CD3、CD27、CD68、CD103 和PD-1），并聯合腫瘤大小、分化程度和 γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）構建了一個預后模型，其準確性顯著優于傳統的臨床分期。另一項研究[41]建立了一個整合免疫類型、病理表現（腫瘤出芽）、AFP 水平、HBV 感染、微血管侵犯（MVI）和腫瘤分級信息的預后模型，該模型在試驗組和驗證組均顯示出比單獨的 BCLC 或 TNM 分期更好的預后能力。所以，基于 HCC 腫瘤微環境的免疫分型在生物標志物的基礎上，還綜合了更多影響患者治療效應以及生存預后的因素，對未來 HCC 的治療和預后有更全面、更準確的臨床指導作用。
5 小結與展望
免疫治療為晚期肝癌患者帶來了新的治療途徑，而如今較低的客觀反應率以及治療效果阻礙了它的發展。基于腫瘤免疫微環境的免疫分型與 HCC 患者的抗腫瘤能力以及生存有顯著的關聯，能夠更全面指導 HCC 患者免疫治療的篩選和決策，以提高免疫治療的療效和預后評估，讓更多的患者從中獲益。近幾年，腫瘤微環境成為國內外研究的熱點，基于它對 HCC 進行免疫分型還在研究初期，其潛在的臨床應用價值需要進一步的大規模隊列研究來驗證。同時可以發現，不管是目前發現的生物標志物，還是各種免疫分型方案，它們都有顯著的共性，因而尋找制定出統一規范的 HCC 免疫微環境評估方案是可行的，相信這是 HCC 免疫治療未來的研究方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉家瑞和肖衡參與了文章的起草和修改，以及圖的制作；杜成友對文章進行了審閱。
