引用本文： 湯蕾, 符德元. 循環腫瘤 DNA 在乳腺癌早期診斷中的臨床應用進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(8): 1086-1090. doi: 10.7507/1007-9424.202011048 復制
乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，具有高度的時間異質性與空間異質性[1]。盡管近年來在乳腺癌的早期診斷和及時治療方面已經取得了長足的進步，但是有些看似已經治療成功的早期乳腺癌患者會在原發腫瘤切除后 5 年之內出現復發和轉移，乳腺癌仍然是全球女性人群中與癌癥相關的主要死亡原因之一[2]。因此乳腺癌的早期診斷以及轉移復發的早期發現具有十分重要的臨床意義，應致力于發掘更有效的生物標志物以提高乳腺癌以及轉移復發的早期診斷率。循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一種由腫瘤細胞產生的含有腫瘤相關突變基因的循環游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA），可以動態地反映腫瘤基因組全貌[3]。有研究[4]證實，術后對乳腺癌患者進行 ctDNA 的定期檢測可以比傳統的影像學檢查更早地檢測出微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）的存在。ctDNA 在預測乳腺癌復發中的靈敏度高達 89%，特異性高達 100%[5]。由此可見，ctDNA 的檢測有希望成為一種更好、更有效的方法，來確定哪些乳腺癌患者存在較高的復發風險。除此之外，ctDNA 在乳腺癌的早期診斷中也發揮了極其重要的作用，這促使其成為乳腺癌中的一種新興的液體活檢分析指標。筆者現結合最新文獻，對 ctDNA 的檢測技術以及其在乳腺癌的篩查、診斷、復發轉移的早期發現等方面中的作用作一綜述，以期通過總結最新的臨床應用進展，揭示 ctDNA 在乳腺癌診斷中的潛在臨床應用價值。
1 ctDNA 的特性
cfDNA 是由體細胞分泌的，或由體細胞凋亡、壞死后產生并釋放到血液循環中的 DNA。cfDNA 主要來源于凋亡細胞，而 ctDNA 是由腫瘤細胞產生的 cfDNA[3]。ctDNA 是整個腫瘤基因組的潛在替代物，對于檢測轉移性疾病和研究腫瘤負荷具有較高的靈敏度。高水平的 ctDNA 與腫瘤大小、淋巴結受累、組織病理學分級和臨床分期密切相關，與腫瘤負荷也存在直接相關性[6]，因此，ctDNA 在乳腺癌的早期診斷及復發轉移的早期發現中發揮著十分重要的作用。
與傳統的組織學活檢相比，ctDNA 不但具有創傷小、取材方便、可重復等優點，而且能夠實時提供乳腺癌基因組改變方面的相關信息，包括基因突變、拷貝數變異、甲基化富集等[7]。Board 等[8]發現，血漿 ctDNA 與腫瘤組織樣本基因突變之間的一致性為 95%，而 Rodriguez 等[9]通過對血漿 ctDNA 的測序分析，還揭示了先前在組織活檢中未發現的另外 4 個 ctDNA 突變，克服了組織活檢的局限性。另外，ctDNA 還可以實時提供乳腺癌疾病進展過程中腫瘤基因組的動態進化能力信息[7]。而傳統的醫學成像技術與 ctDNA 相比，可能無法檢測腫瘤負荷的變化；另外，連續的放射成像不僅十分昂貴，而且對于乳腺癌患者還存在著放射性危害，不適用于對治療效果的長期連續監測[7]。但是 ctDNA 與傳統的醫學成像技術相比也存在一個缺陷，就是 ctDNA 的檢測不易檢測出復發部位[10]。
與其他的液體活檢分析物相比，ctDNA 也具有很多優勢。第一，ctDNA 的靈敏度較高，是循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的 50 倍以上[3]。另外，癌胚抗原（CEA）、糖類抗原 15-3（CA15-3）也存在于健康個體的血清中，靈敏度和特異性都不高，不能作為乳腺癌診斷的生物檢測指標[1, 11]，而且它們主要適用于晚期乳腺癌患者和轉移性乳腺癌患者，不適用于早期乳腺癌患者的篩查與診斷[2, 12]。其次，ctDNA 可以反映所有病灶的平均水平，并且半衰期短，半衰期僅為 15 min 至數小時，因此可以實時監測腫瘤負荷。研究[13-15]證實，ctDNA 的增加反映了腫瘤負荷的增加，淋巴結受累越多、腫瘤體積越大、病期越晚的乳腺癌患者中，ctDNA 的含量就越高。第三，ctDNA 的檢測方法多種多樣，而且提取技術也日漸成熟[7]。最重要的一點是，對 ctDNA 檢測的同時可以進行腫瘤的基因組突變分析，有助于評估腫瘤內部異質性，有助于檢測出亞克隆突變，有助于乳腺癌患者的個性化治療，而獲得相同水平的信息通常需要大量的 CTC 或數個實體組織活檢標本才能實現[15-16]。
2 ctDNA 的檢測技術
在健康個體中，血漿中 cfDNA 的濃度通常為 5～10 ng/mL，而在癌癥患者中，其濃度可能會增加 50 倍[1]。血漿中的 ctDNA 的豐度非常低且高度可變，并且當機體處于良性疾病或者處于炎癥狀態時，ctDNA 會受到其他 cfDNA 片段的干擾，因此對 ctDNA 及其突變的檢測非常具有挑戰性。近年來有研究證明，可以通過分子量不同這個特性將 ctDNA 與其他正常組織來源的 DNA 分離，分離特定長度（長度在 90 到 150 堿基對之間）的 DNA 片段可以提高 ctDNA 的檢測靈敏度[17]。另外，根據 ctDNA 攜帶與原發腫瘤相同的基因突變這一特征也可以將 ctDNA 與其他 cfDNA 區分開來[6]。然而，當等位基因突變頻率較低時，更易出現假陰性與假陽性的結果，這就帶來了檢測可靠性的問題[18]。
2.1 ctDNA 的常用檢測技術
ctDNA 的檢測方法包括 DNA 靶向測序以及非靶向二代測序（non-targeted next generation sequencing）。DNA 靶向測序相比較而言更加靈敏，缺點是只能檢測到已知突變，需要患者的腫瘤突變譜的詳細信息；非靶向二代測序的優勢是可以檢測出原發病灶中代表性不足的亞克隆突變，發現未知的突變，但敏感性較低并且需要更高濃度的 ctDNA[4]。
BEAMing（beads-emulsion-amplification-magnetics）和標記擴增深度測序（tagged-amplicon deep sequencing，Tam-Seq）是兩種比較常見的 DNA 靶向測序技術。BEAMing 技術將流式技術與數字聚合酶鏈式反應完美結合，對檢測 ctDNA 的突變有著高敏感性，鑒定出的磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位 α（PIK3CA）基因突變與組織活檢的一致性為 100%，但步驟十分復雜，成本比較高，不利于臨床上的推廣使用。而 Tam-Seq 豐富了樣品序列，兩步擴增，重復測序，所需的時間短，降低了假陽性率，并且成本較低，兼具敏感性和實用性[4]。
2.2 ctDNA 檢測技術的新進展
近年來，ctDNA 的檢測技術有了很多的新進展。例如，集成數字錯誤抑制增強的深度測序腫瘤個體化建檔法是近兩年新開發出的一種錯誤校正方法，克服了 cfDNA 對 ctDNA 造成的測序偽像等干擾因素，降低了假陽性率，提高了檢測 ctDNA 中低頻等位基因的靈敏度和特異性[19]。靶向錯誤校正測序（targeted error correction sequencing，TEC-Seq）可以降低測序的錯誤率，靈敏度也很高[20]。CancerSEEK 不僅可以檢測出基因突變，還可以檢測出異常蛋白質的存在，有助于識別出最有可能罹患乳腺癌的患者，但 CancerSEEK 的一個缺點就是評估乳腺癌的靈敏度較低，僅有 33%[21]。
McDonald 等[22]新研發出的靶向數字測序（targeted digital sequencing，TARDIS）解決了當前大多數方法都無法解決的一個難題—對于非轉移性乳腺癌患者在治療過程中或治療完成后的 ctDNA 檢測缺乏足夠的敏感性，TARDIS 能對特異性癌癥突變進行多重分析，將當前檢測技術的 ctDNA 的檢測極限提高了 100 倍。然而，TARDIS 存在的局限性是價格高昂，而且靈敏度取決于每例患者可供分析的突變數[23]。2018 年 Hu 等[24]研究出的 Fe-Au 納米粒子耦合體系已被證實可用于 ctDNA 的檢測且具有高靈敏度。
3 ctDNA 在乳腺癌診斷中的應用
在乳腺癌的早期階段，由于有限的腫瘤負荷，血漿中的 ctDNA 的水平很低[17]，這使 ctDNA 在乳腺癌的早期診斷中的使用受到了限制，導致采用 ctDNA 進行早期乳腺癌的診斷具有挑戰性。但隨著研究的進一步深入，ctDNA 在乳腺癌早期診斷以及轉移復發的早期診斷方面還是取得了一些進展。
3.1 乳腺癌的早期診斷
一直以來 ctDNA 在早期乳腺癌中的應用受到限制，但近年來有研究證實在早期乳腺癌患者中進行 ctDNA 的分析是可行的。Rodriguez 等[9]對 29 例鉬靶表現為乳腺影像報告和數據系統（Breast Imaging Reporting and Data System，BIRADS）4C 類或者 5 類病變且隨后確診為原發性乳腺癌的患者，在腫瘤活檢之前采集血漿對 ctDNA 進行了測序，并比較了活檢組織樣本和血漿 ctDNA 間 PIK3CA和腫瘤抑制基因 P53（TP53）突變的一致性，結果在 13 例血漿 ctDNA 突變患者中，有 8 例突變與匹配的組織樣本是一致的，這提示 ctDNA 分析可應用于早期乳腺癌的診斷。
能否建立 ctDNA 濃度的閾值水平作為乳腺癌的診斷依據也是一個值得深入探討的問題。早在 2012 年 Leary 等[25]試圖通過實驗量化 ctDNA 區分癌癥患者和健康人群的能力，證實了 ctDNA 的濃度≥0.75% 時，其對乳腺癌的診斷具有高靈敏度和高特異性。鑒定 ctDNA 與癌癥相關的特定突變是否有助于區分乳腺良性疾病與惡性腫瘤還需要進行更多的研究。ctDNA 的腫瘤特異性染色體重排的檢測為早期檢測出 MRD、診斷無癥狀轉移復發提供了一種靈敏的方法，在臨床上，觀察到轉移征象前 11 個月就可以檢測到 ctDNA 中腫瘤特異性染色體的重排[26]。另外，研究[27]證實，乳腺導管癌組血清中脆性組氨酸三聯體基因（fragile histine traid，FHIT）的 ctDNA 甲基化水平高于乳腺纖維腺瘤組和健康個體組，這表明血清中 FHIT 的 ctDNA 甲基化水平與乳腺癌顯著相關，其定量檢測可能可以在乳腺導管癌的早期診斷中發揮作用。
眾所周知，cfDNA 有兩個來源：ctDNA 和除 ctDNA 以外的其他 cfDNA。ctDNA 的長度小于 200 個堿基對，除 ctDNA 以外的其他 cfDNA 的長度可達到幾千個堿基對。因此，有學者提出可以使用血漿 DNA 完整性指數（較長的 DNA 片段與較短的 DNA 片段之間的比率）作為癌癥的診斷指標，經研究證實乳腺癌患者的 DNA 完整性指數是健康人群的 2 倍[1]。
目前 Miyamura 等[28]證實，ctDNA 同樣可以從乳腺癌患者的局部淋巴結中檢出；這項研究還得出一個結論：無轉移的前哨淋巴結較無轉移的非前哨淋巴結，其 ctDNA 突變的頻率更高；前哨淋巴結突變陽性的患者中，血清 ctDNA 突變陽性的可能性更高。該結果提示，對患者進行淋巴結的 ctDNA 檢測也許會對乳腺癌的診斷有所幫助。
能否將 ctDNA 與其他的液體活檢分析物相結合，使其成為一種乳腺癌的輔助篩查手段還值得深入探究。其他液體活檢分析物包括代謝物、蛋白質等。代謝物如支鏈氨基酸，其價值已經在肺癌和胰腺癌中得到證實；蛋白質如循環中的半胱天冬酶已被證實在檢測乳腺癌方面有著卓越的價值[16]。將 ctDNA 與這些液體活檢分析物結合的研究還比較少，需要更多的證據證明液體活檢的多參數分析在臨床上的有效性和實用性。
3.2 乳腺癌轉移復發的早期診斷
乳腺癌患者血漿中的 ctDNA 水平主要受腫瘤的體積和腫瘤細胞的更新速度這兩個因素的影響，經過一系列根治性治療后濃度會進一步降低[29]。
ctDNA 在乳腺癌轉移復發的早期發現中也發揮著重要的作用。Olsson 等[26]針對原發性乳腺癌患者進行了研究，證實 ctDNA 的術前水平有助于轉移復發的早期發現，20 例患者中有 4 例患者的術前血漿樣本中可以檢測到 ctDNA 的存在，檢測到 ctDNA 的患者最終均復發；另外 ctDNA 的監測對于在初次手術后不久的某個時間點測量 MRD 中可能也是可行的。研究[17]證實，可以通過檢測 ctDNA 預測接受化療、手術、放療等治療的非轉移性乳腺癌患者的復發，對 43 例患者進行連續地突變追蹤，發現 ctDNA 的檢測可以在臨床出現腫瘤復發征象之前預測復發，中位提前時間為 7.9 個月，從而有利于指導臨床決策，早期介入二線治療。另外，Lee 等[30]經研究發現，對接受免疫治療后的乳腺癌患者出現的疾病進展是真性進展還是假性進展，通過對 ctDNA 的連續檢測可以將兩者區分開來。
對乳腺癌患者 ctDNA 的突變追蹤可以識別出高復發風險的早期乳腺癌患者。Chung 等[31]對 254 例雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌患者的 ctDNA 進行了基因組分析，以確定與復發/轉移性乳腺癌相關的基因組變異，發現 TP53、雌激素受體 1（ESR1）和 PIK3CA 是突變最多的基因，在 78% 的樣品中發現 TP53、ESR1 和 PIK3CA 中至少有一個基因組發生改變。另外，ctDNA 中檢測到的與化學抗性相關的突變包括端粒酶逆轉錄酶（TERT）、脂肪非典型鈣黏蛋白 1（FAT1）、組蛋白甲基轉移酶（SETD2）、跨膜受體蛋白 Notch4、維甲酸受體 α（RARA）和混合細胞系白血病 3 基因（MLL3）突變，這些 ctDNA 的突變可能與乳腺癌疾病進展有關[1]。有研究[32]證明，ctDNA 中檢測到的 PIK3CA 突變持續 4 周似乎與無進展生存期高度相關。而且，ctDNA 中 ESR1 突變患者的無進展生存期明顯縮短[33-34]。通過對血漿 DNA 中基因甲基化的測量還可以早期發現原發癌及其轉移到其他器官的證據[35]。
4 小結與展望
綜上所述，ctDNA 是一種有前途、有潛力的生物檢測指標。ctDNA 作為一種常規生物檢測指標，應用于臨床后將為非侵入性癌癥管理提供一種有效的方法，有利于乳腺癌的精準治療和個體化治療。然而，由于 ctDNA 作為一種檢測乳腺癌 MRD 的生物標志物，用于指導治療決策時對于檢測技術的要求很高，此外 ctDNA 的檢測方法大多比較昂貴并且步驟復雜，這限制了其在臨床實踐中的推廣使用。除此以外，很多 ctDNA 分析前變量（包括樣本的類型和數量、處理變量、存儲條件和持續時間）都會影響 ctDNA 的檢測結果。目前正在努力尋找一種更加經濟快捷的方法以簡化 ctDNA 的檢測步驟，提高 ctDNA 的提取效率，解決分析前變量對 ctDNA 的檢測結果的干擾，以實現將 ctDNA 的檢測常規應用于臨床的目標，以期在乳腺癌的早期診斷中發揮作用，在出現臨床癥狀之前及影像學出現明顯復發轉移證據之前實現對乳腺癌患者轉移復發的早期診斷，并預測疾病的復發和進展。目前的研究主要局限于利用血漿進行 ctDNA 的檢測，其他體液（如尿液或唾液）的分析也可能具有巨大潛力。在將 ctDNA 的檢測引入臨床實踐應用之前，我們還需要尋找更好的方法來克服機體炎癥狀態對 ctDNA 分析的干擾，還需要尋找適合進行液體活檢的特定時間點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：湯蕾參與選題與設計，并撰寫和修改論文；符德元指導選題與設計，并撰寫和修改論文。
乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，具有高度的時間異質性與空間異質性[1]。盡管近年來在乳腺癌的早期診斷和及時治療方面已經取得了長足的進步，但是有些看似已經治療成功的早期乳腺癌患者會在原發腫瘤切除后 5 年之內出現復發和轉移，乳腺癌仍然是全球女性人群中與癌癥相關的主要死亡原因之一[2]。因此乳腺癌的早期診斷以及轉移復發的早期發現具有十分重要的臨床意義，應致力于發掘更有效的生物標志物以提高乳腺癌以及轉移復發的早期診斷率。循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一種由腫瘤細胞產生的含有腫瘤相關突變基因的循環游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA），可以動態地反映腫瘤基因組全貌[3]。有研究[4]證實，術后對乳腺癌患者進行 ctDNA 的定期檢測可以比傳統的影像學檢查更早地檢測出微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）的存在。ctDNA 在預測乳腺癌復發中的靈敏度高達 89%，特異性高達 100%[5]。由此可見，ctDNA 的檢測有希望成為一種更好、更有效的方法，來確定哪些乳腺癌患者存在較高的復發風險。除此之外，ctDNA 在乳腺癌的早期診斷中也發揮了極其重要的作用，這促使其成為乳腺癌中的一種新興的液體活檢分析指標。筆者現結合最新文獻，對 ctDNA 的檢測技術以及其在乳腺癌的篩查、診斷、復發轉移的早期發現等方面中的作用作一綜述，以期通過總結最新的臨床應用進展，揭示 ctDNA 在乳腺癌診斷中的潛在臨床應用價值。
1 ctDNA 的特性
cfDNA 是由體細胞分泌的，或由體細胞凋亡、壞死后產生并釋放到血液循環中的 DNA。cfDNA 主要來源于凋亡細胞，而 ctDNA 是由腫瘤細胞產生的 cfDNA[3]。ctDNA 是整個腫瘤基因組的潛在替代物，對于檢測轉移性疾病和研究腫瘤負荷具有較高的靈敏度。高水平的 ctDNA 與腫瘤大小、淋巴結受累、組織病理學分級和臨床分期密切相關，與腫瘤負荷也存在直接相關性[6]，因此，ctDNA 在乳腺癌的早期診斷及復發轉移的早期發現中發揮著十分重要的作用。
與傳統的組織學活檢相比，ctDNA 不但具有創傷小、取材方便、可重復等優點，而且能夠實時提供乳腺癌基因組改變方面的相關信息，包括基因突變、拷貝數變異、甲基化富集等[7]。Board 等[8]發現，血漿 ctDNA 與腫瘤組織樣本基因突變之間的一致性為 95%，而 Rodriguez 等[9]通過對血漿 ctDNA 的測序分析，還揭示了先前在組織活檢中未發現的另外 4 個 ctDNA 突變，克服了組織活檢的局限性。另外，ctDNA 還可以實時提供乳腺癌疾病進展過程中腫瘤基因組的動態進化能力信息[7]。而傳統的醫學成像技術與 ctDNA 相比，可能無法檢測腫瘤負荷的變化；另外，連續的放射成像不僅十分昂貴，而且對于乳腺癌患者還存在著放射性危害，不適用于對治療效果的長期連續監測[7]。但是 ctDNA 與傳統的醫學成像技術相比也存在一個缺陷，就是 ctDNA 的檢測不易檢測出復發部位[10]。
與其他的液體活檢分析物相比，ctDNA 也具有很多優勢。第一，ctDNA 的靈敏度較高，是循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的 50 倍以上[3]。另外，癌胚抗原（CEA）、糖類抗原 15-3（CA15-3）也存在于健康個體的血清中，靈敏度和特異性都不高，不能作為乳腺癌診斷的生物檢測指標[1, 11]，而且它們主要適用于晚期乳腺癌患者和轉移性乳腺癌患者，不適用于早期乳腺癌患者的篩查與診斷[2, 12]。其次，ctDNA 可以反映所有病灶的平均水平，并且半衰期短，半衰期僅為 15 min 至數小時，因此可以實時監測腫瘤負荷。研究[13-15]證實，ctDNA 的增加反映了腫瘤負荷的增加，淋巴結受累越多、腫瘤體積越大、病期越晚的乳腺癌患者中，ctDNA 的含量就越高。第三，ctDNA 的檢測方法多種多樣，而且提取技術也日漸成熟[7]。最重要的一點是，對 ctDNA 檢測的同時可以進行腫瘤的基因組突變分析，有助于評估腫瘤內部異質性，有助于檢測出亞克隆突變，有助于乳腺癌患者的個性化治療，而獲得相同水平的信息通常需要大量的 CTC 或數個實體組織活檢標本才能實現[15-16]。
2 ctDNA 的檢測技術
在健康個體中，血漿中 cfDNA 的濃度通常為 5～10 ng/mL，而在癌癥患者中，其濃度可能會增加 50 倍[1]。血漿中的 ctDNA 的豐度非常低且高度可變，并且當機體處于良性疾病或者處于炎癥狀態時，ctDNA 會受到其他 cfDNA 片段的干擾，因此對 ctDNA 及其突變的檢測非常具有挑戰性。近年來有研究證明，可以通過分子量不同這個特性將 ctDNA 與其他正常組織來源的 DNA 分離，分離特定長度（長度在 90 到 150 堿基對之間）的 DNA 片段可以提高 ctDNA 的檢測靈敏度[17]。另外，根據 ctDNA 攜帶與原發腫瘤相同的基因突變這一特征也可以將 ctDNA 與其他 cfDNA 區分開來[6]。然而，當等位基因突變頻率較低時，更易出現假陰性與假陽性的結果，這就帶來了檢測可靠性的問題[18]。
2.1 ctDNA 的常用檢測技術
ctDNA 的檢測方法包括 DNA 靶向測序以及非靶向二代測序（non-targeted next generation sequencing）。DNA 靶向測序相比較而言更加靈敏，缺點是只能檢測到已知突變，需要患者的腫瘤突變譜的詳細信息；非靶向二代測序的優勢是可以檢測出原發病灶中代表性不足的亞克隆突變，發現未知的突變，但敏感性較低并且需要更高濃度的 ctDNA[4]。
BEAMing（beads-emulsion-amplification-magnetics）和標記擴增深度測序（tagged-amplicon deep sequencing，Tam-Seq）是兩種比較常見的 DNA 靶向測序技術。BEAMing 技術將流式技術與數字聚合酶鏈式反應完美結合，對檢測 ctDNA 的突變有著高敏感性，鑒定出的磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位 α（PIK3CA）基因突變與組織活檢的一致性為 100%，但步驟十分復雜，成本比較高，不利于臨床上的推廣使用。而 Tam-Seq 豐富了樣品序列，兩步擴增，重復測序，所需的時間短，降低了假陽性率，并且成本較低，兼具敏感性和實用性[4]。
2.2 ctDNA 檢測技術的新進展
近年來，ctDNA 的檢測技術有了很多的新進展。例如，集成數字錯誤抑制增強的深度測序腫瘤個體化建檔法是近兩年新開發出的一種錯誤校正方法，克服了 cfDNA 對 ctDNA 造成的測序偽像等干擾因素，降低了假陽性率，提高了檢測 ctDNA 中低頻等位基因的靈敏度和特異性[19]。靶向錯誤校正測序（targeted error correction sequencing，TEC-Seq）可以降低測序的錯誤率，靈敏度也很高[20]。CancerSEEK 不僅可以檢測出基因突變，還可以檢測出異常蛋白質的存在，有助于識別出最有可能罹患乳腺癌的患者，但 CancerSEEK 的一個缺點就是評估乳腺癌的靈敏度較低，僅有 33%[21]。
McDonald 等[22]新研發出的靶向數字測序（targeted digital sequencing，TARDIS）解決了當前大多數方法都無法解決的一個難題—對于非轉移性乳腺癌患者在治療過程中或治療完成后的 ctDNA 檢測缺乏足夠的敏感性，TARDIS 能對特異性癌癥突變進行多重分析，將當前檢測技術的 ctDNA 的檢測極限提高了 100 倍。然而，TARDIS 存在的局限性是價格高昂，而且靈敏度取決于每例患者可供分析的突變數[23]。2018 年 Hu 等[24]研究出的 Fe-Au 納米粒子耦合體系已被證實可用于 ctDNA 的檢測且具有高靈敏度。
3 ctDNA 在乳腺癌診斷中的應用
在乳腺癌的早期階段，由于有限的腫瘤負荷，血漿中的 ctDNA 的水平很低[17]，這使 ctDNA 在乳腺癌的早期診斷中的使用受到了限制，導致采用 ctDNA 進行早期乳腺癌的診斷具有挑戰性。但隨著研究的進一步深入，ctDNA 在乳腺癌早期診斷以及轉移復發的早期診斷方面還是取得了一些進展。
3.1 乳腺癌的早期診斷
一直以來 ctDNA 在早期乳腺癌中的應用受到限制，但近年來有研究證實在早期乳腺癌患者中進行 ctDNA 的分析是可行的。Rodriguez 等[9]對 29 例鉬靶表現為乳腺影像報告和數據系統（Breast Imaging Reporting and Data System，BIRADS）4C 類或者 5 類病變且隨后確診為原發性乳腺癌的患者，在腫瘤活檢之前采集血漿對 ctDNA 進行了測序，并比較了活檢組織樣本和血漿 ctDNA 間 PIK3CA和腫瘤抑制基因 P53（TP53）突變的一致性，結果在 13 例血漿 ctDNA 突變患者中，有 8 例突變與匹配的組織樣本是一致的，這提示 ctDNA 分析可應用于早期乳腺癌的診斷。
能否建立 ctDNA 濃度的閾值水平作為乳腺癌的診斷依據也是一個值得深入探討的問題。早在 2012 年 Leary 等[25]試圖通過實驗量化 ctDNA 區分癌癥患者和健康人群的能力，證實了 ctDNA 的濃度≥0.75% 時，其對乳腺癌的診斷具有高靈敏度和高特異性。鑒定 ctDNA 與癌癥相關的特定突變是否有助于區分乳腺良性疾病與惡性腫瘤還需要進行更多的研究。ctDNA 的腫瘤特異性染色體重排的檢測為早期檢測出 MRD、診斷無癥狀轉移復發提供了一種靈敏的方法，在臨床上，觀察到轉移征象前 11 個月就可以檢測到 ctDNA 中腫瘤特異性染色體的重排[26]。另外，研究[27]證實，乳腺導管癌組血清中脆性組氨酸三聯體基因（fragile histine traid，FHIT）的 ctDNA 甲基化水平高于乳腺纖維腺瘤組和健康個體組，這表明血清中 FHIT 的 ctDNA 甲基化水平與乳腺癌顯著相關，其定量檢測可能可以在乳腺導管癌的早期診斷中發揮作用。
眾所周知，cfDNA 有兩個來源：ctDNA 和除 ctDNA 以外的其他 cfDNA。ctDNA 的長度小于 200 個堿基對，除 ctDNA 以外的其他 cfDNA 的長度可達到幾千個堿基對。因此，有學者提出可以使用血漿 DNA 完整性指數（較長的 DNA 片段與較短的 DNA 片段之間的比率）作為癌癥的診斷指標，經研究證實乳腺癌患者的 DNA 完整性指數是健康人群的 2 倍[1]。
目前 Miyamura 等[28]證實，ctDNA 同樣可以從乳腺癌患者的局部淋巴結中檢出；這項研究還得出一個結論：無轉移的前哨淋巴結較無轉移的非前哨淋巴結，其 ctDNA 突變的頻率更高；前哨淋巴結突變陽性的患者中，血清 ctDNA 突變陽性的可能性更高。該結果提示，對患者進行淋巴結的 ctDNA 檢測也許會對乳腺癌的診斷有所幫助。
能否將 ctDNA 與其他的液體活檢分析物相結合，使其成為一種乳腺癌的輔助篩查手段還值得深入探究。其他液體活檢分析物包括代謝物、蛋白質等。代謝物如支鏈氨基酸，其價值已經在肺癌和胰腺癌中得到證實；蛋白質如循環中的半胱天冬酶已被證實在檢測乳腺癌方面有著卓越的價值[16]。將 ctDNA 與這些液體活檢分析物結合的研究還比較少，需要更多的證據證明液體活檢的多參數分析在臨床上的有效性和實用性。
3.2 乳腺癌轉移復發的早期診斷
乳腺癌患者血漿中的 ctDNA 水平主要受腫瘤的體積和腫瘤細胞的更新速度這兩個因素的影響，經過一系列根治性治療后濃度會進一步降低[29]。
ctDNA 在乳腺癌轉移復發的早期發現中也發揮著重要的作用。Olsson 等[26]針對原發性乳腺癌患者進行了研究，證實 ctDNA 的術前水平有助于轉移復發的早期發現，20 例患者中有 4 例患者的術前血漿樣本中可以檢測到 ctDNA 的存在，檢測到 ctDNA 的患者最終均復發；另外 ctDNA 的監測對于在初次手術后不久的某個時間點測量 MRD 中可能也是可行的。研究[17]證實，可以通過檢測 ctDNA 預測接受化療、手術、放療等治療的非轉移性乳腺癌患者的復發，對 43 例患者進行連續地突變追蹤，發現 ctDNA 的檢測可以在臨床出現腫瘤復發征象之前預測復發，中位提前時間為 7.9 個月，從而有利于指導臨床決策，早期介入二線治療。另外，Lee 等[30]經研究發現，對接受免疫治療后的乳腺癌患者出現的疾病進展是真性進展還是假性進展，通過對 ctDNA 的連續檢測可以將兩者區分開來。
對乳腺癌患者 ctDNA 的突變追蹤可以識別出高復發風險的早期乳腺癌患者。Chung 等[31]對 254 例雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌患者的 ctDNA 進行了基因組分析，以確定與復發/轉移性乳腺癌相關的基因組變異，發現 TP53、雌激素受體 1（ESR1）和 PIK3CA 是突變最多的基因，在 78% 的樣品中發現 TP53、ESR1 和 PIK3CA 中至少有一個基因組發生改變。另外，ctDNA 中檢測到的與化學抗性相關的突變包括端粒酶逆轉錄酶（TERT）、脂肪非典型鈣黏蛋白 1（FAT1）、組蛋白甲基轉移酶（SETD2）、跨膜受體蛋白 Notch4、維甲酸受體 α（RARA）和混合細胞系白血病 3 基因（MLL3）突變，這些 ctDNA 的突變可能與乳腺癌疾病進展有關[1]。有研究[32]證明，ctDNA 中檢測到的 PIK3CA 突變持續 4 周似乎與無進展生存期高度相關。而且，ctDNA 中 ESR1 突變患者的無進展生存期明顯縮短[33-34]。通過對血漿 DNA 中基因甲基化的測量還可以早期發現原發癌及其轉移到其他器官的證據[35]。
4 小結與展望
綜上所述，ctDNA 是一種有前途、有潛力的生物檢測指標。ctDNA 作為一種常規生物檢測指標，應用于臨床后將為非侵入性癌癥管理提供一種有效的方法，有利于乳腺癌的精準治療和個體化治療。然而，由于 ctDNA 作為一種檢測乳腺癌 MRD 的生物標志物，用于指導治療決策時對于檢測技術的要求很高，此外 ctDNA 的檢測方法大多比較昂貴并且步驟復雜，這限制了其在臨床實踐中的推廣使用。除此以外，很多 ctDNA 分析前變量（包括樣本的類型和數量、處理變量、存儲條件和持續時間）都會影響 ctDNA 的檢測結果。目前正在努力尋找一種更加經濟快捷的方法以簡化 ctDNA 的檢測步驟，提高 ctDNA 的提取效率，解決分析前變量對 ctDNA 的檢測結果的干擾，以實現將 ctDNA 的檢測常規應用于臨床的目標，以期在乳腺癌的早期診斷中發揮作用，在出現臨床癥狀之前及影像學出現明顯復發轉移證據之前實現對乳腺癌患者轉移復發的早期診斷，并預測疾病的復發和進展。目前的研究主要局限于利用血漿進行 ctDNA 的檢測，其他體液（如尿液或唾液）的分析也可能具有巨大潛力。在將 ctDNA 的檢測引入臨床實踐應用之前，我們還需要尋找更好的方法來克服機體炎癥狀態對 ctDNA 分析的干擾，還需要尋找適合進行液體活檢的特定時間點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：湯蕾參與選題與設計，并撰寫和修改論文；符德元指導選題與設計，并撰寫和修改論文。