引用本文： 劉文能, 楊百仞, 李東, 向立歷, 陽川華. 外周血中miRNA-196a在進展期胃癌中的表達及其臨床及生物學意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(8): 1025-1030. doi: 10.7507/1007-9424.202011033 復制
胃癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發病率高、早期診斷率低、轉移率高等特點[1-3]。發現新的用于胃癌早期診斷、揭示預后的生物標志物有望改變上述現狀[4-6]。miRNA 是一類長度為 20～25 個堿基的非編碼 RNA，通過不完全堿基互補配對方式結合到靶基因 RNA 3′ 非翻譯區以直接降解或者抑制 RNA 翻譯方式發揮基因表達調控作用。miRNA 幾乎參與了機體所有的生理、病理進程，包括腫瘤的發生發展[7-10]，在腫瘤發生發展過程中，miRNA 扮演促癌基因和抑癌基因的雙重角色[11-13]。由于 miRNA 具有在組織及各種體液中的表達極其穩定的特性，因此越來越多的研究將其作為一種候選的疾病診斷標志物[14-16]。其中 miRNA-196a 被發現在許多腫瘤中異常表達，包括結直腸癌[17-18]、乳腺癌[19]、胰腺癌[20]、肺癌[21]、胃癌[22]等。有研究[23]認為，miRNA-196a 有望作為一種潛在的早期胃癌診斷標志物。本研究旨在進一步明確胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達變化情況，以及其表達水平與胃癌臨床病理學特征特別是轉移、侵襲之間的關系；同時通過體外實驗觀察 miRNA-196a 對胃癌細胞株 MGC-803 侵襲能力的影響。
1 資料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 胃癌組納入標準
① 經病理學檢查證實為胃癌患者；② 術前未接受放療、化療；③ 接受手術治療者；④ 具有完整資料者。排除標準：① 合并其他腫瘤患者；② 術前接受過放療、化療；③ 圍手術期 1 個月內死亡者；④ 資料不全者。
1.1.2 胃良性病變組納入標準
① 經病理學檢查證實為胃良性病變患者；② 未合并其他腫瘤；③ 接受手術治療者。排除標準：① 合并其他腫瘤患者；② 圍手術期 1 個月內死亡者。
1.1.3 研究對象的資料
胃癌的診斷基于術前、術中及術后 3 個環節的檢查結果：術前有關腫瘤的常規血液學檢查包括腫瘤標志物檢查、影像學檢查（胸腹部 CT、MRI）；術中開腹探查；術后組織病理學檢查。根據上述納入及排除標準，回顧性選取 2015–2017 年期間入住四川大學華西第四醫院和宜賓市第一人民醫院的胃癌患者共 75 例，其中男 49 例，女 26 例，年齡 29～76 歲，中位年齡 63 歲。75 例胃癌患者的具體資料見表 1。同時選取同期因良性胃潰瘍穿孔行手術治療的患者 35 例作為胃良性病變組，均經術中活檢取材行病理學檢查證實，且在術后 3 個月隨訪經胃鏡活檢取材排除惡性病變。本研究均經患者及家屬知情同意并簽字授權，同時通過了四川大學華西第四醫院和宜賓市第一人民醫院倫理委員會的審核并予以批準。
表1
75 例胃癌患者的臨床資料（例）
1.2 主要試劑和設備
人胃癌 MGC-803 細胞系購于美國模式菌種收集中心（ATCC）；RPMI 1640 培養基和胎牛血清購于美國 HyClone 公司；抗生素和胰酶消化液購于碧云天公司；RNA 提取試劑盒購于 Invitrogen 公司；miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒和 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒購于德國 QIAGEN 公司；引物合成服務購于上海生工；cDNA 逆轉錄試劑盒和 37 ℃ 恒溫孵箱購于美國 Thermo Fishier 公司；倒置顯微鏡購于徠卡顯微鏡中國有限公司；7900HT 實時熒光定量 PCR 儀購于 ABI 公司。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 組織及血液標本的采集及制備
① 標本采集：本研究中所有胃癌組織和良性病變組織標本均于術中采集；術前血液標本于入院后、手術前1 d 采集，術后血液標本于術后 1 個月患者隨訪復查時采集。② 血漿制備：使用枸櫞酸鈉抗凝管收集患者血液，室溫下 2 000 g、離心 10 min，小心轉移血漿上清到新鮮無菌 EP 管中，2 000 g、再次離心 15 min 去除殘留在血漿中的血小板以避免后期檢測污染。上述所有操作在 4 h 內完成，分裝血漿樣品于 ?80 ℃ 保存。③ 組織制備：使用預先用 DEPC 水處理過的碾缽、鑷子等接觸組織樣品所需器械，使用液氮研磨法將組織研磨成固態粉劑，然后進行后續 RNA 提取操作。
1.3.2 RNA 提取、cDNA 制備
參照說明書使用 miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒提取血漿 RNA。按照 Trizol 說明書提取血漿、組織和細胞樣品的 RNA。利用 Nanodrop 測定 RNA 濃度。參照操作說明書利用 Thermo Fishier 逆轉錄試劑盒將上述來自血漿、組織和細胞的 RNA 反轉錄生成 cDNA，反應體系為 20 μL，RNA 逆轉錄量為 1 μg。隨后 cDNA模板稀釋 5 倍。
1.3.3 miRNA 檢測逆轉錄引物設計
引物設計采取頸環逆轉錄引物法（Stem-loop RT 法） [25-26]，人 miRNA-196a 逆轉錄引物序列為：GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC-GACCCCAAC，人 miR-103a-3p 逆轉錄引物序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-ATTCGCACTGGATACGACTCATAG；miRNA-196a PCR 上游引物為 5′ -GCGCTAGGTAGTTT-CATGTT-3′ ，miR-103a-3p 上游引物為 5′ -GCACAG-CAGCAUUGUACAGGG-3′ ，下游引物為通用引物，引物序列為 5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 法檢測 miRNA-196a 表達
采用 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒檢測血漿、組織和細胞樣品中人源 miRNA-196a 的表達，選用體液中表達高度穩定的人 miR-103a-3p 作為內參基因用于校準計算。使用實時 7900HT 熒光定量 PCR 儀進行檢測，PCR 反應程序如下：94 ℃ 預變性 2 min，94 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 10 s，熱循環 40 個循環數。溶解曲線：95 ℃、2 min，60 ℃、20 s，95 ℃、15 s，從 60 ℃ 緩慢加熱到 99 ℃。用 2?ΔCt 表示組織和血漿中 miRNA-196a 的相對表達量，其計算公式：ΔCt=目的基因 Ct 值–內參基因 Ct 值；用 2?ΔΔCt表示胃癌細胞株中 miRNA-196a 的過表達和敲減之后的倍數變化關系，計算公式：ΔΔCt=（處理組目的基因 Ct 值–處理組內參基因 Ct 值）–（對照組目的基因 Ct 值–對照組內參基因 Ct 值）。
1.4 體外實驗方法及檢測指標
1.4.1 腫瘤細胞系培養及細胞轉染
配置含 10% 胎牛血清和青霉素/鏈霉素的 RPMI 1640 培養基用于培養人胃癌 MGC-803 細胞，培養環境為含 5% CO2、37 ℃ 濕潤的細胞培養箱。融合度在 70% 左右且處于對數生長期的細胞用于后續實驗。
1.4.2 細胞轉染實現過表達或下調 miRNA-196a 表達
取 2.0×105 個/mL MGC-803 細胞接種到 6 孔板中，16～18 h 后待細胞融合度達到 60% 左右，參考說明書，利用 Lipofectine 3000 將化學合成的人 miRNA-196a 模擬物、人 miRNA-196a 抑制物以及人 miRNA-196a 對照導入提前進行隨機分組（miRNA-196a 過表達組、miRNA-196a 敲減組和對照組，每組樣本量為 6）的各組細胞中。24 h 后收集細胞用于 Transwell 和 RNA 提取檢測 miRNA-196a 表達情況。
1.4.3 Transwell 小室檢測 MGC-803 細胞的侵襲能力
濾膜孔徑為 8 μm 的 24 孔板用于檢測胃癌細胞株 MGC-803 的侵襲能力。將轉染 miRNA-196a 模擬物 24 h 后的細胞及對照組細胞接種到預先用200 mg/mL 基質膠處理的上腔室中，所使用培養基為正常 MGC-803 培養基，體積為 0.1 mL；下腔室中加入 0.65 mL 培養基，血清濃度設置為 30%，作為趨化因子。37 ℃ 培養箱中孵育 24 h 后，用棉簽將濾膜上腔室側殘留細胞去除，用 100% 乙醇將侵襲到濾膜下腔室側的細胞固定 10 min，用 1% 的結晶紫染色 10 min，顯微鏡 10 倍物鏡下隨機選取 5 個視野進行細胞計數，取平均數作為結果。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6 和 SPSS 20.0 軟件對數據進行分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（
±s）表示，多組間指標比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，胃癌患者手術前后血漿中 miRNA-196a 表達水平的比較采用配對 t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌患者和胃良性病變患者組織和外周血漿中 miRNA-196a 表達檢測結果
結果見圖 1。由圖 1 所示，與胃良性病變組比較，胃癌患者腫瘤組織中 miRNA-196a 的相對表達量升高（4.77±2.84 比 0.54±0.26，P<0.000 1），上調了約 7.8 倍；胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的相對表達量也呈現相同的升高趨勢（4.13±2.47比 0.43±0.24，P<0.000 1），上調了約 8.6 倍。
圖1
示 2 組患者腫瘤組織（a）和外周血漿（b）中 miRNA-196a 表達檢測結果
2.2 胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達與其臨床病理特征的相關性分析結果
結果見表 2。由表 2 可見，伴有漿膜侵犯、淋巴結轉移和遠處轉移的胃癌患者外周血漿中的 miRNA-196a 表達水平高于無漿膜侵犯、無淋巴結轉移和無遠處轉移者（P<0.001、P=0.004、P<0.001），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.001）；胃癌患者外周血漿中的 miRNA-196a 表達水平雖隨腫瘤直徑的增大呈遞增趨勢，但不同腫瘤直徑間的差異無統計學意義（P>0.05）；外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤部位及分化程度均無相關性（P>0.05）。
表2
75 例胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平與其臨床病理特征的關系
2.3 胃癌患者手術前后外周血漿中 miRNA-196a 表達情況比較
為進一步驗證胃癌患者外周血漿中上調的 miRNA-196a 是否主要是通過胃癌組織釋放所致，本研究通過系統隨機方法再將 75 例胃癌患者利用研究序列號交替隨機分組，選取其中一組 25 例進行手術前后外周血漿中 miRNA-196a 表達情況的對照研究。其結果見圖 2a，由圖 2a 可見，胃癌患者外周血漿 miRNA-196a 的相對表達量術前為 4.54±2.71，較良性病變組的 0.43±0.24 增高約 9.5 倍（P<0.000 1）；胃癌手術后為 1.20±0.86，較術前下降了約 2.8 倍（P<0.000 1），接近但仍略高于良性對照組（P>0.05）。進一步比較 25 例胃癌患者每個個體手術前后外周血漿中的 miRNA-196a 相對表達量發現，手術后外周血漿中 miRNA-196a 相對表達量整體上呈現出下調趨勢（P<0.000 1），見圖 2b。該結果提示，胃癌患者外周血漿中上調的 miRNA-196a 絕大部分系原發腫瘤病灶釋放所致。
圖2
示 25 例胃癌患者手術前后外周血漿中 miRNA-196a 的表達情況以及體外實驗中 miRNA-196a 對 MGC-803 細胞侵襲能力的影響
a：25 例胃癌患者手術前后血漿中的 miRNA-196a 表達水平；b：25 例胃癌患者每個個體手術前后血漿中 miRNA-196a 表達水平的變化情況；c：qRT-PCR 檢測 3 組 MGC-803 細胞中的 miRNA-196a 表達結果；d、e：Transwell 小室檢測 3 組 MGC-803 細胞的侵襲能力，d 圖為細胞計數結果，e 圖為染色結果（結晶紫染色 ×100）
2.4 miRNA-196a 在體外對胃癌細胞株 MGC-803 侵襲能力的影響
過表達組 miRNA-196a 相對表達量為 1 025.57±193.42，相較對照組的 1.03±0.17 上調了約 994.7 倍（P<0.01），miRNA-196a 敲減組的 miRNA-196a 相對表達量為 0.47±0.08，下降了約 1.2 倍（P<0.05），見圖 2c。細胞侵襲實驗（圖 2d、2e）結果顯示，miRNA-196a 過表達組與對照組相比增強了 MGC-803 細胞的侵襲能力 ［ （354±43）個比（225±35）個，P<0.05］， miRNA-196a 敲減組的 MGC-803 細胞侵襲能力 ［ （125±26）個］ 則受到抑制（P<0.05）。
3 討論
胃癌是我國乃至世界范圍內最為常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管各種治療方法不斷取得新的進展，但是其發病率高、早期診斷率低以及轉移率高的特點導致目前的治療以及預后仍然不盡如人意。CEA、CA19-9 等血清學指標在術前檢測陽性率偏低，影響其在術前的預測價值，主要用于術后復發的評估。所以，尋找有效的術前預測指標對胃癌患者個體化治療非常重要。發現新的用于早期診斷、揭示預后的生物標志物有望改變上述現狀。
研究[27]發現，miRNA 參與了調控機體正常生命活動包括發育、生長、增殖、分化等，不僅如此還參與了各種疾病（包括腫瘤）的發生發展過程。本研究比較了胃癌和胃良性疾病患者組織及外周血中的 miRNA-196a 表達情況，結果顯示胃癌患者外周血漿（P<0.000 1）和癌組織（P<0.000 1）中 miRNA-196a 的表達均上調。Chen 等[23]研究顯示，與健康志愿者相比，胃腸上皮化生、低度不典型增生和高度不典型增生患者血漿中 miRNA-196a 的表達均上調，當進展到早期胃癌階段， miRNA-196a 的表達則進一步上調，提示 miRNA-196a 可作為胃癌癌前病變和早期胃癌的預測性生物標志物。本研究則在此基礎之上進一步證實了與胃良性病變組比較，胃癌患者癌組織和外周血漿中的 miRNA-196a 呈現顯著且高度類似的上調趨勢，上調幅度在 7 倍以上。提示 miRNA-196a 隨著胃組織病變程度變化其表達呈現逐步遞增的趨勢。
早期胃癌因不易被發現，隨時間推移病情逐步發展到中晚期，此時腫瘤體積逐漸增大，進而發生局部侵襲和漿膜受侵、淋巴結轉移以及通過血液方式的遠處轉移。本研究分析了 75 例胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達與其臨床病理特征的關系，發現伴有漿膜受侵（P<0.001）、淋巴結轉移（P=0.004）和遠處轉移（P<0.001）的胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平均上調，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達較Ⅰ～Ⅱ期患者上調（P<0.001）。該結果提示 miRNA-196a 與胃癌原發腫瘤生長、局部侵襲和遠處轉移相關。miRNA-196a 有望成為一種新的重要的胃癌轉移和進展的預后生物標志物。
本研究對胃癌患者手術前后外周血漿中的 miRNA-196a 表達情況進行分析，發現手術切除胃癌組織后血漿中 miRNA-196a 的表達顯著下調，提示血漿中上升的 miRNA-196a 主要系腫瘤組織釋放所致。該結果提示血漿 miRNA-196a 可作為臨床胃癌診斷和預后的標志物，可以很好地反映胃癌組織中 miRNA-196a 的水平。
為進一步明確 miRNA-196a 與胃癌轉移是否有直接關系，本研究通過體外實驗觀察了 miRNA-196a 對胃癌 MGC-803 細胞侵襲能力的影響，結果發現：miRNA-196a 過表達可增強胃癌 MGC-803 細胞的侵襲能力，而 miRNA-196a 敲減后則減弱了胃癌 MGC-803 細胞的侵襲能力。Tsai 等[22]在胃癌細胞系 TSGH 中通過慢病毒方式過表達和敲減 miRNA-196a 后發現，過表達 miRNA-196a 顯著增加了 TSGH 細胞的遷移和侵襲能力。本研究用不同的胃癌細胞系 MGC-803 得到相同的結果，提示 miRNA-196a 在胃癌細胞中的促進轉移侵襲功能具有普遍性。體外實驗結果進一步提示胃癌患者高表達 miRNA-196a 與腫瘤的轉移侵襲不僅有相關性，可能還存在一定的因果效應。
綜上，本研究結果顯示胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 表達水平與胃癌進展呈現正相關效應，并且在有局部侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移者中的表達顯著上調，胃癌患者外周血漿中升高的 miRNA-196a 主要源自原發腫瘤的釋放。體外 miRNA-196a 能夠顯著促進胃癌細胞的侵襲。本研究尚存在如下不足：雖然提示 miRNA-196a 有望成為進展性胃癌的預后標志物以及潛在的治療靶點，但是尚需進行受試者工作特征曲線（ROC 曲線）來分析其靈敏度和特異度，尚需擴大病例數來分析 miRNA-196a 表達水平同生存率的關系。盡管體外實驗證明了 miRNA-196a 可以促進胃癌細胞的侵襲，但具體機制還需闡明。未來將圍繞上述不足進行更深入的研究和探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉文能和陽川華負責研究設計及實施、數據采集和分析、撰寫并審校論文及獲取經費支持；楊百仞負責研究實施、數據采集和分析、起草論文；李東和向立歷負責研究實施、數據采集、統計分析和起草論文。
倫理聲明：本研究已通過四川大學華西第四醫院（批文編號：Gwll2019041） 和宜賓市第一人民醫院倫理委員會的審批。
胃癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發病率高、早期診斷率低、轉移率高等特點[1-3]。發現新的用于胃癌早期診斷、揭示預后的生物標志物有望改變上述現狀[4-6]。miRNA 是一類長度為 20～25 個堿基的非編碼 RNA，通過不完全堿基互補配對方式結合到靶基因 RNA 3′ 非翻譯區以直接降解或者抑制 RNA 翻譯方式發揮基因表達調控作用。miRNA 幾乎參與了機體所有的生理、病理進程，包括腫瘤的發生發展[7-10]，在腫瘤發生發展過程中，miRNA 扮演促癌基因和抑癌基因的雙重角色[11-13]。由于 miRNA 具有在組織及各種體液中的表達極其穩定的特性，因此越來越多的研究將其作為一種候選的疾病診斷標志物[14-16]。其中 miRNA-196a 被發現在許多腫瘤中異常表達，包括結直腸癌[17-18]、乳腺癌[19]、胰腺癌[20]、肺癌[21]、胃癌[22]等。有研究[23]認為，miRNA-196a 有望作為一種潛在的早期胃癌診斷標志物。本研究旨在進一步明確胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達變化情況，以及其表達水平與胃癌臨床病理學特征特別是轉移、侵襲之間的關系；同時通過體外實驗觀察 miRNA-196a 對胃癌細胞株 MGC-803 侵襲能力的影響。
1 資料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 胃癌組納入標準
① 經病理學檢查證實為胃癌患者；② 術前未接受放療、化療；③ 接受手術治療者；④ 具有完整資料者。排除標準：① 合并其他腫瘤患者；② 術前接受過放療、化療；③ 圍手術期 1 個月內死亡者；④ 資料不全者。
1.1.2 胃良性病變組納入標準
① 經病理學檢查證實為胃良性病變患者；② 未合并其他腫瘤；③ 接受手術治療者。排除標準：① 合并其他腫瘤患者；② 圍手術期 1 個月內死亡者。
1.1.3 研究對象的資料
胃癌的診斷基于術前、術中及術后 3 個環節的檢查結果：術前有關腫瘤的常規血液學檢查包括腫瘤標志物檢查、影像學檢查（胸腹部 CT、MRI）；術中開腹探查；術后組織病理學檢查。根據上述納入及排除標準，回顧性選取 2015–2017 年期間入住四川大學華西第四醫院和宜賓市第一人民醫院的胃癌患者共 75 例，其中男 49 例，女 26 例，年齡 29～76 歲，中位年齡 63 歲。75 例胃癌患者的具體資料見表 1。同時選取同期因良性胃潰瘍穿孔行手術治療的患者 35 例作為胃良性病變組，均經術中活檢取材行病理學檢查證實，且在術后 3 個月隨訪經胃鏡活檢取材排除惡性病變。本研究均經患者及家屬知情同意并簽字授權，同時通過了四川大學華西第四醫院和宜賓市第一人民醫院倫理委員會的審核并予以批準。
表1
75 例胃癌患者的臨床資料（例）
1.2 主要試劑和設備
人胃癌 MGC-803 細胞系購于美國模式菌種收集中心（ATCC）；RPMI 1640 培養基和胎牛血清購于美國 HyClone 公司；抗生素和胰酶消化液購于碧云天公司；RNA 提取試劑盒購于 Invitrogen 公司；miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒和 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒購于德國 QIAGEN 公司；引物合成服務購于上海生工；cDNA 逆轉錄試劑盒和 37 ℃ 恒溫孵箱購于美國 Thermo Fishier 公司；倒置顯微鏡購于徠卡顯微鏡中國有限公司；7900HT 實時熒光定量 PCR 儀購于 ABI 公司。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 組織及血液標本的采集及制備
① 標本采集：本研究中所有胃癌組織和良性病變組織標本均于術中采集；術前血液標本于入院后、手術前1 d 采集，術后血液標本于術后 1 個月患者隨訪復查時采集。② 血漿制備：使用枸櫞酸鈉抗凝管收集患者血液，室溫下 2 000 g、離心 10 min，小心轉移血漿上清到新鮮無菌 EP 管中，2 000 g、再次離心 15 min 去除殘留在血漿中的血小板以避免后期檢測污染。上述所有操作在 4 h 內完成，分裝血漿樣品于 ?80 ℃ 保存。③ 組織制備：使用預先用 DEPC 水處理過的碾缽、鑷子等接觸組織樣品所需器械，使用液氮研磨法將組織研磨成固態粉劑，然后進行后續 RNA 提取操作。
1.3.2 RNA 提取、cDNA 制備
參照說明書使用 miRNeasy Serum/Plasma 試劑盒提取血漿 RNA。按照 Trizol 說明書提取血漿、組織和細胞樣品的 RNA。利用 Nanodrop 測定 RNA 濃度。參照操作說明書利用 Thermo Fishier 逆轉錄試劑盒將上述來自血漿、組織和細胞的 RNA 反轉錄生成 cDNA，反應體系為 20 μL，RNA 逆轉錄量為 1 μg。隨后 cDNA模板稀釋 5 倍。
1.3.3 miRNA 檢測逆轉錄引物設計
引物設計采取頸環逆轉錄引物法（Stem-loop RT 法） [25-26]，人 miRNA-196a 逆轉錄引物序列為：GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC-GACCCCAAC，人 miR-103a-3p 逆轉錄引物序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-ATTCGCACTGGATACGACTCATAG；miRNA-196a PCR 上游引物為 5′ -GCGCTAGGTAGTTT-CATGTT-3′ ，miR-103a-3p 上游引物為 5′ -GCACAG-CAGCAUUGUACAGGG-3′ ，下游引物為通用引物，引物序列為 5′ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 法檢測 miRNA-196a 表達
采用 QuantiTect SYBR? Green PCR 試劑盒檢測血漿、組織和細胞樣品中人源 miRNA-196a 的表達，選用體液中表達高度穩定的人 miR-103a-3p 作為內參基因用于校準計算。使用實時 7900HT 熒光定量 PCR 儀進行檢測，PCR 反應程序如下：94 ℃ 預變性 2 min，94 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火/延伸 10 s，熱循環 40 個循環數。溶解曲線：95 ℃、2 min，60 ℃、20 s，95 ℃、15 s，從 60 ℃ 緩慢加熱到 99 ℃。用 2?ΔCt 表示組織和血漿中 miRNA-196a 的相對表達量，其計算公式：ΔCt=目的基因 Ct 值–內參基因 Ct 值；用 2?ΔΔCt表示胃癌細胞株中 miRNA-196a 的過表達和敲減之后的倍數變化關系，計算公式：ΔΔCt=（處理組目的基因 Ct 值–處理組內參基因 Ct 值）–（對照組目的基因 Ct 值–對照組內參基因 Ct 值）。
1.4 體外實驗方法及檢測指標
1.4.1 腫瘤細胞系培養及細胞轉染
配置含 10% 胎牛血清和青霉素/鏈霉素的 RPMI 1640 培養基用于培養人胃癌 MGC-803 細胞，培養環境為含 5% CO2、37 ℃ 濕潤的細胞培養箱。融合度在 70% 左右且處于對數生長期的細胞用于后續實驗。
1.4.2 細胞轉染實現過表達或下調 miRNA-196a 表達
取 2.0×105 個/mL MGC-803 細胞接種到 6 孔板中，16～18 h 后待細胞融合度達到 60% 左右，參考說明書，利用 Lipofectine 3000 將化學合成的人 miRNA-196a 模擬物、人 miRNA-196a 抑制物以及人 miRNA-196a 對照導入提前進行隨機分組（miRNA-196a 過表達組、miRNA-196a 敲減組和對照組，每組樣本量為 6）的各組細胞中。24 h 后收集細胞用于 Transwell 和 RNA 提取檢測 miRNA-196a 表達情況。
1.4.3 Transwell 小室檢測 MGC-803 細胞的侵襲能力
濾膜孔徑為 8 μm 的 24 孔板用于檢測胃癌細胞株 MGC-803 的侵襲能力。將轉染 miRNA-196a 模擬物 24 h 后的細胞及對照組細胞接種到預先用200 mg/mL 基質膠處理的上腔室中，所使用培養基為正常 MGC-803 培養基，體積為 0.1 mL；下腔室中加入 0.65 mL 培養基，血清濃度設置為 30%，作為趨化因子。37 ℃ 培養箱中孵育 24 h 后，用棉簽將濾膜上腔室側殘留細胞去除，用 100% 乙醇將侵襲到濾膜下腔室側的細胞固定 10 min，用 1% 的結晶紫染色 10 min，顯微鏡 10 倍物鏡下隨機選取 5 個視野進行細胞計數，取平均數作為結果。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6 和 SPSS 20.0 軟件對數據進行分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（±s）表示，多組間指標比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，胃癌患者手術前后血漿中 miRNA-196a 表達水平的比較采用配對 t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌患者和胃良性病變患者組織和外周血漿中 miRNA-196a 表達檢測結果
結果見圖 1。由圖 1 所示，與胃良性病變組比較，胃癌患者腫瘤組織中 miRNA-196a 的相對表達量升高（4.77±2.84 比 0.54±0.26，P<0.000 1），上調了約 7.8 倍；胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的相對表達量也呈現相同的升高趨勢（4.13±2.47比 0.43±0.24，P<0.000 1），上調了約 8.6 倍。
圖1
示 2 組患者腫瘤組織（a）和外周血漿（b）中 miRNA-196a 表達檢測結果
2.2 胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達與其臨床病理特征的相關性分析結果
結果見表 2。由表 2 可見，伴有漿膜侵犯、淋巴結轉移和遠處轉移的胃癌患者外周血漿中的 miRNA-196a 表達水平高于無漿膜侵犯、無淋巴結轉移和無遠處轉移者（P<0.001、P=0.004、P<0.001），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.001）；胃癌患者外周血漿中的 miRNA-196a 表達水平雖隨腫瘤直徑的增大呈遞增趨勢，但不同腫瘤直徑間的差異無統計學意義（P>0.05）；外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤部位及分化程度均無相關性（P>0.05）。
表2
75 例胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平與其臨床病理特征的關系
2.3 胃癌患者手術前后外周血漿中 miRNA-196a 表達情況比較
為進一步驗證胃癌患者外周血漿中上調的 miRNA-196a 是否主要是通過胃癌組織釋放所致，本研究通過系統隨機方法再將 75 例胃癌患者利用研究序列號交替隨機分組，選取其中一組 25 例進行手術前后外周血漿中 miRNA-196a 表達情況的對照研究。其結果見圖 2a，由圖 2a 可見，胃癌患者外周血漿 miRNA-196a 的相對表達量術前為 4.54±2.71，較良性病變組的 0.43±0.24 增高約 9.5 倍（P<0.000 1）；胃癌手術后為 1.20±0.86，較術前下降了約 2.8 倍（P<0.000 1），接近但仍略高于良性對照組（P>0.05）。進一步比較 25 例胃癌患者每個個體手術前后外周血漿中的 miRNA-196a 相對表達量發現，手術后外周血漿中 miRNA-196a 相對表達量整體上呈現出下調趨勢（P<0.000 1），見圖 2b。該結果提示，胃癌患者外周血漿中上調的 miRNA-196a 絕大部分系原發腫瘤病灶釋放所致。
圖2
示 25 例胃癌患者手術前后外周血漿中 miRNA-196a 的表達情況以及體外實驗中 miRNA-196a 對 MGC-803 細胞侵襲能力的影響
a：25 例胃癌患者手術前后血漿中的 miRNA-196a 表達水平；b：25 例胃癌患者每個個體手術前后血漿中 miRNA-196a 表達水平的變化情況；c：qRT-PCR 檢測 3 組 MGC-803 細胞中的 miRNA-196a 表達結果；d、e：Transwell 小室檢測 3 組 MGC-803 細胞的侵襲能力，d 圖為細胞計數結果，e 圖為染色結果（結晶紫染色 ×100）
2.4 miRNA-196a 在體外對胃癌細胞株 MGC-803 侵襲能力的影響
過表達組 miRNA-196a 相對表達量為 1 025.57±193.42，相較對照組的 1.03±0.17 上調了約 994.7 倍（P<0.01），miRNA-196a 敲減組的 miRNA-196a 相對表達量為 0.47±0.08，下降了約 1.2 倍（P<0.05），見圖 2c。細胞侵襲實驗（圖 2d、2e）結果顯示，miRNA-196a 過表達組與對照組相比增強了 MGC-803 細胞的侵襲能力 ［ （354±43）個比（225±35）個，P<0.05］， miRNA-196a 敲減組的 MGC-803 細胞侵襲能力 ［ （125±26）個］ 則受到抑制（P<0.05）。
3 討論
胃癌是我國乃至世界范圍內最為常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管各種治療方法不斷取得新的進展，但是其發病率高、早期診斷率低以及轉移率高的特點導致目前的治療以及預后仍然不盡如人意。CEA、CA19-9 等血清學指標在術前檢測陽性率偏低，影響其在術前的預測價值，主要用于術后復發的評估。所以，尋找有效的術前預測指標對胃癌患者個體化治療非常重要。發現新的用于早期診斷、揭示預后的生物標志物有望改變上述現狀。
研究[27]發現，miRNA 參與了調控機體正常生命活動包括發育、生長、增殖、分化等，不僅如此還參與了各種疾病（包括腫瘤）的發生發展過程。本研究比較了胃癌和胃良性疾病患者組織及外周血中的 miRNA-196a 表達情況，結果顯示胃癌患者外周血漿（P<0.000 1）和癌組織（P<0.000 1）中 miRNA-196a 的表達均上調。Chen 等[23]研究顯示，與健康志愿者相比，胃腸上皮化生、低度不典型增生和高度不典型增生患者血漿中 miRNA-196a 的表達均上調，當進展到早期胃癌階段， miRNA-196a 的表達則進一步上調，提示 miRNA-196a 可作為胃癌癌前病變和早期胃癌的預測性生物標志物。本研究則在此基礎之上進一步證實了與胃良性病變組比較，胃癌患者癌組織和外周血漿中的 miRNA-196a 呈現顯著且高度類似的上調趨勢，上調幅度在 7 倍以上。提示 miRNA-196a 隨著胃組織病變程度變化其表達呈現逐步遞增的趨勢。
早期胃癌因不易被發現，隨時間推移病情逐步發展到中晚期，此時腫瘤體積逐漸增大，進而發生局部侵襲和漿膜受侵、淋巴結轉移以及通過血液方式的遠處轉移。本研究分析了 75 例胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達與其臨床病理特征的關系，發現伴有漿膜受侵（P<0.001）、淋巴結轉移（P=0.004）和遠處轉移（P<0.001）的胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達水平均上調，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者外周血漿中 miRNA-196a 的表達較Ⅰ～Ⅱ期患者上調（P<0.001）。該結果提示 miRNA-196a 與胃癌原發腫瘤生長、局部侵襲和遠處轉移相關。miRNA-196a 有望成為一種新的重要的胃癌轉移和進展的預后生物標志物。
本研究對胃癌患者手術前后外周血漿中的 miRNA-196a 表達情況進行分析，發現手術切除胃癌組織后血漿中 miRNA-196a 的表達顯著下調，提示血漿中上升的 miRNA-196a 主要系腫瘤組織釋放所致。該結果提示血漿 miRNA-196a 可作為臨床胃癌診斷和預后的標志物，可以很好地反映胃癌組織中 miRNA-196a 的水平。
為進一步明確 miRNA-196a 與胃癌轉移是否有直接關系，本研究通過體外實驗觀察了 miRNA-196a 對胃癌 MGC-803 細胞侵襲能力的影響，結果發現：miRNA-196a 過表達可增強胃癌 MGC-803 細胞的侵襲能力，而 miRNA-196a 敲減后則減弱了胃癌 MGC-803 細胞的侵襲能力。Tsai 等[22]在胃癌細胞系 TSGH 中通過慢病毒方式過表達和敲減 miRNA-196a 后發現，過表達 miRNA-196a 顯著增加了 TSGH 細胞的遷移和侵襲能力。本研究用不同的胃癌細胞系 MGC-803 得到相同的結果，提示 miRNA-196a 在胃癌細胞中的促進轉移侵襲功能具有普遍性。體外實驗結果進一步提示胃癌患者高表達 miRNA-196a 與腫瘤的轉移侵襲不僅有相關性，可能還存在一定的因果效應。
綜上，本研究結果顯示胃癌患者外周血漿中 miRNA-196a 表達水平與胃癌進展呈現正相關效應，并且在有局部侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移者中的表達顯著上調，胃癌患者外周血漿中升高的 miRNA-196a 主要源自原發腫瘤的釋放。體外 miRNA-196a 能夠顯著促進胃癌細胞的侵襲。本研究尚存在如下不足：雖然提示 miRNA-196a 有望成為進展性胃癌的預后標志物以及潛在的治療靶點，但是尚需進行受試者工作特征曲線（ROC 曲線）來分析其靈敏度和特異度，尚需擴大病例數來分析 miRNA-196a 表達水平同生存率的關系。盡管體外實驗證明了 miRNA-196a 可以促進胃癌細胞的侵襲，但具體機制還需闡明。未來將圍繞上述不足進行更深入的研究和探討。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉文能和陽川華負責研究設計及實施、數據采集和分析、撰寫并審校論文及獲取經費支持；楊百仞負責研究實施、數據采集和分析、起草論文；李東和向立歷負責研究實施、數據采集、統計分析和起草論文。
倫理聲明：本研究已通過四川大學華西第四醫院（批文編號：Gwll2019041） 和宜賓市第一人民醫院倫理委員會的審批。
