引用本文： 馬振南, 許廣大, 劉福全, 張曉微, 趙雪峰. 結直腸癌組織中 DTX2 分子的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(7): 861-866. doi: 10.7507/1007-9424.202010080 復制
Bray 等[1]報道全球結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率居所有腫瘤的第 3 位，病死率居第 2 位，死亡人數約占全部惡性腫瘤死亡總數的 8%～9%[2]，且其病死率呈逐年上升、年輕化的趨勢，目前其已成為導致惡性腫瘤死亡的主要原因之一[3-4]。在我國，CRC 發病率和病死率分別位于所有惡性腫瘤的第 3 位和第 5 位[5]，且整體預后較差，主要因為患者就診時多為進展期甚至遠處轉移的晚期患者，已錯過最佳治療期。近年來，隨著腸癌疾病相關的基因、表觀遺傳學改變及發病機制的進一步揭示，使得早診、早篩的手段更精準、有效，CRC 患者的整體診療、預后也得到明顯改善。已有研究[6-7]證實，部分腫瘤相關分子的表達水平與 CRC 患者的臨床病理特征及生存預后存在相關性，可作為 CRC 患者預后評價及治療反應效率的分子生物學標志物。目前泛素-蛋白酶體降解系統在腫瘤生物學功能中的重要作用逐漸被人們所認識，該系統底物特異性由 E3 連接酶決定，而 DTX2（deltex 2）為其中關鍵酶之一，目前關于 DTX2 在腫瘤進展中的生物學作用研究甚少。有研究[8]提示，DTX2 在頭頸部腫瘤的進展及預后中扮演著重要作用，但 DTX2 在 CRC 組織中的研究尚不清楚。因此，本研究探討了 DTX2 分子在 CRC 組織中的表達情況及其與患者臨床病理特征及預后的相關性，有望為 CRC 的治療提供潛在靶點。
1 資料與方法
1.1 數據收集
1.1.1 數據庫資料
① Oncomine 數據庫中收錄了近 20 種腫瘤芯片的 DNA 和 RNA 測序數據。在 Oncomine 數據庫中檢索 DTX2 基因與 CRC 相關研究的數據集，篩選條件為：腫瘤類型（CRC）、分析類型（CRC 組織與正常結直腸組織，其中“正常結直腸組織”簡稱“正常組織”）、基因（DTX2）、數據類型（mRNA）、有統計學意義（P<0.01）及基因差異表達上調倍數前 10%。本研究分析 Oncomine 數據庫中 DTX2 mRNA 在 CRC 組織和正常組織中的表達。② GEPIA 數據庫是由北京大學研發，收錄了 9 736 個腫瘤樣本和 8 587 個正常組織樣本的 RNA 測序數據，可在線分析不同腫瘤的基因表達水平、臨床病理特征、預后生存等。本研究應用 GEPIA 平臺分析 CRC 組織和正常組織中的 DTX2 mRNA 表達水平。③ 人類蛋白圖譜（human protein atlas，HPA）用來分析蛋白質在組織和器官中的分布及在亞細胞中定位[9]，并用特制的抗體檢測每一種蛋白質在 48 種人類正常組織、20 種腫瘤組織、47 個細胞系和 12 種血液細胞內的分布和表達，免疫組織化學染色結果具有典型的代表性，因此，本研究運用 HPA 分析 DTX2 蛋白表達與 CRC 患者生存預后的關系。
1.1.2 臨床資料
回顧性收集 2018 年 1 月至 2018 年 12 月期間于大連大學附屬新華醫院（簡稱“我院”）普通外科行 CRC 手術的 55 例 CRC 組織以及相應的癌旁正常（PN）組織。納入標準：① CRC 根治手術；② 術后病理明確診斷；③ 臨床病理資料完整；④ 所有患者均簽署知情同意書且研究方案經大連大學附屬新華醫院倫理委員會審核通過。排除標準：① 新輔助放化療患者；② 伴嚴重心肺疾病患者；③ 伴有其他惡性腫瘤患者；④ 不同意簽署知情同意書患者。55 例 CRC 患者中男 30 例，女 25 例；年齡 40～79 歲，中位年齡 65 歲，其中≤65 歲 25 例；直腸癌 30 例，結腸癌 25 例；腫瘤直徑 1.5～6.5 cm，中位數為 4.4 cm，其中≤4.4 cm 23 例；腫瘤浸潤深度：T1+T2 期 14 例，T3+T4 期 41 例；淋巴結轉移：N0 期 29 例，N1+N2 期 26 例；遠處轉移：M0 期 48 例，M1 期 7 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 13 例，Ⅲ+Ⅳ 期 42 例。
1.2 檢測方法
1.2.1 主要試劑
TRizol 裂解液購于美國 Sigma 公司，二步法反轉錄試劑盒購自日本 Takara 公司，PCR 引物由上海生物工程技術公司合成，DTX2 抗體（ab170907）購自美國 Abcam 公司，磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體和二抗（羊抗兔）購自武漢三鷹 Proteintech 公司，免疫組織化學染色相關試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。
1.2.2 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法
用 TRizol 提取組織中總 RNA。按 Takara 反轉錄試劑盒兩步法合成 cDNA，然后進行 PCR 擴增，反應體系按說明書指定。DTX2 上游引物：5′ -ACTGCAACGGCAATAAGGA-3′ ，下游引物：5′ -GGGAGCGACATCTGGAAC-3′ ，擴增產物長度為 121 bp；內參 GAPDH 上游引物：5′ -ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′ ，下游引物：5′ -CTGTTGAAGTCAGAGGAGACCAC-3′ ，擴增產物長度為 156 bp。每組設 3 個復孔。mRNA 表達量比較采用 2–ΔΔCt 計算，其中 ΔCt=ΔCt目的–ΔCt內參，ΔΔCt =ΔCt CRC 組織–ΔCt正常組織。
1.2.3 免疫組織化學染色法
石蠟標本切片厚度為 3.5 μm，經脫蠟、抗原熱修復（pH=9.0）、3% 過氧化氫孵育、血清封閉、孵育一抗（DTX2 濃度 1∶200，4 ℃ 過夜）、復溫（30 min）、生物素標記的二抗孵育（30 min）、顯色（DAB 時間 30 s）、蘇木精復染、封片等步驟，在顯微鏡下觀察染色效果。腫瘤細胞染色陽性百分率的評估標準：≤5% 為 0 分，6%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，≥51% 為 3 分；腫瘤細胞染色強度的評估標準：未染色 0 分，淺黃色 1 分，棕黃色 2 分，棕褐色 3 分。按免疫反應積分法（腫瘤細胞染色陽性百分率分值×腫瘤細胞染色強度分值）判斷，≥4 分判定為 DTX2 蛋白表達呈陽性，<4 分判定為 DTX2 蛋白表達呈陰性[10]。
1.2.4 Western blot 檢測法
用 RIPA 裂解液加蛋白酶抑制劑提取組織總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸 10 min 使蛋白變性，配制 SDS-PAGE 膠，按 30 μg/孔蛋白樣品加樣，每個泳道保持等體積用緩沖液配平，電泳分離蛋白后電轉至 PVDF 膜上，5% 的脫脂牛奶室溫封閉 2 h。加入稀釋的 DTX2（1∶4 000）、GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入按1∶8 000稀釋的羊抗兔二抗，室溫孵育 2 h。TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，ECL 化學發光顯影，曝光并拍照。以 GAPDH 為內參，重復 3 次。使用 Image J 軟件分析各條帶灰度值。DTX2 蛋白表達水平=（DTX2 條帶吸光度值×面積）/（GAPDH 條帶吸光度值×面積）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行分析。對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（
±s）表示并用 t 檢驗，不符合正態分布的計量數據采用中位數（M）和上下四分位數（P25，P75）表示并采用 Mann-Whiteney U 檢驗；計數資料比較采用 Pearson χ2 檢驗。生存預后分析采用 Kaplan-Meier 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 DTX2 mRNA 表達在線數據分析結果
① Oncomine 數據庫中的研究[11-13]（表 1）發現，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織中較正常組織升高（P<0.05），見圖 1a。② 應用 GEPIA 數據庫分析結果顯示，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織（n=275）中明顯高于在正常組織（n=349）中（P<0.01），見圖 1b。③HPA 在線數據分析結果顯示，DTX2 低表達（n=249）CRC 患者的總生存情況好于 DTX2 高表達者（n=211），差異有統計學意義（P=0.009 8），見圖 1c。
圖1
示 DTX2 在在線數據庫和臨床病例組織中的表達情況
a：Oncomine 數據庫分析結果，見 DTX2 mRNA 在 6 項芯片的 CRC 組織中表達均高于正常組織（
表1
Oncomine 數據庫中 DTX2 mRNA 在 CRC 與正常組織中表達水平的 6 項芯片的測序數據
2.2 DTX2 mRNA 和蛋白在臨床病例 CRC 組織中的表達情況
qRT-PCR 法檢測結果表明，CRC 組織中 DTX2 mRNA 的表達水平高于 PN 組織（t=0.722，P<0.001），見圖 1d。Western blot 檢測 DTX2 蛋白表達結果見圖 1e、1f，DTX2 蛋白表達在 CRC 組織中高于 PN 組織（t=1.314，P<0.001）。免疫組織化學染色結果（圖 1g、1h）顯示，DTX2 蛋白陽性表達呈棕黃色或棕褐色且主要位于細胞核。CRC 組織中 DTX2 蛋白表達陽性 46 例，陰性 9 例；PN 組織中 DTX2 蛋白表達陽性 13 例，陰性 42 例，DTX2 蛋白表達陽性率在 CRC 組織中高于 PN 組織（69.7%比19.7%，χ2=0.899，P<0.001）。
2.3 DTX2 在 CRC 組織中的表達與 CRC 患者臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2 可見，DTX2 蛋白陽性表達、DTX2 mRNA 和蛋白表達量均與 CRC 患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及 TNM 分期有關，即腫瘤浸潤深度越深、淋巴結分期及 TNM 分期越晚者，DTX2 蛋白表達陽性率越高、DTX2 mRNA 和蛋白表達量越高（P<0.05），而其與患者的性別、性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、腫瘤直徑及遠處轉移均無關（P>0.05）。
表2
DTX2 在 CRC 組織中的表達與 CRC 患者臨床病理特征的關系
3 討論
近年來，CRC 的診療技術雖然已取得了較大的進步和突破，但由于其發生和發展是一個多步驟演進且具有復雜遺傳學和表觀遺傳學變化的異質性疾病[6]，其病死率仍居高不下。然而近 20 年來，發達國家 CRC 的發病率和病死率呈明顯下降趨勢，得益于早期篩查的普及和避免高危因素的暴露[14]。我國也應將工作重心轉移到防治戰略體系上，提倡以“關口前移，預防為主”為中心，這對于改善我國 CRC 的治療現狀具有重大意義[2, 15]。近年來，亦有越來越多的研究者對 CRC 早期篩查、預測腫瘤標志物及多組學數據挖掘方面展開了系列的深入研究。
DTX2 即 deltex-2，又稱為 E3 泛素蛋白連接酶，由 DTX2 基因編碼，最初在果蠅身上發現。人類 DTX 家族包括 DTX1、DTX2、DTX3 和 DTX4，結構上都包含 N 末端、富含脯氨酸的區域和鋅指結構域[16-18]。DTX2 屬于泛素-蛋白酶體系統且為最關鍵的酶之一，在調節細胞內多個信號通路中起著關鍵性作用[17]，其參與蛋白質翻譯后的泛素化修飾。DTX2 可識別被降解的蛋白連接到底物上，參與細胞內蛋白質降解的重要途徑，其在腫瘤的進展中起著比較關鍵的作用[19]。DTX2 參與 Notch 信號通路中的 CSL 非依賴途徑，即 Notch 受體的 ANK 區與 Deltex 的鋅指蛋白結合，從而實現 Notch 信號通路的調控。有研究[20-22]報道，在乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織及細胞株中均存在 Notch 受體及配體的異常表達，從而引起不同的生物學作用。另外，已有研究[8, 19]發現，DTX2 在白血病、頭頸部癌等腫瘤組織中高表達，而在其 PN 組織中低表達，提示 DTX2 在腫瘤的進展及預后中可能起著重要作用。但是 DTX2 在 CRC 組織中的作用尚不清楚，因此，本研究擬通過腫瘤數據庫分析 DTX2 在 CRC 中的表達情況，然后進一步通過臨床數據從基因和蛋白水平進行驗證，以評估 DTX2 在 CRC 的早診及預后預測中的價值。
Oncomine 和 TCGA 是全球最權威的癌基因芯片數據庫，其收錄的數據具有較高的質量和可信度，對腫瘤的研究及治療靶標的挖掘有非常重要的價值。本研究利用在線數據庫二次分析結果顯示，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織中高于正常組織（P<0.05）；HPA 蛋白平臺分析結果顯示，DTX2 蛋白表達水平與 CRC 患者的生存預后相關，與 DTX2 蛋白低表達組比，高表達組 CRC 患者的總生存情況更差（P=0.009 8），提示 DTX2 高表達可能是 CRC 患者預后不良的因素之一。本研究的臨床數據結果顯示，CRC 組織中 DTX2 mRNA 及其蛋白表達均高于其 PN 組織，DTX2 蛋白表達陽性率與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及 TNM 分期密切相關，但與腫瘤遠處轉移無關，提示 DTX2 可能參與 CRC 的進展并起到促癌作用，但其是否參與 CRC 的遠處轉移行為還需要進一步研究。
從以上研究結果提示，DTX2 蛋白表達可能作為評估 CRC 進展的新型生物學指標，但需要進一步探索 DTX2 的生物學功能及其作用機制，為 CRC 的早篩、診斷、預后評估及發病機制的探究提供新的線索和思路。但由于本研究有一定的不足之處，如未發現 DTX2 蛋白表達陽性率與 CRC 患者的遠處轉移有關；無 DTX2 蛋白陽性表達與 CRC 患者預后評價的臨床數據；因病例數少，不能細化臨床分期進行分析，如 DTX2 蛋白表達陽性率是否隨臨床（Ⅰ~Ⅳ）分期增長呈逐漸升高趨勢等這些問題導致結果可能存在統計偏倚，因此需要進一步擴大樣本例數，使研究結論更嚴謹、經得住驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馬振南負責基礎實驗和論文撰寫；許廣大負責臨床標本收集；劉福全和張曉微負責患者臨床資料收集；趙雪峰負責數據統計分析。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬新華醫院倫理委員會審批（批文編號：20210120）。
Bray 等[1]報道全球結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率居所有腫瘤的第 3 位，病死率居第 2 位，死亡人數約占全部惡性腫瘤死亡總數的 8%～9%[2]，且其病死率呈逐年上升、年輕化的趨勢，目前其已成為導致惡性腫瘤死亡的主要原因之一[3-4]。在我國，CRC 發病率和病死率分別位于所有惡性腫瘤的第 3 位和第 5 位[5]，且整體預后較差，主要因為患者就診時多為進展期甚至遠處轉移的晚期患者，已錯過最佳治療期。近年來，隨著腸癌疾病相關的基因、表觀遺傳學改變及發病機制的進一步揭示，使得早診、早篩的手段更精準、有效，CRC 患者的整體診療、預后也得到明顯改善。已有研究[6-7]證實，部分腫瘤相關分子的表達水平與 CRC 患者的臨床病理特征及生存預后存在相關性，可作為 CRC 患者預后評價及治療反應效率的分子生物學標志物。目前泛素-蛋白酶體降解系統在腫瘤生物學功能中的重要作用逐漸被人們所認識，該系統底物特異性由 E3 連接酶決定，而 DTX2（deltex 2）為其中關鍵酶之一，目前關于 DTX2 在腫瘤進展中的生物學作用研究甚少。有研究[8]提示，DTX2 在頭頸部腫瘤的進展及預后中扮演著重要作用，但 DTX2 在 CRC 組織中的研究尚不清楚。因此，本研究探討了 DTX2 分子在 CRC 組織中的表達情況及其與患者臨床病理特征及預后的相關性，有望為 CRC 的治療提供潛在靶點。
1 資料與方法
1.1 數據收集
1.1.1 數據庫資料
① Oncomine 數據庫中收錄了近 20 種腫瘤芯片的 DNA 和 RNA 測序數據。在 Oncomine 數據庫中檢索 DTX2 基因與 CRC 相關研究的數據集，篩選條件為：腫瘤類型（CRC）、分析類型（CRC 組織與正常結直腸組織，其中“正常結直腸組織”簡稱“正常組織”）、基因（DTX2）、數據類型（mRNA）、有統計學意義（P<0.01）及基因差異表達上調倍數前 10%。本研究分析 Oncomine 數據庫中 DTX2 mRNA 在 CRC 組織和正常組織中的表達。② GEPIA 數據庫是由北京大學研發，收錄了 9 736 個腫瘤樣本和 8 587 個正常組織樣本的 RNA 測序數據，可在線分析不同腫瘤的基因表達水平、臨床病理特征、預后生存等。本研究應用 GEPIA 平臺分析 CRC 組織和正常組織中的 DTX2 mRNA 表達水平。③ 人類蛋白圖譜（human protein atlas，HPA）用來分析蛋白質在組織和器官中的分布及在亞細胞中定位[9]，并用特制的抗體檢測每一種蛋白質在 48 種人類正常組織、20 種腫瘤組織、47 個細胞系和 12 種血液細胞內的分布和表達，免疫組織化學染色結果具有典型的代表性，因此，本研究運用 HPA 分析 DTX2 蛋白表達與 CRC 患者生存預后的關系。
1.1.2 臨床資料
回顧性收集 2018 年 1 月至 2018 年 12 月期間于大連大學附屬新華醫院（簡稱“我院”）普通外科行 CRC 手術的 55 例 CRC 組織以及相應的癌旁正常（PN）組織。納入標準：① CRC 根治手術；② 術后病理明確診斷；③ 臨床病理資料完整；④ 所有患者均簽署知情同意書且研究方案經大連大學附屬新華醫院倫理委員會審核通過。排除標準：① 新輔助放化療患者；② 伴嚴重心肺疾病患者；③ 伴有其他惡性腫瘤患者；④ 不同意簽署知情同意書患者。55 例 CRC 患者中男 30 例，女 25 例；年齡 40～79 歲，中位年齡 65 歲，其中≤65 歲 25 例；直腸癌 30 例，結腸癌 25 例；腫瘤直徑 1.5～6.5 cm，中位數為 4.4 cm，其中≤4.4 cm 23 例；腫瘤浸潤深度：T1+T2 期 14 例，T3+T4 期 41 例；淋巴結轉移：N0 期 29 例，N1+N2 期 26 例；遠處轉移：M0 期 48 例，M1 期 7 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ 期 13 例，Ⅲ+Ⅳ 期 42 例。
1.2 檢測方法
1.2.1 主要試劑
TRizol 裂解液購于美國 Sigma 公司，二步法反轉錄試劑盒購自日本 Takara 公司，PCR 引物由上海生物工程技術公司合成，DTX2 抗體（ab170907）購自美國 Abcam 公司，磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體和二抗（羊抗兔）購自武漢三鷹 Proteintech 公司，免疫組織化學染色相關試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。
1.2.2 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法
用 TRizol 提取組織中總 RNA。按 Takara 反轉錄試劑盒兩步法合成 cDNA，然后進行 PCR 擴增，反應體系按說明書指定。DTX2 上游引物：5′ -ACTGCAACGGCAATAAGGA-3′ ，下游引物：5′ -GGGAGCGACATCTGGAAC-3′ ，擴增產物長度為 121 bp；內參 GAPDH 上游引物：5′ -ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′ ，下游引物：5′ -CTGTTGAAGTCAGAGGAGACCAC-3′ ，擴增產物長度為 156 bp。每組設 3 個復孔。mRNA 表達量比較采用 2–ΔΔCt 計算，其中 ΔCt=ΔCt目的–ΔCt內參，ΔΔCt =ΔCt CRC 組織–ΔCt正常組織。
1.2.3 免疫組織化學染色法
石蠟標本切片厚度為 3.5 μm，經脫蠟、抗原熱修復（pH=9.0）、3% 過氧化氫孵育、血清封閉、孵育一抗（DTX2 濃度 1∶200，4 ℃ 過夜）、復溫（30 min）、生物素標記的二抗孵育（30 min）、顯色（DAB 時間 30 s）、蘇木精復染、封片等步驟，在顯微鏡下觀察染色效果。腫瘤細胞染色陽性百分率的評估標準：≤5% 為 0 分，6%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，≥51% 為 3 分；腫瘤細胞染色強度的評估標準：未染色 0 分，淺黃色 1 分，棕黃色 2 分，棕褐色 3 分。按免疫反應積分法（腫瘤細胞染色陽性百分率分值×腫瘤細胞染色強度分值）判斷，≥4 分判定為 DTX2 蛋白表達呈陽性，<4 分判定為 DTX2 蛋白表達呈陰性[10]。
1.2.4 Western blot 檢測法
用 RIPA 裂解液加蛋白酶抑制劑提取組織總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸 10 min 使蛋白變性，配制 SDS-PAGE 膠，按 30 μg/孔蛋白樣品加樣，每個泳道保持等體積用緩沖液配平，電泳分離蛋白后電轉至 PVDF 膜上，5% 的脫脂牛奶室溫封閉 2 h。加入稀釋的 DTX2（1∶4 000）、GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入按1∶8 000稀釋的羊抗兔二抗，室溫孵育 2 h。TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，ECL 化學發光顯影，曝光并拍照。以 GAPDH 為內參，重復 3 次。使用 Image J 軟件分析各條帶灰度值。DTX2 蛋白表達水平=（DTX2 條帶吸光度值×面積）/（GAPDH 條帶吸光度值×面積）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行分析。對計量數據進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示并用 t 檢驗，不符合正態分布的計量數據采用中位數（M）和上下四分位數（P25，P75）表示并采用 Mann-Whiteney U 檢驗；計數資料比較采用 Pearson χ2 檢驗。生存預后分析采用 Kaplan-Meier 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 DTX2 mRNA 表達在線數據分析結果
① Oncomine 數據庫中的研究[11-13]（表 1）發現，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織中較正常組織升高（P<0.05），見圖 1a。② 應用 GEPIA 數據庫分析結果顯示，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織（n=275）中明顯高于在正常組織（n=349）中（P<0.01），見圖 1b。③HPA 在線數據分析結果顯示，DTX2 低表達（n=249）CRC 患者的總生存情況好于 DTX2 高表達者（n=211），差異有統計學意義（P=0.009 8），見圖 1c。
圖1
示 DTX2 在在線數據庫和臨床病例組織中的表達情況
a：Oncomine 數據庫分析結果，見 DTX2 mRNA 在 6 項芯片的 CRC 組織中表達均高于正常組織（
表1
Oncomine 數據庫中 DTX2 mRNA 在 CRC 與正常組織中表達水平的 6 項芯片的測序數據
2.2 DTX2 mRNA 和蛋白在臨床病例 CRC 組織中的表達情況
qRT-PCR 法檢測結果表明，CRC 組織中 DTX2 mRNA 的表達水平高于 PN 組織（t=0.722，P<0.001），見圖 1d。Western blot 檢測 DTX2 蛋白表達結果見圖 1e、1f，DTX2 蛋白表達在 CRC 組織中高于 PN 組織（t=1.314，P<0.001）。免疫組織化學染色結果（圖 1g、1h）顯示，DTX2 蛋白陽性表達呈棕黃色或棕褐色且主要位于細胞核。CRC 組織中 DTX2 蛋白表達陽性 46 例，陰性 9 例；PN 組織中 DTX2 蛋白表達陽性 13 例，陰性 42 例，DTX2 蛋白表達陽性率在 CRC 組織中高于 PN 組織（69.7%比19.7%，χ2=0.899，P<0.001）。
2.3 DTX2 在 CRC 組織中的表達與 CRC 患者臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2 可見，DTX2 蛋白陽性表達、DTX2 mRNA 和蛋白表達量均與 CRC 患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及 TNM 分期有關，即腫瘤浸潤深度越深、淋巴結分期及 TNM 分期越晚者，DTX2 蛋白表達陽性率越高、DTX2 mRNA 和蛋白表達量越高（P<0.05），而其與患者的性別、性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、腫瘤直徑及遠處轉移均無關（P>0.05）。
表2
DTX2 在 CRC 組織中的表達與 CRC 患者臨床病理特征的關系
3 討論
近年來，CRC 的診療技術雖然已取得了較大的進步和突破，但由于其發生和發展是一個多步驟演進且具有復雜遺傳學和表觀遺傳學變化的異質性疾病[6]，其病死率仍居高不下。然而近 20 年來，發達國家 CRC 的發病率和病死率呈明顯下降趨勢，得益于早期篩查的普及和避免高危因素的暴露[14]。我國也應將工作重心轉移到防治戰略體系上，提倡以“關口前移，預防為主”為中心，這對于改善我國 CRC 的治療現狀具有重大意義[2, 15]。近年來，亦有越來越多的研究者對 CRC 早期篩查、預測腫瘤標志物及多組學數據挖掘方面展開了系列的深入研究。
DTX2 即 deltex-2，又稱為 E3 泛素蛋白連接酶，由 DTX2 基因編碼，最初在果蠅身上發現。人類 DTX 家族包括 DTX1、DTX2、DTX3 和 DTX4，結構上都包含 N 末端、富含脯氨酸的區域和鋅指結構域[16-18]。DTX2 屬于泛素-蛋白酶體系統且為最關鍵的酶之一，在調節細胞內多個信號通路中起著關鍵性作用[17]，其參與蛋白質翻譯后的泛素化修飾。DTX2 可識別被降解的蛋白連接到底物上，參與細胞內蛋白質降解的重要途徑，其在腫瘤的進展中起著比較關鍵的作用[19]。DTX2 參與 Notch 信號通路中的 CSL 非依賴途徑，即 Notch 受體的 ANK 區與 Deltex 的鋅指蛋白結合，從而實現 Notch 信號通路的調控。有研究[20-22]報道，在乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織及細胞株中均存在 Notch 受體及配體的異常表達，從而引起不同的生物學作用。另外，已有研究[8, 19]發現，DTX2 在白血病、頭頸部癌等腫瘤組織中高表達，而在其 PN 組織中低表達，提示 DTX2 在腫瘤的進展及預后中可能起著重要作用。但是 DTX2 在 CRC 組織中的作用尚不清楚，因此，本研究擬通過腫瘤數據庫分析 DTX2 在 CRC 中的表達情況，然后進一步通過臨床數據從基因和蛋白水平進行驗證，以評估 DTX2 在 CRC 的早診及預后預測中的價值。
Oncomine 和 TCGA 是全球最權威的癌基因芯片數據庫，其收錄的數據具有較高的質量和可信度，對腫瘤的研究及治療靶標的挖掘有非常重要的價值。本研究利用在線數據庫二次分析結果顯示，DTX2 mRNA 表達在 CRC 組織中高于正常組織（P<0.05）；HPA 蛋白平臺分析結果顯示，DTX2 蛋白表達水平與 CRC 患者的生存預后相關，與 DTX2 蛋白低表達組比，高表達組 CRC 患者的總生存情況更差（P=0.009 8），提示 DTX2 高表達可能是 CRC 患者預后不良的因素之一。本研究的臨床數據結果顯示，CRC 組織中 DTX2 mRNA 及其蛋白表達均高于其 PN 組織，DTX2 蛋白表達陽性率與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及 TNM 分期密切相關，但與腫瘤遠處轉移無關，提示 DTX2 可能參與 CRC 的進展并起到促癌作用，但其是否參與 CRC 的遠處轉移行為還需要進一步研究。
從以上研究結果提示，DTX2 蛋白表達可能作為評估 CRC 進展的新型生物學指標，但需要進一步探索 DTX2 的生物學功能及其作用機制，為 CRC 的早篩、診斷、預后評估及發病機制的探究提供新的線索和思路。但由于本研究有一定的不足之處，如未發現 DTX2 蛋白表達陽性率與 CRC 患者的遠處轉移有關；無 DTX2 蛋白陽性表達與 CRC 患者預后評價的臨床數據；因病例數少，不能細化臨床分期進行分析，如 DTX2 蛋白表達陽性率是否隨臨床（Ⅰ~Ⅳ）分期增長呈逐漸升高趨勢等這些問題導致結果可能存在統計偏倚，因此需要進一步擴大樣本例數，使研究結論更嚴謹、經得住驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馬振南負責基礎實驗和論文撰寫；許廣大負責臨床標本收集；劉福全和張曉微負責患者臨床資料收集；趙雪峰負責數據統計分析。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬新華醫院倫理委員會審批（批文編號：20210120）。
