引用本文： 王海清, 馮燮林, 李磊, 郝景程, 龔辰. 肝細胞癌復發前后干細胞性標志物的變化特征及其與臨床病理特征的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(5): 587-594. doi: 10.7507/1007-9424.202007121 復制
近年來，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）“干細胞理論”的提出，使學者們對 HCC 發生、發展、復發和轉移機制有了新的認識，并為肝癌的治療及預后提供了新的思路[1-2]。干細胞性標志物指的是部分肝癌細胞表面表達的一類分子標志物，常見的干細胞性標志物包括表皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CD133、CD90、CD117 等。這些標志物的表達代表了腫瘤細胞具有更強的侵襲性行為和更差的預后，是肝癌根治性治療后復發和轉移的關鍵因素[3]。Kim 等[4]的一項研究進一步證實，這些干細胞性標志物不但影響肝癌患者根治性切除術后的預后，還是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。該研究[4]通過 HCC 切除后的標本發現，HCC 細胞中端粒的長度縮短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 陽性表達的亞組細胞中，端粒酶活性增加、端粒長度反而增加。因此認為，干細胞性標志物的表達維持了端粒的長度，因而也導致了更差的預后。HCC 根治性切除后的 5 年復發率仍高達 70%[4-5]，復發性肝癌的治療也逐漸成為臨床關注的焦點。而腫瘤在演進過程中因獲得性遺傳不穩定性，常出現多個不同生物學特征的細胞亞群。因此，肝癌復發后的腫瘤特性也可能發生改變[6]。對于復發肝癌所表達的干細胞性標志物以及端粒的長度是否會有所改變，目前鮮見相關研究，因此對復發肝癌干細胞性標志物和端粒長度的研究對預測復發肝癌的預后以及采取進一步輔助治療具有一定的臨床意義。本研究擬通過比較肝癌復發前后的病理標本，探討干細胞性標志物表達及端粒長度的改變情況，及其對臨床的意義。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
納入標準：① 同時于四川省腫瘤醫院行首次切除和復發后再次切除的 HCC 患者；② 首次、復發肝癌患者行病理檢查均證實為 HCC；③ 首次治療的 HCC 為巴塞羅那（BCLC） 0～C 期；④ 兩次治療均采用手術切除，且達到根治性切除標準（根治性切除判斷標準：肝癌患者無遠處轉移，無門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管侵犯；完全切除腫瘤；病理證實切緣無 HCC 細胞殘留）。排除標準：① 排除膽管細胞癌和肝細胞-膽管細胞混合型肝癌；② 排除遠處轉移、淋巴結轉移以及侵犯大血管（門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管）的患者；③ 排除行射頻消融和無水乙醇治療的患者；④ 排除失訪和無法提供足夠 HCC 組織進行檢測的患者；⑤ 排除復發前針對腫瘤進行過化療、放療、介入等治療的患者；⑥ 排除合并其他惡性腫瘤的患者。
本研究回顧性納入 2010 年 1 月至 2018 年 10 月期間于四川省腫瘤醫院行肝癌根治性切除術后復發、再次行手術治療的患者。收集該患者的臨床資料，并配對收集復發前后的病理標本；檢測病理標本中干細胞性標志物（EpCAM、CD133、CD90 和 CD177）的表達和端粒長度。本研究通過四川省腫瘤醫院醫學倫理委員會審批，患者及家屬均簽署知情同意書。最終納入 25 例患者，男 22 例（88.0%），女 3 例（12.0%）；年齡 20～74 歲，中位年齡 51 歲 ［（46，63）歲］；合并乙肝（hetatitis B virus，HBV）感染 20 例（80.0%）；所有患者的肝功能 Child-Pugh 分級均為 A 級。所有患者均獲得了根治性肝切除并進行了病理檢查，并行 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的免疫組織化學檢測，以及端粒長度測量。
1.2 免疫組織化學染色方法
選取納入患者復發前后的石蠟包埋標本，對肝癌組織進行 4 μm 連續切片；切片后進行 HE 染色及兔抗人 EpCAM 多克隆抗體、兔抗人 CD90 多克隆抗體、兔抗人 CD133 多克隆抗體和兔抗人 CD117 多克隆抗體免疫組織化學染色。免疫組織化學染色采用 EnVision 兩步法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。每例樣本的每種標志物選取 3 張組織切片進行免疫組織化學染色，由兩名病理醫師采用雙盲法分別進行評定和分析。陽性對照根據抗體官方說明書推薦組織進行染色，其中 EpCAM 使用人結腸癌組織，CD90 使用人扁桃體組織，CD133 使用人胰腺組織，CD117 使用人肺腺癌組織進行對照。陰性對照使用同型對照方式進行，上述四類染色在一抗孵化時均加做以非免疫 IgG 代替一抗的陰性對照。結果采用計算機軟件（Image J，NIH）進行陽性細胞/每高倍鏡視野（cells/HPF）計數，最終結果采用 2 位病理科醫師的 3 張切片結果的平均值。
1.3 端粒長度原位熒光雜交檢測
石蠟切片經脫蠟后進行熱誘導抗原修復，隨后與熒光素 Cy3 標記的端粒序列特異性探針 ［N-C 端：CCCTAACCCTAACCCTAA；N 端共價連接 Cy3 熒光素（韓國 Panagene 公司）］ 進行雜交培育。然后將切片以直接熒光法染色，采用 4x, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進行對照染色。
1.4 隨訪
術后門診定期復查，每 3～6 個月進行胸部 CT 平掃、腹部增強 CT 或彩超，以及 AFP 檢查；采用門診或電話方式進行術后隨訪，隨訪內容主要為了解患者生存情況。本組患者的隨訪截止時間為 2019 年 12 月 1 日。
1.5 統計學方法
應用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。計量資料采用 K-S 檢驗正態性，服從正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，否則采用中位數（P25，P75）表示，組間比較采用配對 t 檢驗；偏態分布計量資料組間比較采用非參數檢驗（秩和檢驗 Mann-Whitney U）。計數資料組間比較采用配對 χ2 檢驗或者 Fisher 確切概率法。采用 Kaplan-Meier 法計算生存率并繪制生存曲線，采用 log-rank 檢驗或 Breslow 檢驗進行生存分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 隨訪情況
本研究共納入 25 例 HCC 患者，所有患者均進行了 2 次 HCC 切除術（首次 HCC 切除和復發后 HCC 的切除）。25 例患者均獲訪，總隨訪時間為 8～94 個月（第 1 次術后的隨訪時間），中位隨訪時間為 31 個月。首次切除后腫瘤復發時間為 4～84 個月，中位復發時間為 14 個月。所有患者從第 1 次術后至隨訪截止時間的中位生存時間為 50.1 個月，1、3 和 5 年總生存率分別為 95.7%、78.2% 和 44.7%（圖1a）。
圖1
示 HCC 患者總體的生存曲線和復發前后的無瘤生存曲線
a：示 HCC 患者總體的生存曲線；b：示 HCC 患者首次切除和復發切除后的無瘤生存曲線
2.2 HCC 復發前后的臨床、病理和生物學特征比較
HCC 復發前后的臨床病理學特點總體趨于一致。患者復發前后的肝功能指標（總膽紅素、白蛋白、AST 和 ALT）、國際標準化比值（INR）、AFP、衛星結節、BCLC 分期、分化程度、解剖性肝切除、肝硬化、輸血情況以及干細胞標志物（EpCAM、CD90、CD133 和 CD117）的表達水平比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。但 HCC 復發前的 PLT 計數和腫瘤直徑均高于（大于）復發后，且腫瘤多發和微血管癌栓（MVI）占比較低，端粒長度較短（P<0.05）。復發腫瘤具有直徑小和多發的特點，但腫瘤的其他生物學特性并無明顯改變；盡管復發前后的腫瘤直徑和數量具有差異，但由于經過嚴格的手術指征篩選，納入患者復發前和復發后腫瘤的 BCLC 分期和分化程度差異不大。具體見表1。
表1
25 例 HCC 復發前后的臨床病理特點
在腫瘤復發方面，Kaplan-Meier 分析結果表明，復發前患者的 1 年和 3 年無瘤生存率分別為 52.1% 和 12.4%；復發再次手術后患者的 1 年和3 年無瘤生存率分別為 49.7% 和 23.2%；復發前后患者的無瘤生存率比較差異無統計學意義（χ2=1.948，P=0.163），見圖1b。
2.3 干細胞性標志物、端粒長度與腫瘤病理特征的關系
本研究對 25 例患者復發前后的 50 例腫瘤標本進行病理特征和干細胞性標志物分析，探討干細胞性標志物與腫瘤病理特征的關系。相關分析發現，端粒長度與 EpCAM（r=–0.092，P=0.513）、CD90（r=–0.235，P=0.100）、CD133（r=0.024，P=0.867）和 CD117（r=–0.277，P=0.052）的表達水平均沒有相關性；但 EpCAM 與 CD133 呈正相關（r=0.358，P=0.011）。
分析臨床病理特征與干細胞性標志物表達水平和端粒長度之間的相關性發現，腫瘤直徑、腫瘤數量、BCLC 分期、衛星結節以及分化程度均不影響 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表達水平（P>0.05）；但對于 MVI 陽性的腫瘤，其 EpCAM 表達水平（P=0.016）和端粒長度（P=0.001）均高于 MVI 陰性的患者（表2）；同時直徑<5 cm 的腫瘤（P=0.038）和低分化（P=0.046）的腫瘤其端粒長度也更長。該結果提示，MVI 與 EpCAM 表達和端粒延長相關，端粒的長度還與腫瘤直徑和分化程度相關。
表2
干細胞性標志物表達水平及端粒長度與 HCC 臨床病理特征的關系［M（P25，P75） ］
2.4 影響 HCC 無瘤生存的因素
本研究對 HCC 復發前后無瘤生存的影響因素分別進行了單因素分析。對于復發前，單因素分析發現，BCLC 分期（P=0.040）和分化程度（P=0.003）是影響 HCC 患者首次切除后無瘤生存的影響因素，見表3。對復發后 HCC，單因素分析發現，BCLC 分期（P=0.017）和腫瘤直徑（P=0.035）是影響無瘤生存的影響因素，見表3。因此，本研究結果提示，干細胞性標志物表達水平和端粒長度并不是 HCC 復發的影響因素。
表3
HCC 復發前后無瘤生存的影響因素分析
3 討論
本研究通過對 25 例 HCC 患者的病理標本的研究發現，復發 HCC 患者具有腫瘤多發、直徑小和端粒長度增加的特點；干細胞性標志物在 HCC 復發前后的表達水平并沒有明顯差異。但進一步的研究發現，MVI 陽性的 HCC 其 EpCAM 表達水平較 MVI 陰性的 HCC 增加，其端粒也進一步延長。端粒的長度還與腫瘤直徑和分化程度相關。對于復發前，BCLC 分期和分化程度是 HCC 患者首次切除后無瘤生存的影響因素；對于復發后 HCC，BCLC 分期和腫瘤直徑是無瘤生存的影響因素，但干細胞性標志物和端粒長度并不是影響 HCC 復發的影響因素。因此，干細胞性標志物的表達在同一患者不同時期的 HCC 中總體趨于一致，其表達體現了 HCC 的分子生物學特點，但本研究有限的樣本發現其并不影響 HCC 的預后。
端粒是染色體末端的 TTAGGG 重復序列，起到保護染色體末端衰退的作用[7]。對多種實體腫瘤的研究均表明，端粒酶活性以及端粒長度與腫瘤的形成密切相關[8-11]。肝癌干細胞性相關標志物是指角蛋白 19（（keratin 19，K19）、EpCAM、CD133、CD117 等標志物。研究[12]已證明，表達干細胞性標志物的腫瘤細胞凋亡減少、分化能力增強，比傳統的肝癌惡性程度更高，也與肝癌的預后密切相關。總的來說，表達干細胞性標志物的肝癌常無包膜，更易呈現出浸潤性生長、血管侵犯、腫瘤更大、分化程度更差、纖維基質成分更常見等特征[5, 13-16]。這些侵襲性的特征能夠促進 HCC 復發和轉移。Durnez 等[17]對 HCC 肝移植術后的研究發現，K19 陽性表達 HCC 患者肝移植后的 5 年復發率高達 50%，而陰性患者只有 25%。Kim 等[11]的研究進一步證實，干細胞性標志物可能是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制，該研究通過 HCC 切除后的標本發現，HCC 細胞中端粒的長度比癌旁組織和正常肝組織都短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 表達的亞組細胞中，端粒酶逆轉錄酶表達上調、端粒酶活性增加、端粒的長度增加，尤其是在 K19 和 EpCAM 陽性的 HCC 細胞中更明顯；而在常規肝癌細胞中，端粒仍具有較短的長度，進一步分析發現端粒的長度增加導致了更差的預后。因此，該研究認為，干細胞性標志物可能是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。
由于腫瘤異質性的存在，不同 HCC 患者的癌組織中干細胞性標志物或端粒長度可能本身就存在差異，這不利于討論和比較復發肝癌的生物學特性以及端粒長度是否存在變化。因此，本研究采用了同一患者前后兩次 HCC 的病理組織進行比較，消除了不同患者間腫瘤的異質性。本研究通過對 25 例 HCC 復發前后切除標本的分析發現，復發前后 HCC 組織中干細胞性標志物的表達水平沒有差異，而復發后端粒長度明顯增加；但是相關分析發現，端粒的長度與干細胞性標志物的表達也沒有關聯。因此，同一 HCC 患者即使是腫瘤復發，其生物學特性也基本維持一致。本研究結果提示，暫不能認為干細胞性標志物是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。
但是，本研究也有一些發現：首先發現了 MVI 陽性的患者，其 EpCAM 表達水平明顯增高。端粒的長度與腫瘤直徑、MVI 和分化程度相關。EpCAM 屬于黏附分子家族，其作為上皮細胞間黏附分子，在上皮細胞癌變過程中發揮著重要作用，主要通過調節細胞增殖、免疫逃逸等機制促成腫瘤的發生，并與腫瘤的遷移和侵襲性密切相關[18-23]。同時這部分患者的端粒長度明顯增加，因此也證實了表達干細胞性標志物的腫瘤具有侵襲性的特征，端粒長度也反映了腫瘤的惡性特征。但是針對端粒長度與干細胞性標志物表達的相關分析卻發現并沒有相關性，因此干細胞性標志物和端粒很可能是通過不同機制影響肝癌細胞的生物學特性。這與 Kim 的實驗結果不同，其可能原因在于 Kim 的研究是針對 EpCAM 陽性肝癌細胞進行單個細胞的端粒長度測量[11]，而本研究測量了整個 HCC 組織中的端粒長度和 EpCAM 的表達水平。另外一個發現是，復發 HCC 患者具有更低的 PLT 計數、腫瘤直徑小和多發的特點。首先，本研究對臨床病理特征進行分析后發現，復發 HCC 患者具有更低的 PLT 計數（P=0.022）。這很可能是因為復發 HCC 患者由于手術切除導致了更少的殘留肝組織，而肝體積減小會導肝門靜脈壓力增高和脾功能亢進[24]，因此 PLT 計數更低。其次，復發 HCC 患者的腫瘤直徑更小（P=0.004），但腫瘤數量更多（P=0.005）。復發 HCC 患者面臨更嚴格的術前篩查，因此診斷復發的時候 HCC 具有腫瘤直徑小的特點，同時由于根據 BCLC 分期進行手術適應證的篩選，更多的多發腫瘤患者被篩查進來，因此導致初發和復發患者在 HCC 的 BCLC 分期方面沒有差異。第三，HCC 患者復發前后 HCC 組織中 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表達水平沒有差異，但復發 HCC 患者其端粒較長（P=0.003），這可能是由于 HCC 在復發過程中需要更長的端粒進行癌細胞的增殖和侵襲。在 25 例 HCC 中，19 例 HCC 在復發后端粒長度增加，而 6 例 HCC 患者復發后端粒長度反而縮小。因此也代表了端粒長度增加這一部分 HCC 患者可能具有侵襲性的腫瘤生物學特性。但是本研究的生存分析發現，HCC 復發前后的無瘤生存率并沒有差異，生存分析也發現端粒長度以及干細胞性標志物的表達水平并不是影響無瘤生存的危險因素。但是由于本研究僅納入了 25 例 HCC 患者，樣本量也限制了對生存危險因素的鑒別力度。
本研究仍存在一些不足。首先，由于復發 HCC 能夠達到再次切除者較少，因此納入研究的樣本量過小。其次，本研究為單中心回顧性研究，端粒以及干細胞性標志物對預后的作用需要進行多方面的驗證。第三，由于本研究為配對研究，能夠納入的病例較少，因此無法進一步研究 HCC 早期復發和晚期復發類型對干細胞性標志物表達的影響。第四，部分 HCC 具有多個腫瘤，本研究只選取了具有代表性的腫瘤進行干細胞性標志物和端粒的檢測。因此，本研究的結論需要擴大樣本量和多中心研究進行驗證。
綜上，本研究發現，與 HCC 復發前相比，復發 HCC 具有相似的干細胞性標志物表達，但端粒更長；EpCAM 表達水平與端粒長度均反映了 HCC 的惡性特點，但兩者并沒有相關性。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王海清，課題設計和論文撰寫；馮燮林，課題設計和論文修改；李磊，標本收集、臨床數據收集和統計分析；郝景程和龔辰，病理標本的免疫組織化學和原位熒光雜交檢測。
倫理聲明：本研究已通過四川省腫瘤醫院的倫理審核批準［批文編號：SCCHEC-02-2020-017］。
近年來，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）“干細胞理論”的提出，使學者們對 HCC 發生、發展、復發和轉移機制有了新的認識，并為肝癌的治療及預后提供了新的思路[1-2]。干細胞性標志物指的是部分肝癌細胞表面表達的一類分子標志物，常見的干細胞性標志物包括表皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CD133、CD90、CD117 等。這些標志物的表達代表了腫瘤細胞具有更強的侵襲性行為和更差的預后，是肝癌根治性治療后復發和轉移的關鍵因素[3]。Kim 等[4]的一項研究進一步證實，這些干細胞性標志物不但影響肝癌患者根治性切除術后的預后，還是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。該研究[4]通過 HCC 切除后的標本發現，HCC 細胞中端粒的長度縮短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 陽性表達的亞組細胞中，端粒酶活性增加、端粒長度反而增加。因此認為，干細胞性標志物的表達維持了端粒的長度，因而也導致了更差的預后。HCC 根治性切除后的 5 年復發率仍高達 70%[4-5]，復發性肝癌的治療也逐漸成為臨床關注的焦點。而腫瘤在演進過程中因獲得性遺傳不穩定性，常出現多個不同生物學特征的細胞亞群。因此，肝癌復發后的腫瘤特性也可能發生改變[6]。對于復發肝癌所表達的干細胞性標志物以及端粒的長度是否會有所改變，目前鮮見相關研究，因此對復發肝癌干細胞性標志物和端粒長度的研究對預測復發肝癌的預后以及采取進一步輔助治療具有一定的臨床意義。本研究擬通過比較肝癌復發前后的病理標本，探討干細胞性標志物表達及端粒長度的改變情況，及其對臨床的意義。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
納入標準：① 同時于四川省腫瘤醫院行首次切除和復發后再次切除的 HCC 患者；② 首次、復發肝癌患者行病理檢查均證實為 HCC；③ 首次治療的 HCC 為巴塞羅那（BCLC） 0～C 期；④ 兩次治療均采用手術切除，且達到根治性切除標準（根治性切除判斷標準：肝癌患者無遠處轉移，無門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管侵犯；完全切除腫瘤；病理證實切緣無 HCC 細胞殘留）。排除標準：① 排除膽管細胞癌和肝細胞-膽管細胞混合型肝癌；② 排除遠處轉移、淋巴結轉移以及侵犯大血管（門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管）的患者；③ 排除行射頻消融和無水乙醇治療的患者；④ 排除失訪和無法提供足夠 HCC 組織進行檢測的患者；⑤ 排除復發前針對腫瘤進行過化療、放療、介入等治療的患者；⑥ 排除合并其他惡性腫瘤的患者。
本研究回顧性納入 2010 年 1 月至 2018 年 10 月期間于四川省腫瘤醫院行肝癌根治性切除術后復發、再次行手術治療的患者。收集該患者的臨床資料，并配對收集復發前后的病理標本；檢測病理標本中干細胞性標志物（EpCAM、CD133、CD90 和 CD177）的表達和端粒長度。本研究通過四川省腫瘤醫院醫學倫理委員會審批，患者及家屬均簽署知情同意書。最終納入 25 例患者，男 22 例（88.0%），女 3 例（12.0%）；年齡 20～74 歲，中位年齡 51 歲 ［（46，63）歲］；合并乙肝（hetatitis B virus，HBV）感染 20 例（80.0%）；所有患者的肝功能 Child-Pugh 分級均為 A 級。所有患者均獲得了根治性肝切除并進行了病理檢查，并行 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的免疫組織化學檢測，以及端粒長度測量。
1.2 免疫組織化學染色方法
選取納入患者復發前后的石蠟包埋標本，對肝癌組織進行 4 μm 連續切片；切片后進行 HE 染色及兔抗人 EpCAM 多克隆抗體、兔抗人 CD90 多克隆抗體、兔抗人 CD133 多克隆抗體和兔抗人 CD117 多克隆抗體免疫組織化學染色。免疫組織化學染色采用 EnVision 兩步法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。每例樣本的每種標志物選取 3 張組織切片進行免疫組織化學染色，由兩名病理醫師采用雙盲法分別進行評定和分析。陽性對照根據抗體官方說明書推薦組織進行染色，其中 EpCAM 使用人結腸癌組織，CD90 使用人扁桃體組織，CD133 使用人胰腺組織，CD117 使用人肺腺癌組織進行對照。陰性對照使用同型對照方式進行，上述四類染色在一抗孵化時均加做以非免疫 IgG 代替一抗的陰性對照。結果采用計算機軟件（Image J，NIH）進行陽性細胞/每高倍鏡視野（cells/HPF）計數，最終結果采用 2 位病理科醫師的 3 張切片結果的平均值。
1.3 端粒長度原位熒光雜交檢測
石蠟切片經脫蠟后進行熱誘導抗原修復，隨后與熒光素 Cy3 標記的端粒序列特異性探針 ［N-C 端：CCCTAACCCTAACCCTAA；N 端共價連接 Cy3 熒光素（韓國 Panagene 公司）］ 進行雜交培育。然后將切片以直接熒光法染色，采用 4x, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進行對照染色。
1.4 隨訪
術后門診定期復查，每 3～6 個月進行胸部 CT 平掃、腹部增強 CT 或彩超，以及 AFP 檢查；采用門診或電話方式進行術后隨訪，隨訪內容主要為了解患者生存情況。本組患者的隨訪截止時間為 2019 年 12 月 1 日。
1.5 統計學方法
應用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。計量資料采用 K-S 檢驗正態性，服從正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，否則采用中位數（P25，P75）表示，組間比較采用配對 t 檢驗；偏態分布計量資料組間比較采用非參數檢驗（秩和檢驗 Mann-Whitney U）。計數資料組間比較采用配對 χ2 檢驗或者 Fisher 確切概率法。采用 Kaplan-Meier 法計算生存率并繪制生存曲線，采用 log-rank 檢驗或 Breslow 檢驗進行生存分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 隨訪情況
本研究共納入 25 例 HCC 患者，所有患者均進行了 2 次 HCC 切除術（首次 HCC 切除和復發后 HCC 的切除）。25 例患者均獲訪，總隨訪時間為 8～94 個月（第 1 次術后的隨訪時間），中位隨訪時間為 31 個月。首次切除后腫瘤復發時間為 4～84 個月，中位復發時間為 14 個月。所有患者從第 1 次術后至隨訪截止時間的中位生存時間為 50.1 個月，1、3 和 5 年總生存率分別為 95.7%、78.2% 和 44.7%（圖1a）。
圖1
示 HCC 患者總體的生存曲線和復發前后的無瘤生存曲線
a：示 HCC 患者總體的生存曲線；b：示 HCC 患者首次切除和復發切除后的無瘤生存曲線
2.2 HCC 復發前后的臨床、病理和生物學特征比較
HCC 復發前后的臨床病理學特點總體趨于一致。患者復發前后的肝功能指標（總膽紅素、白蛋白、AST 和 ALT）、國際標準化比值（INR）、AFP、衛星結節、BCLC 分期、分化程度、解剖性肝切除、肝硬化、輸血情況以及干細胞標志物（EpCAM、CD90、CD133 和 CD117）的表達水平比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。但 HCC 復發前的 PLT 計數和腫瘤直徑均高于（大于）復發后，且腫瘤多發和微血管癌栓（MVI）占比較低，端粒長度較短（P<0.05）。復發腫瘤具有直徑小和多發的特點，但腫瘤的其他生物學特性并無明顯改變；盡管復發前后的腫瘤直徑和數量具有差異，但由于經過嚴格的手術指征篩選，納入患者復發前和復發后腫瘤的 BCLC 分期和分化程度差異不大。具體見表1。
表1
25 例 HCC 復發前后的臨床病理特點
在腫瘤復發方面，Kaplan-Meier 分析結果表明，復發前患者的 1 年和 3 年無瘤生存率分別為 52.1% 和 12.4%；復發再次手術后患者的 1 年和3 年無瘤生存率分別為 49.7% 和 23.2%；復發前后患者的無瘤生存率比較差異無統計學意義（χ2=1.948，P=0.163），見圖1b。
2.3 干細胞性標志物、端粒長度與腫瘤病理特征的關系
本研究對 25 例患者復發前后的 50 例腫瘤標本進行病理特征和干細胞性標志物分析，探討干細胞性標志物與腫瘤病理特征的關系。相關分析發現，端粒長度與 EpCAM（r=–0.092，P=0.513）、CD90（r=–0.235，P=0.100）、CD133（r=0.024，P=0.867）和 CD117（r=–0.277，P=0.052）的表達水平均沒有相關性；但 EpCAM 與 CD133 呈正相關（r=0.358，P=0.011）。
分析臨床病理特征與干細胞性標志物表達水平和端粒長度之間的相關性發現，腫瘤直徑、腫瘤數量、BCLC 分期、衛星結節以及分化程度均不影響 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表達水平（P>0.05）；但對于 MVI 陽性的腫瘤，其 EpCAM 表達水平（P=0.016）和端粒長度（P=0.001）均高于 MVI 陰性的患者（表2）；同時直徑<5 cm 的腫瘤（P=0.038）和低分化（P=0.046）的腫瘤其端粒長度也更長。該結果提示，MVI 與 EpCAM 表達和端粒延長相關，端粒的長度還與腫瘤直徑和分化程度相關。
表2
干細胞性標志物表達水平及端粒長度與 HCC 臨床病理特征的關系［M（P25，P75） ］
2.4 影響 HCC 無瘤生存的因素
本研究對 HCC 復發前后無瘤生存的影響因素分別進行了單因素分析。對于復發前，單因素分析發現，BCLC 分期（P=0.040）和分化程度（P=0.003）是影響 HCC 患者首次切除后無瘤生存的影響因素，見表3。對復發后 HCC，單因素分析發現，BCLC 分期（P=0.017）和腫瘤直徑（P=0.035）是影響無瘤生存的影響因素，見表3。因此，本研究結果提示，干細胞性標志物表達水平和端粒長度并不是 HCC 復發的影響因素。
表3
HCC 復發前后無瘤生存的影響因素分析
3 討論
本研究通過對 25 例 HCC 患者的病理標本的研究發現，復發 HCC 患者具有腫瘤多發、直徑小和端粒長度增加的特點；干細胞性標志物在 HCC 復發前后的表達水平并沒有明顯差異。但進一步的研究發現，MVI 陽性的 HCC 其 EpCAM 表達水平較 MVI 陰性的 HCC 增加，其端粒也進一步延長。端粒的長度還與腫瘤直徑和分化程度相關。對于復發前，BCLC 分期和分化程度是 HCC 患者首次切除后無瘤生存的影響因素；對于復發后 HCC，BCLC 分期和腫瘤直徑是無瘤生存的影響因素，但干細胞性標志物和端粒長度并不是影響 HCC 復發的影響因素。因此，干細胞性標志物的表達在同一患者不同時期的 HCC 中總體趨于一致，其表達體現了 HCC 的分子生物學特點，但本研究有限的樣本發現其并不影響 HCC 的預后。
端粒是染色體末端的 TTAGGG 重復序列，起到保護染色體末端衰退的作用[7]。對多種實體腫瘤的研究均表明，端粒酶活性以及端粒長度與腫瘤的形成密切相關[8-11]。肝癌干細胞性相關標志物是指角蛋白 19（（keratin 19，K19）、EpCAM、CD133、CD117 等標志物。研究[12]已證明，表達干細胞性標志物的腫瘤細胞凋亡減少、分化能力增強，比傳統的肝癌惡性程度更高，也與肝癌的預后密切相關。總的來說，表達干細胞性標志物的肝癌常無包膜，更易呈現出浸潤性生長、血管侵犯、腫瘤更大、分化程度更差、纖維基質成分更常見等特征[5, 13-16]。這些侵襲性的特征能夠促進 HCC 復發和轉移。Durnez 等[17]對 HCC 肝移植術后的研究發現，K19 陽性表達 HCC 患者肝移植后的 5 年復發率高達 50%，而陰性患者只有 25%。Kim 等[11]的研究進一步證實，干細胞性標志物可能是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制，該研究通過 HCC 切除后的標本發現，HCC 細胞中端粒的長度比癌旁組織和正常肝組織都短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 表達的亞組細胞中，端粒酶逆轉錄酶表達上調、端粒酶活性增加、端粒的長度增加，尤其是在 K19 和 EpCAM 陽性的 HCC 細胞中更明顯；而在常規肝癌細胞中，端粒仍具有較短的長度，進一步分析發現端粒的長度增加導致了更差的預后。因此，該研究認為，干細胞性標志物可能是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。
由于腫瘤異質性的存在，不同 HCC 患者的癌組織中干細胞性標志物或端粒長度可能本身就存在差異，這不利于討論和比較復發肝癌的生物學特性以及端粒長度是否存在變化。因此，本研究采用了同一患者前后兩次 HCC 的病理組織進行比較，消除了不同患者間腫瘤的異質性。本研究通過對 25 例 HCC 復發前后切除標本的分析發現，復發前后 HCC 組織中干細胞性標志物的表達水平沒有差異，而復發后端粒長度明顯增加；但是相關分析發現，端粒的長度與干細胞性標志物的表達也沒有關聯。因此，同一 HCC 患者即使是腫瘤復發，其生物學特性也基本維持一致。本研究結果提示，暫不能認為干細胞性標志物是維持端粒長度和染色體穩定性的關鍵機制。
但是，本研究也有一些發現：首先發現了 MVI 陽性的患者，其 EpCAM 表達水平明顯增高。端粒的長度與腫瘤直徑、MVI 和分化程度相關。EpCAM 屬于黏附分子家族，其作為上皮細胞間黏附分子，在上皮細胞癌變過程中發揮著重要作用，主要通過調節細胞增殖、免疫逃逸等機制促成腫瘤的發生，并與腫瘤的遷移和侵襲性密切相關[18-23]。同時這部分患者的端粒長度明顯增加，因此也證實了表達干細胞性標志物的腫瘤具有侵襲性的特征，端粒長度也反映了腫瘤的惡性特征。但是針對端粒長度與干細胞性標志物表達的相關分析卻發現并沒有相關性，因此干細胞性標志物和端粒很可能是通過不同機制影響肝癌細胞的生物學特性。這與 Kim 的實驗結果不同，其可能原因在于 Kim 的研究是針對 EpCAM 陽性肝癌細胞進行單個細胞的端粒長度測量[11]，而本研究測量了整個 HCC 組織中的端粒長度和 EpCAM 的表達水平。另外一個發現是，復發 HCC 患者具有更低的 PLT 計數、腫瘤直徑小和多發的特點。首先，本研究對臨床病理特征進行分析后發現，復發 HCC 患者具有更低的 PLT 計數（P=0.022）。這很可能是因為復發 HCC 患者由于手術切除導致了更少的殘留肝組織，而肝體積減小會導肝門靜脈壓力增高和脾功能亢進[24]，因此 PLT 計數更低。其次，復發 HCC 患者的腫瘤直徑更小（P=0.004），但腫瘤數量更多（P=0.005）。復發 HCC 患者面臨更嚴格的術前篩查，因此診斷復發的時候 HCC 具有腫瘤直徑小的特點，同時由于根據 BCLC 分期進行手術適應證的篩選，更多的多發腫瘤患者被篩查進來，因此導致初發和復發患者在 HCC 的 BCLC 分期方面沒有差異。第三，HCC 患者復發前后 HCC 組織中 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表達水平沒有差異，但復發 HCC 患者其端粒較長（P=0.003），這可能是由于 HCC 在復發過程中需要更長的端粒進行癌細胞的增殖和侵襲。在 25 例 HCC 中，19 例 HCC 在復發后端粒長度增加，而 6 例 HCC 患者復發后端粒長度反而縮小。因此也代表了端粒長度增加這一部分 HCC 患者可能具有侵襲性的腫瘤生物學特性。但是本研究的生存分析發現，HCC 復發前后的無瘤生存率并沒有差異，生存分析也發現端粒長度以及干細胞性標志物的表達水平并不是影響無瘤生存的危險因素。但是由于本研究僅納入了 25 例 HCC 患者，樣本量也限制了對生存危險因素的鑒別力度。
本研究仍存在一些不足。首先，由于復發 HCC 能夠達到再次切除者較少，因此納入研究的樣本量過小。其次，本研究為單中心回顧性研究，端粒以及干細胞性標志物對預后的作用需要進行多方面的驗證。第三，由于本研究為配對研究，能夠納入的病例較少，因此無法進一步研究 HCC 早期復發和晚期復發類型對干細胞性標志物表達的影響。第四，部分 HCC 具有多個腫瘤，本研究只選取了具有代表性的腫瘤進行干細胞性標志物和端粒的檢測。因此，本研究的結論需要擴大樣本量和多中心研究進行驗證。
綜上，本研究發現，與 HCC 復發前相比，復發 HCC 具有相似的干細胞性標志物表達，但端粒更長；EpCAM 表達水平與端粒長度均反映了 HCC 的惡性特點，但兩者并沒有相關性。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王海清，課題設計和論文撰寫；馮燮林，課題設計和論文修改；李磊，標本收集、臨床數據收集和統計分析；郝景程和龔辰，病理標本的免疫組織化學和原位熒光雜交檢測。
倫理聲明：本研究已通過四川省腫瘤醫院的倫理審核批準［批文編號：SCCHEC-02-2020-017］。
