引用本文： 劉國全, 王雁南, 劉天嬌. 下肢靜脈性潰瘍差異表達基因挖掘及目標基因篩選. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(4): 445-451. doi: 10.7507/1007-9424.202006097 復制
下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcers，VLU）是血管外科的常見疾病，因下肢靜脈倒流或回流障礙而發病，是臨床上頗為棘手的疾病。VLU 在美國發病率為 1%[1]，在我國發病率為 1.5%[2]。超過 70% 的患者無法用壓力治療使 VLU 完全治愈[3]，47% 的患者愈合時間超過 12 個月[4]，美國每年用于該病的治療費用約 149 億美元。VLU 的反復發作、遷延難愈，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[5]。生物信息學是將分子生物學和計算機信息處理技術相結合的交叉學科，可以為疾病分子機制的研究及潛在治療靶點的預測提供新的思路。本研究運用生物信息學方法分析基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫中 VLU 的 mRNA 表達數據，通過與正常皮膚愈合的炎癥期 mRNA 表達數據進行比較，獲得差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并應用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genesandgenomes， KEGG）富集分析觀察 DEGs 的功能，同時構建了蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，以探究 VLU 的分子機制、預測早期診斷標志物以及治療靶點。
1 資料與方法
1.1 基因芯片獲取
使用 GEO 數據庫（
1.2 數據預處理及分析 DEGs
本研究使用 R 語言軟件（version 3.6.1，http://r-project.org/）的 affy 包[7]分別讀取 GSE84571 和 GSE28914 兩個數據集的原始數據，通過 RMA 算法進行背景校正和數據歸一化處理，然后將 2 組數據取交集，使用 R 語言軟件的 preprocesscore 包再次進行數據歸一化處理，同時消除批間差，樣本間校正效果則用二維主成分分析（principal components analysis，PCA）聚類圖進行展示。然后應用 GPL570 平臺所對應的基因注釋文件對探針矩陣進行注釋。使用 R 語言軟件的 limma 包[8]進行差異表達分析并輸出 DEGs，DEGs 滿足P<0.05 及|log2FC|>2 ［差異倍數（fold change, FC）］，并使用 ggplot2 包[9]繪制火山圖和熱圖，直觀地展示 DEGs 的情況。
1.3 GO 和 KEGG 通路富集分析
使用 R 語言軟件的 ClusterProfiler 包[10]對 DEGs 進行富集分析。采用 GO 分析[11]把 DEGs 富集到細胞成分、分析功能及生物學過程 3 個方面。KEGG[12]是一個包含關于基因組、生物途徑、疾病和化學物質信息的數據庫集合。對 DEGs 進行分析后，以 P<0.01 作為條件再對分析結果進行篩選。
1.4 GSEA 分析
為提高分析結果的準確性，我們還進行了補充富集分析，運用 GSEA 軟件（version 6.3，
1.5 PPI 網絡構建及 hub 基因的選擇
利用 STRING 數據庫（
 |
v 為節點，S（v）是包含 v 的最大派系集合，（|C|–1）！是所有|C|–1 的正整數乘積。將分析結果導出后以大于 MCC 最大值為標準篩選核心節點作為差異表達的核心基因。
2 結果
2.1 數據預處理及分析的 DEGs
GSE84571 和 GSE28914 歸一化處理前后的箱型圖對比及 2 組數據合并取交集后數據歸一化處理前后的箱型圖對比見圖 1。二維 PCA 聚類圖及系譜圖（圖 2a、2b）顯示 2 組基因表達有顯著差異但無明顯批間差。數據預處理后，利用 R 語言軟件從中提取了 409 個 DEGs，其中表達上調的基因 173 個、表達下調的基因 236 個，并以熱點圖及火山圖呈現（圖 2c、2d）。
圖1
示 VLU 表達譜芯片（GSE84571）和正常皮膚愈合炎癥期表達譜芯片（GSE28914）歸一化處理前后以及數據取交集后歸一化處理前后的基因表達情況
a、b：歸一化前正常皮膚愈合炎癥期（a）及 VLU（b）表達譜芯片；c：數據取交集歸一化前；d、e：歸一化后正常皮膚愈合炎癥期（d）及 VLU（e）表達譜芯片；f：數據取交集歸一化后
圖2
示 VLU 與正常皮膚愈合炎癥期的二維 PCA 聚類圖和系譜圖以及基因表達的熱點圖及火山圖
a：二維 PCA 聚類圖；b：系譜圖；c：熱點圖；d：火山圖；紅點代表正常皮膚愈合炎癥期，藍點代表 VLU
2.2 功能和通路富集分析
GO 分析結果顯示，上調表達的 DEGs 生物學過程顯著富集在皮膚發育、表皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化和角質化；細胞成分的變化主要在含膠原的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、角質化包膜、膠原三聚體、纖維狀膠原三聚體及帶狀膠原原纖維；分子功能的變化主要富集于 ECM 結構成分、賦予抗張強度的 ECM 結構成分、整聯蛋白結合、膠原結合以及表皮的結構成分。而下調表達的 DEGs 生物學過程顯著富集于對趨化因子的反應、白細胞遷移、白細胞趨化性、中性粒細胞遷移及中性粒細胞趨化性；細胞成分主要富集于三級顆粒、分泌性顆粒膜、三級顆粒膜、富含纖維凝膠蛋白-1 顆粒和特定顆粒；分子功能的變化主要富集于趨化因子受體結合、趨化因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合及趨化因子受體結合。生物學過程富集結果見圖 3a、3b。
圖3
示功能和通路富集分析結果以及 STRING 構建的 PPI 網絡
a、b：示 GO 分析結果，顯示上調（a）和下調（b）生物學過程的基因分布情況；c、d：示 KEGG 通路富集分析結果，c 為下調通路，d 為上調通路，圓點的大小表示基因數目的多少；e：示 GSEA 分析結果，下調通路中靠右側的基因為關鍵基因；f：示 STRING 構建的 PPI 網絡及核心基因，藍色代表下調基因，紅色代表上調基因，黃色為核心基因，節點越大代表基因在網絡中度值越大，連線代表存在相互作用
KEGG 通路富集分析結果顯示，上調表達的 DEGs 主要與 ECM-受體相互作用和蛋白質消化吸收通路相關，Ⅰ型膠原 α1 鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1）、Ⅰ型膠原 α2 鏈（collagen type Ⅰ alpha 2 chain，COL1A2）和Ⅵ型膠原 α6 鏈（collagen type Ⅵ alpha 6 chain，COL6A6）為 ECM-受體相互作用通路的關鍵基因，在上述 2 條通路中共同發揮作用；下調表達的 DEGs 富集的通路主要與金黃色葡萄球菌感染、Toll 樣受體信號通路、利什曼病、非洲錐蟲病、瘧疾、細胞因子和細胞因子受體的相互作用、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、核轉錄因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路、白細胞介素（interleukin，IL）-17 信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、軍團菌病、阿米巴病以及類風濕關節炎密切相關，IL-1β、趨化因子 8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和 IL-10 在多條通路發揮關鍵作用。具體見圖 3c 和 3d。
GSEA 分析結果顯示，除上述通路外，富集的通路還包括寡聚化核苷酸結合結構域（nucleotide binding oligonucleotide domain，NOD）樣受體信號通路、造血細胞系和白細胞跨內皮遷移和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號通路，均為下調通路，其中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 1、MMP9、IL-1β 和 CXCL8 為上述通路的關鍵基因（圖 3e）。
2.3 PPI 網絡構建及 hub 基因的選擇
STRING 構建的 PPI 網絡如圖 3f 所示，利用 CytoHubba 插件選擇 MCC 分析網絡中的核心節點，篩選出前 5 位 hub 基因為甲酰肽受體 （formyl peptide receptor，FPR）1、FPR2、IL-1β、IL-10 和 CXCL8，均為下調基因。
3 討論
VLU 因其遷延難愈、反復發作的特點，給患者和社會帶來沉重的經濟負擔。與正常皮膚傷口愈合的止血、炎癥、增殖和重塑 4 個過程不同，VLU 通常不能有序并及時地由炎癥階段進入增殖階段，從而長期處于慢性炎癥狀態[16-17]。組織學結果發現，VLU 的炎細胞浸潤、細菌定植（如金黃色葡萄球菌）、鐵超載、高度纖維化和過量的膠原蛋白是導致創面無法愈合的重要因素[18-20]。有研究[21]表明，通過抑制炎癥、減少氧化應激、清除蛋白碎片、促成纖維細胞遷移、消除微生物感染等手段，可以加速創面愈合。本研究通過 GEO 數據庫獲取 VLU 和正常皮膚愈合炎癥期的基因芯片，篩選出 409 個 DEGs，為進一步解釋 DEGs 功能和涉及的通路而進行了 GO 分析、KEGG 富集分析和 GSEA 分析，同時獲得了影響愈合的關鍵基因，最后構建 PPI 網絡篩選出了具有潛在治療意義的核心基因，為探究疾病分子機制、預測早期診斷標志物、改善創面微環境以及促進轉入增殖階段的治療靶點提供研究方向。
上調的 DEGs 主要涉及皮膚發育、表皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化、角質化等生物學過程。研究[22]表明，ECM-受體相互作用通路控制 ECM 的細胞活動，例如黏附、遷移、分化、增殖、凋亡等，該通路過度表達會導致組織纖維化。本研究發現，上調的 DEGs 主要涉及 ECM-受體相互作用通路，該通路的關鍵基因是 COL1A1、COL1A2 和 COL6A6，提示 ECM-受體相互作用通路可能通過干預 COL1A1、COL1A2 及 COL6A6 的表達，使 VLU 出現高度纖維化和過量的膠原蛋白沉積，從而影響愈合。
下調的 DEGs 主要涉及對趨化因子的反應、白細胞遷移、白細胞趨化性、中性粒細胞遷移、中性粒細胞趨化性等生物學過程，提示白細胞遷移及趨化能力下降影響 VLU 愈合。炎細胞浸潤被認為是 VLU 難以愈合的關鍵因素，而中性粒細胞在建立新的血管再生過程必不可少，中性粒細胞數量減少，會影響膠原蛋白沉積并導致血運重建延遲。此外，巨噬細胞轉運鐵離子效率降低使得 VLU 發生的風險增加[23]。巨噬細胞在炎癥條件下吞噬紅細胞，增加鐵攝取、抑制鐵輸出，并能消滅細菌、控制感染，但過度吞噬紅細胞造成鐵蛋白沉積，最終導致鐵超載，而 M2 型巨噬細胞能夠釋放游離鐵、分泌 IL-10，抑制慢性炎癥，促進再上皮化和肉芽組織的形成，參與組織修復[21, 24-27]。
下調的 DEGs 主要富集于 NF-κB 信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll 樣受體（Toll-likereceptors，TLR）信號通路、金黃色葡萄球菌感染、白細胞跨內皮遷移等通路。NF-κB 信號通路在組織修復中發揮重要作用，能夠刺激巨噬細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），進而作用于血管內皮細胞、促進血管新生、加速創面愈合[28]。NOD 樣受體信號通路通過 NOD 樣受體蛋白 3 炎癥小體參與皮膚損傷后早期的炎癥階段，對于創面的愈合發揮重要作用[29]。TLR 信號通路通過激活 TLR2 和 TLR4 而促進 IL-1β、TNF 的產生，從而促進傷口修復[30-31]。因此，上述通路的表達下調會影響創面愈合，與本研究的分析結果相符，提示 VLU 難以愈合的分子機制與該通路及其關鍵基因 IL-1β、CXCL8、IL-10、MMP1 和 MMP9 具有密切聯系。IL-1β 啟動中性粒細胞的募集、促進成熟并增加血管的通透性，促進中性粒細胞和單核細胞向受損組織聚集，釋放活性氧和 MMP，清除創面碎片、抑制細菌感染[32]，同時將骨髓間充質干細胞、角質形成細胞吸引到炎癥部位，促進皮膚修復[33-34]。CXCL8 是一種重要的促血管生成的趨化因子[35]，有研究[36]發現，CXCL8 通過增加角質形成細胞增殖、遷移，增強再上皮化，促進創面愈合；而 IL-10 和 CXCL8 能夠吸引中性粒細胞和巨噬細胞進入皮膚感染部位，從而發揮抗感染作用[19, 21]。MMP1 和 MMP9 是 MMPs 成員，MMPs 低表達會使 ECM 不受控制地過量生成，從而導致組織纖維化[37]。MMP1 在傷口愈合過程的高表達能夠誘導成纖維細胞的遷移，促使創面進入增殖階段[38]；MMP9 能夠水解細胞與基質的黏附蛋白，解除角質形成細胞和成纖維細胞遷移的限制，促進 ECM 的形成和重塑[39-40]，激活 VEGF，促進血管生成[41]。此外，相較于正常皮膚的愈合過程，MMP1 和 MMP9 在 VLU 呈低表達，其中 MMP9 主要來自中性粒細胞。研究[42]表明 MMPs 是誘發 VLU 形成的重要因素，而抑制 MMPs 活性會嚴重影響新上皮組織的形成，且不會增加膠原沉積。本研究發現，相較于正常皮膚愈合過程，VLU 的 MMP 組織抑制因子 1（tissue inhibitor 1 of MMP，TIMP1）表達下調（TIMP1∶log2FC=–1.94，MMP1∶log2FC=–3.52，MMP9∶log2FC=–3.37），意味著 MMPs 與其抑制劑平衡失調可能是 VLU 難以愈合的原因之一，與目前的實驗研究結果相符。
本研究還構建了 DEGs 的 PPI 網絡，篩選出 FPR1、FPR2、IL-1β、IL-10 和 CXCL8 為核心基因。FPR 基因簇包含 FPR1 和 FPR2，能啟動中性粒細胞功能表達，包括定向運動、吞噬、胞吐、超氧化物生成等，在中性粒細胞對微生物的防御中起著至關重要的作用[43]。
綜上，本研究通過對 VLU 差異表達基因目標進行篩選，發現 COL1A1、COL1A2、COL6A6、IL-1β、CXCL8、IL-10、MMP1 和 MMP9 及其參與的信號通路可能影響 VLU 愈合，推測其為 VLU 難以愈合的關鍵因子；PPI 網絡核心基因 FPR1、FPR2、IL-1β、IL-10、CXCL8、MMP1 和 MMP9 可作為 VLU 分子治療的潛在靶點。本研究為 VLU 的機制研究提供了新的思路和治療研究靶點，對提高該病治療研究的靶向性具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉國全參與研究的設計、實施、原始文獻收集、數據處理、研究評價、結果解釋、撰寫；王雁南參與了文章的審閱、指導、經費支出；劉天嬌給予了技術支持、撰寫指導。
下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcers，VLU）是血管外科的常見疾病，因下肢靜脈倒流或回流障礙而發病，是臨床上頗為棘手的疾病。VLU 在美國發病率為 1%[1]，在我國發病率為 1.5%[2]。超過 70% 的患者無法用壓力治療使 VLU 完全治愈[3]，47% 的患者愈合時間超過 12 個月[4]，美國每年用于該病的治療費用約 149 億美元。VLU 的反復發作、遷延難愈，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[5]。生物信息學是將分子生物學和計算機信息處理技術相結合的交叉學科，可以為疾病分子機制的研究及潛在治療靶點的預測提供新的思路。本研究運用生物信息學方法分析基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫中 VLU 的 mRNA 表達數據，通過與正常皮膚愈合的炎癥期 mRNA 表達數據進行比較，獲得差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并應用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genesandgenomes， KEGG）富集分析觀察 DEGs 的功能，同時構建了蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，以探究 VLU 的分子機制、預測早期診斷標志物以及治療靶點。
1 資料與方法
1.1 基因芯片獲取
使用 GEO 數據庫（
1.2 數據預處理及分析 DEGs
本研究使用 R 語言軟件（version 3.6.1，http://r-project.org/）的 affy 包[7]分別讀取 GSE84571 和 GSE28914 兩個數據集的原始數據，通過 RMA 算法進行背景校正和數據歸一化處理，然后將 2 組數據取交集，使用 R 語言軟件的 preprocesscore 包再次進行數據歸一化處理，同時消除批間差，樣本間校正效果則用二維主成分分析（principal components analysis，PCA）聚類圖進行展示。然后應用 GPL570 平臺所對應的基因注釋文件對探針矩陣進行注釋。使用 R 語言軟件的 limma 包[8]進行差異表達分析并輸出 DEGs，DEGs 滿足P<0.05 及|log2FC|>2 ［差異倍數（fold change, FC）］，并使用 ggplot2 包[9]繪制火山圖和熱圖，直觀地展示 DEGs 的情況。
1.3 GO 和 KEGG 通路富集分析
使用 R 語言軟件的 ClusterProfiler 包[10]對 DEGs 進行富集分析。采用 GO 分析[11]把 DEGs 富集到細胞成分、分析功能及生物學過程 3 個方面。KEGG[12]是一個包含關于基因組、生物途徑、疾病和化學物質信息的數據庫集合。對 DEGs 進行分析后，以 P<0.01 作為條件再對分析結果進行篩選。
1.4 GSEA 分析
為提高分析結果的準確性，我們還進行了補充富集分析，運用 GSEA 軟件（version 6.3，
1.5 PPI 網絡構建及 hub 基因的選擇
利用 STRING 數據庫（
|
v 為節點，S（v）是包含 v 的最大派系集合，（|C|–1）！是所有|C|–1 的正整數乘積。將分析結果導出后以大于 MCC 最大值為標準篩選核心節點作為差異表達的核心基因。
2 結果
2.1 數據預處理及分析的 DEGs
GSE84571 和 GSE28914 歸一化處理前后的箱型圖對比及 2 組數據合并取交集后數據歸一化處理前后的箱型圖對比見圖 1。二維 PCA 聚類圖及系譜圖（圖 2a、2b）顯示 2 組基因表達有顯著差異但無明顯批間差。數據預處理后，利用 R 語言軟件從中提取了 409 個 DEGs，其中表達上調的基因 173 個、表達下調的基因 236 個，并以熱點圖及火山圖呈現（圖 2c、2d）。
圖1
示 VLU 表達譜芯片（GSE84571）和正常皮膚愈合炎癥期表達譜芯片（GSE28914）歸一化處理前后以及數據取交集后歸一化處理前后的基因表達情況
a、b：歸一化前正常皮膚愈合炎癥期（a）及 VLU（b）表達譜芯片；c：數據取交集歸一化前；d、e：歸一化后正常皮膚愈合炎癥期（d）及 VLU（e）表達譜芯片；f：數據取交集歸一化后
圖2
示 VLU 與正常皮膚愈合炎癥期的二維 PCA 聚類圖和系譜圖以及基因表達的熱點圖及火山圖
a：二維 PCA 聚類圖；b：系譜圖；c：熱點圖；d：火山圖；紅點代表正常皮膚愈合炎癥期，藍點代表 VLU
2.2 功能和通路富集分析
GO 分析結果顯示，上調表達的 DEGs 生物學過程顯著富集在皮膚發育、表皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化和角質化；細胞成分的變化主要在含膠原的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、角質化包膜、膠原三聚體、纖維狀膠原三聚體及帶狀膠原原纖維；分子功能的變化主要富集于 ECM 結構成分、賦予抗張強度的 ECM 結構成分、整聯蛋白結合、膠原結合以及表皮的結構成分。而下調表達的 DEGs 生物學過程顯著富集于對趨化因子的反應、白細胞遷移、白細胞趨化性、中性粒細胞遷移及中性粒細胞趨化性；細胞成分主要富集于三級顆粒、分泌性顆粒膜、三級顆粒膜、富含纖維凝膠蛋白-1 顆粒和特定顆粒；分子功能的變化主要富集于趨化因子受體結合、趨化因子活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合及趨化因子受體結合。生物學過程富集結果見圖 3a、3b。
圖3
示功能和通路富集分析結果以及 STRING 構建的 PPI 網絡
a、b：示 GO 分析結果，顯示上調（a）和下調（b）生物學過程的基因分布情況；c、d：示 KEGG 通路富集分析結果，c 為下調通路，d 為上調通路，圓點的大小表示基因數目的多少；e：示 GSEA 分析結果，下調通路中靠右側的基因為關鍵基因；f：示 STRING 構建的 PPI 網絡及核心基因，藍色代表下調基因，紅色代表上調基因，黃色為核心基因，節點越大代表基因在網絡中度值越大，連線代表存在相互作用
KEGG 通路富集分析結果顯示，上調表達的 DEGs 主要與 ECM-受體相互作用和蛋白質消化吸收通路相關，Ⅰ型膠原 α1 鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1）、Ⅰ型膠原 α2 鏈（collagen type Ⅰ alpha 2 chain，COL1A2）和Ⅵ型膠原 α6 鏈（collagen type Ⅵ alpha 6 chain，COL6A6）為 ECM-受體相互作用通路的關鍵基因，在上述 2 條通路中共同發揮作用；下調表達的 DEGs 富集的通路主要與金黃色葡萄球菌感染、Toll 樣受體信號通路、利什曼病、非洲錐蟲病、瘧疾、細胞因子和細胞因子受體的相互作用、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、核轉錄因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路、白細胞介素（interleukin，IL）-17 信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、軍團菌病、阿米巴病以及類風濕關節炎密切相關，IL-1β、趨化因子 8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和 IL-10 在多條通路發揮關鍵作用。具體見圖 3c 和 3d。
GSEA 分析結果顯示，除上述通路外，富集的通路還包括寡聚化核苷酸結合結構域（nucleotide binding oligonucleotide domain，NOD）樣受體信號通路、造血細胞系和白細胞跨內皮遷移和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號通路，均為下調通路，其中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 1、MMP9、IL-1β 和 CXCL8 為上述通路的關鍵基因（圖 3e）。
2.3 PPI 網絡構建及 hub 基因的選擇
STRING 構建的 PPI 網絡如圖 3f 所示，利用 CytoHubba 插件選擇 MCC 分析網絡中的核心節點，篩選出前 5 位 hub 基因為甲酰肽受體 （formyl peptide receptor，FPR）1、FPR2、IL-1β、IL-10 和 CXCL8，均為下調基因。
3 討論
VLU 因其遷延難愈、反復發作的特點，給患者和社會帶來沉重的經濟負擔。與正常皮膚傷口愈合的止血、炎癥、增殖和重塑 4 個過程不同，VLU 通常不能有序并及時地由炎癥階段進入增殖階段，從而長期處于慢性炎癥狀態[16-17]。組織學結果發現，VLU 的炎細胞浸潤、細菌定植（如金黃色葡萄球菌）、鐵超載、高度纖維化和過量的膠原蛋白是導致創面無法愈合的重要因素[18-20]。有研究[21]表明，通過抑制炎癥、減少氧化應激、清除蛋白碎片、促成纖維細胞遷移、消除微生物感染等手段，可以加速創面愈合。本研究通過 GEO 數據庫獲取 VLU 和正常皮膚愈合炎癥期的基因芯片，篩選出 409 個 DEGs，為進一步解釋 DEGs 功能和涉及的通路而進行了 GO 分析、KEGG 富集分析和 GSEA 分析，同時獲得了影響愈合的關鍵基因，最后構建 PPI 網絡篩選出了具有潛在治療意義的核心基因，為探究疾病分子機制、預測早期診斷標志物、改善創面微環境以及促進轉入增殖階段的治療靶點提供研究方向。
上調的 DEGs 主要涉及皮膚發育、表皮細胞分化、角質形成細胞分化、角化、角質化等生物學過程。研究[22]表明，ECM-受體相互作用通路控制 ECM 的細胞活動，例如黏附、遷移、分化、增殖、凋亡等，該通路過度表達會導致組織纖維化。本研究發現，上調的 DEGs 主要涉及 ECM-受體相互作用通路，該通路的關鍵基因是 COL1A1、COL1A2 和 COL6A6，提示 ECM-受體相互作用通路可能通過干預 COL1A1、COL1A2 及 COL6A6 的表達，使 VLU 出現高度纖維化和過量的膠原蛋白沉積，從而影響愈合。
下調的 DEGs 主要涉及對趨化因子的反應、白細胞遷移、白細胞趨化性、中性粒細胞遷移、中性粒細胞趨化性等生物學過程，提示白細胞遷移及趨化能力下降影響 VLU 愈合。炎細胞浸潤被認為是 VLU 難以愈合的關鍵因素，而中性粒細胞在建立新的血管再生過程必不可少，中性粒細胞數量減少，會影響膠原蛋白沉積并導致血運重建延遲。此外，巨噬細胞轉運鐵離子效率降低使得 VLU 發生的風險增加[23]。巨噬細胞在炎癥條件下吞噬紅細胞，增加鐵攝取、抑制鐵輸出，并能消滅細菌、控制感染，但過度吞噬紅細胞造成鐵蛋白沉積，最終導致鐵超載，而 M2 型巨噬細胞能夠釋放游離鐵、分泌 IL-10，抑制慢性炎癥，促進再上皮化和肉芽組織的形成，參與組織修復[21, 24-27]。
下調的 DEGs 主要富集于 NF-κB 信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll 樣受體（Toll-likereceptors，TLR）信號通路、金黃色葡萄球菌感染、白細胞跨內皮遷移等通路。NF-κB 信號通路在組織修復中發揮重要作用，能夠刺激巨噬細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），進而作用于血管內皮細胞、促進血管新生、加速創面愈合[28]。NOD 樣受體信號通路通過 NOD 樣受體蛋白 3 炎癥小體參與皮膚損傷后早期的炎癥階段，對于創面的愈合發揮重要作用[29]。TLR 信號通路通過激活 TLR2 和 TLR4 而促進 IL-1β、TNF 的產生，從而促進傷口修復[30-31]。因此，上述通路的表達下調會影響創面愈合，與本研究的分析結果相符，提示 VLU 難以愈合的分子機制與該通路及其關鍵基因 IL-1β、CXCL8、IL-10、MMP1 和 MMP9 具有密切聯系。IL-1β 啟動中性粒細胞的募集、促進成熟并增加血管的通透性，促進中性粒細胞和單核細胞向受損組織聚集，釋放活性氧和 MMP，清除創面碎片、抑制細菌感染[32]，同時將骨髓間充質干細胞、角質形成細胞吸引到炎癥部位，促進皮膚修復[33-34]。CXCL8 是一種重要的促血管生成的趨化因子[35]，有研究[36]發現，CXCL8 通過增加角質形成細胞增殖、遷移，增強再上皮化，促進創面愈合；而 IL-10 和 CXCL8 能夠吸引中性粒細胞和巨噬細胞進入皮膚感染部位，從而發揮抗感染作用[19, 21]。MMP1 和 MMP9 是 MMPs 成員，MMPs 低表達會使 ECM 不受控制地過量生成，從而導致組織纖維化[37]。MMP1 在傷口愈合過程的高表達能夠誘導成纖維細胞的遷移，促使創面進入增殖階段[38]；MMP9 能夠水解細胞與基質的黏附蛋白，解除角質形成細胞和成纖維細胞遷移的限制，促進 ECM 的形成和重塑[39-40]，激活 VEGF，促進血管生成[41]。此外，相較于正常皮膚的愈合過程，MMP1 和 MMP9 在 VLU 呈低表達，其中 MMP9 主要來自中性粒細胞。研究[42]表明 MMPs 是誘發 VLU 形成的重要因素，而抑制 MMPs 活性會嚴重影響新上皮組織的形成，且不會增加膠原沉積。本研究發現，相較于正常皮膚愈合過程，VLU 的 MMP 組織抑制因子 1（tissue inhibitor 1 of MMP，TIMP1）表達下調（TIMP1∶log2FC=–1.94，MMP1∶log2FC=–3.52，MMP9∶log2FC=–3.37），意味著 MMPs 與其抑制劑平衡失調可能是 VLU 難以愈合的原因之一，與目前的實驗研究結果相符。
本研究還構建了 DEGs 的 PPI 網絡，篩選出 FPR1、FPR2、IL-1β、IL-10 和 CXCL8 為核心基因。FPR 基因簇包含 FPR1 和 FPR2，能啟動中性粒細胞功能表達，包括定向運動、吞噬、胞吐、超氧化物生成等，在中性粒細胞對微生物的防御中起著至關重要的作用[43]。
綜上，本研究通過對 VLU 差異表達基因目標進行篩選，發現 COL1A1、COL1A2、COL6A6、IL-1β、CXCL8、IL-10、MMP1 和 MMP9 及其參與的信號通路可能影響 VLU 愈合，推測其為 VLU 難以愈合的關鍵因子；PPI 網絡核心基因 FPR1、FPR2、IL-1β、IL-10、CXCL8、MMP1 和 MMP9 可作為 VLU 分子治療的潛在靶點。本研究為 VLU 的機制研究提供了新的思路和治療研究靶點，對提高該病治療研究的靶向性具有重要意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉國全參與研究的設計、實施、原始文獻收集、數據處理、研究評價、結果解釋、撰寫；王雁南參與了文章的審閱、指導、經費支出；劉天嬌給予了技術支持、撰寫指導。
