引用本文： 聶靜云, 康富貴, 張琛涵, 柴琛. 硫化氫調節自噬保護膿毒癥器官損傷的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(2): 260-264. doi: 10.7507/1007-9424.202005059 復制
膿毒癥是因宿主對感染的反應失調而導致的器官功能障礙，是臨床危重病患者的主要死亡原因之一[1]。2020 年我國 ICU 膿毒癥患者的流行病學研究[2]顯示，膿毒癥占 ICU 患者的 20%，其 90 d 病死率高達 35.5%。過度炎癥、氧化應激、線粒體損傷、自噬損傷、微循環障礙、凝血異常、免疫功能紊亂等機制和核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多重信號通路介導了膿毒癥病理過程[3]。近年來，隨著拯救膿毒癥運動指南不斷更新[4]，抗感染、臟器保護、免疫調理等措施有效降低了膿毒癥病亡率，但因缺乏針對性的治療措施，其發病率和病死率仍然較高，因此，尋找有效的治療手段保護膿毒癥器官損傷至關重要。自噬通過清除受損細胞器并維持線粒體功能，進而抑制炎癥、氧化應激及凋亡，調節免疫，維持細胞穩態，減輕膿毒癥器官損傷，可成為膿毒癥的有效治療靶點[5-6]。硫化氫（H2S）是近年來研究發現的新型氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化應激、調節自噬、抗凋亡及信號通路調節作用，通過調節多重信號通路來調控自噬以減輕膿毒癥多器官損傷，已成為膿毒癥治療研究的新靶向[7-8]。筆者現就膿毒癥時 H2S 通過調控自噬來保護多器官損傷的作用機制進行簡要闡述。
1 自噬與膿毒癥的相關性及其器官保護作用
1.1 自噬與膿毒癥的相關性
膿毒癥的本質是機體對感染的免疫失衡，而自噬在炎癥和免疫過程中起著重要的調節作用。自噬是細胞物質被運送到溶酶體進行降解和循環的基本過程，可維持細胞穩態及細胞自我更新，若自噬異常則可能導致許多不同的病理生理過程[9]。自噬調節炎癥的主要可能機制[10]：調節炎癥相關轉錄因子如 NF-κB、紅細胞衍生核因子 2 樣蛋白 2的表達，調節炎癥復合物的活化，調節炎癥細胞因子的產生和降解，促進死亡細胞的清除，調節吞噬作用。
在膿毒癥的亞急性期，細胞凋亡（Ⅰ型程序性細胞死亡）和隨后的自噬（Ⅱ型程序性細胞死亡）是膿毒癥發展進程中的關鍵事件[11]。諸多證據[5-6]表明，自噬在膿毒癥的發生及發展中起保護作用并通過這些機制實現，如直接清除病原體，中和微生物毒素，調節細胞因子釋放，保護線粒體完整性，減少活性氧（ROS）過量產生而抑制氧化應激，減少細胞凋亡，促進抗原呈遞而調節免疫。
1.2 自噬在膿毒癥中的器官保護作用
在膿毒癥早期，自噬即被激活，負性調節炎癥反應，減輕各種組織和器官的損傷；然而在膿毒癥晚期，自噬活性受抑，導致免疫細胞的凋亡、免疫麻痹、氧化應激、線粒體功能障礙，最終導致多器官功能衰竭[5, 12]。
目前最常用的膿毒癥動物模型是盲腸結扎穿刺（CLP）模型和外源性毒素脂多糖攻擊模型，可較好地模擬膿毒癥的臨床病理過程。目前在大量基礎研究中采用膿毒癥模型證實了通過調控自噬可恢復自噬通量，抑制炎癥、氧化應激及凋亡，從而保護多器官損傷，如 Li 等[13]在 CLP 誘導的小鼠膿毒癥腦損傷中發現，自噬特異性蛋白輕鏈 3（LC3）-Ⅱ和p62 表達增加，LAMP1和Rab7 表達減少，未降解的自噬泡異常積累，自噬體-溶酶體融合過程受阻，自噬停滯，進而小膠質細胞活化、炎癥細胞因子過度表達、海馬神經元大量凋亡，從而導致膿毒癥相關性腦病，通過給予人參皂甙 Rg1 恢復自噬通量，可有效抑制小膠質細胞活化、海馬神經元凋亡，從而改善了膿毒癥腦損傷及認知障礙；Zhao 等[14]在內毒素脂多糖誘導的大鼠膿毒癥腎損傷中發現，低劑量脂多糖時自噬作用呈劑量依賴性增強，而高劑量脂多糖時即嚴重膿毒癥時自噬受抑，激活的腎小管上皮細胞自噬通過抑制炎癥、氧化應激及細胞凋亡，清除受損線粒體，從而改善腎功能及腎組織損傷，而通過給予自噬抑制劑 3-甲基腺嘌呤抑制自噬后則加重了脂多糖誘導的膿毒癥腎損傷；Yuan 等[15]通過 CLP 構建大鼠膿毒癥模型及體外用脂多糖誘導的 H9c2 細胞模擬膿毒癥心肌細胞損傷，發現膿毒癥時心肌細胞大量凋亡、促炎因子過度表達，而天然小分子化合物 Polydatin 預處理后通過促進長壽蛋白 Sirtuin 6（SIRT6）介導的自噬作用，抑制心肌細胞過度炎癥及凋亡，從而減輕膿毒癥心肌細胞損傷、提高膿毒癥大鼠存活率；Hu 等[16]通過燒傷誘導大鼠膿毒癥腸損傷模型，將燒傷誘導的膿毒癥腸損傷模型大鼠的血清與 IEC-6 細胞進行共培養實驗，發現燒傷后腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性降低而自噬不足，導致內質網應激、谷氨酰胺轉運受抑進而腸屏障損傷，通過給予腸三葉因子激活 AMPK 后能增強自噬，降低內質網應激，改善腸道谷氨酰胺轉運，保護腸屏障功能，減輕膿毒癥腸損傷。
除了基礎研究，近年來諸多臨床研究同樣證實了自噬在膿毒癥中的器官保護作用，可有效提高膿毒癥患者的生存率，如一項來自韓國的臨床前瞻性研究[17]通過觀察社區獲得性肺炎所致膿毒癥患者入院后 28 d 存活情況、分離其靜脈血中的中性粒細胞并利用電鏡及免疫印跡法評估和對比存活與非存活膿毒癥患者的自噬性發現，與存活膿毒癥患者相比，非存活膿毒癥患者無明顯自噬空泡形成、自噬特異性蛋白 LC3 總量及 LC3-Ⅱ轉化率降低、p62 降解受阻、游離 Atg12 和 ATG5-Atg12 復合物水平無明顯變化，自噬通量受損，同時 ROS 大量產生，證實了調節中性粒細胞自噬對提高膿毒癥患者生存率至關重要；Shao 等[18]通過對 80 例膿毒癥患者和 80 例健康對照組外周血單核細胞中參與自噬啟動和調控相關基因 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA 表達分析發現，膿毒癥患者 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA表達水平明顯低于健康對照組且隨著膿毒癥加重而降低，與膿毒癥 28 d 存活患者相比，非存活膿毒癥患者 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA 表達水平顯著降低，提示 ATG5 和 ATG16L1 在膿毒癥的進展和轉歸中起重要作用。
以上研究結果提示，通過改善膿毒癥時受損的自噬可有效減輕器官損傷而降低其病死率。
2 膿毒癥時 H2S 調節自噬的作用機制
大量體外細胞實驗及在體動物實驗均證實，低濃度 H2S 具有抗炎、抗氧化應激、調節自噬抗凋亡及信號通路調節作用，通過調節多重信號通路來調控自噬以減輕膿毒癥多器官損傷、改善膿毒癥病情和預后，已成為膿毒癥治療研究的新靶向[7-8]。下面綜述幾個主要的信號通路。
2.1 核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）信號通路
Nrf2 是維持細胞氧化還原穩態的重要轉錄因子。在生理狀態時，Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）識別并結合 Nrf2 的特定序列，使 Nrf2 泛素化而被蛋白酶體降解；當氧化應激時，Keap1 失去與 Nrf2 的結合能力，使 Nrf2 移位至細胞核并與抗氧化反應元件結合來誘導下游抗氧化基因（血紅素氧合酶-1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等）的表達，從而發揮細胞保護作用[19]。Nrf2/Keap1 通路通過抑制氧化應激和炎癥、調節自噬來保護膿毒癥器官功能障礙，一方面，Keap1 通過泛素化降解 NF-κB 激酶抑制劑抑制 NF-?B 活性而阻止促炎因子及 ROS 大量釋放，從而抗氧化及炎癥級聯反應；另一方面，Nrf2 與促炎因子 IL-6、IL-1β 及黏附因子（細胞間黏附分子 1、血管細胞黏附分子 1）的啟動子結合來抑制其轉錄激活[20]。
自噬在清除受損細胞器、抑制炎癥及氧化應激、保護器官損傷方面至關重要。最近研究[21]表明，自噬與 Nrf2/Keap1 通路抗氧化途徑密切相關。p62 作為自噬底物，不僅結合 LC3，還結合泛素蛋白將其運至自噬體經溶酶體清除，其積累視為自噬通量受損。p62 在 Nrf2/Keap1 和自噬之間起橋梁作用。p62 啟動子中包含抗氧化反應元件序列，氧化應激時 Nrf2 與其結合誘導 p62 表達，進而介導 Keap1 與泛素聚集體和自噬小體結合，刺激自噬，加速泛素聚集體清除，同時 p62 與 Keap1 的結合又使 Nrf2 核移位而激活，形成抗氧化正反饋回路。提示 p62 作為氧化應激下自噬與 Keap1/Nrf2 信號通路之間的關鍵樞紐，通過自噬與抗氧化作用發揮器官保護作用[22]。
H2S 通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路誘導自噬而發揮抗炎、抗氧化作用來保護器官損傷。蛋白質硫巰基化是 H2S 介導的翻譯后修飾之一，H2S 使 Keap1 的 Cys151 硫巰基化，誘導 Nrf2 與 Keap1 解離而核轉位，激活 Nrf2。Zhao 等[23]通過構建鏈脲佐菌素和高脂飲食誘導 LDLr－/－小鼠致肝損傷模型發現，H2S 供體 GYY4137 通過介導 Keap1 的 Cys151 硫巰基化誘導 Nrf2 與 Keap1 解離、核移位及下游抗氧化蛋白表達，抑制氧化應激，減輕脂質沉積及肝細胞損傷，改善肝功能，而敲除 Nrf2 基因可阻斷 GYY4137 介導的抗炎抗氧化保肝作用，并進一步通過體外高糖+氧化低密度脂蛋白與原代小鼠肝細胞共培養實驗證實了上述觀點。同樣地，Wu 等[24]通過構建 2 型糖尿病 db/db 小鼠模型及體外高糖和棕櫚酸酯培養 H9C2 細胞的 2 型糖尿病心肌細胞模型，證實了外源性 H2S（NaHS）促進兩個 Keap1 分子間二硫鍵形成，誘導自噬清除 ROS，抑制氧化應激和心肌細胞凋亡，阻止糖尿病性心肌病發生及發展。以上研究結果提示，Nrf2/Keap1 信號通路通過抗炎、抗氧化應激和調節自噬來參與膿毒癥器官保護作用，H2S 通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路保護膿毒癥器官損傷。
2.2 MAPK 信號通路
MAPK 介導了膿毒癥炎癥反應、氧化應激、免疫紊亂、自噬抑制和凋亡、微循環障礙等病理過程，使膿毒癥多器官功能損傷，其包含細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun-N 末端激酶（JNK）和 p38 三個亞家族，其中 ERK 通常被生長因子激活，在細胞增殖調控中起關鍵作用；p38 和 JNK 通常被應激激活，在炎癥、氧化應激及凋亡中起核心作用[25]。膿毒癥時，MAPK 作為 Toll 樣受體（TLR）下游靶點而被激活，調節促炎介質（TNF-α、HMGB1、ROS、iNOS、COX-2等）和促炎信號 NF-κB 的轉錄，從而引起過度炎癥反應[26]，使腸上皮細胞凋亡、緊密連接解離、腸屏障功能受損[25]。此外，ROS 觸發 ASK1-p38MAPK 級聯使組織因子升高、凝血異常導致微循環障礙[27]。
自噬在炎癥、免疫和維持腸道穩態中至關重要。MAPK 通過多種機制抑制自噬，加重膿毒癥炎癥和氧化應激。一方面，脂多糖通過上游 TLR4-MyD88-MAPK 通路激活負調控自噬的雷帕霉素（mTOR）[28]；另一方面，激活的 MAPK 和 mTOR 通過磷酸化自噬起始復合物中 ULK1 的 Ser757 抑制其活性并破壞與 ATG13 的相互作用，降低自噬通量[29]。Zhou 等[28]通過檢測結腸炎患者標本，以及構建脂多糖體外誘導人結腸腺癌細胞 Caco-2 和HT-29、脂多糖誘導 Balb/c 小鼠結腸炎模型均證實脂多糖使 MAPKs 活化而激活 mTOR，阻斷自噬通量，對 mTOR 基因敲除或藥理抑制可恢復自噬、減輕炎癥和氧化應激，而用 siRNAs 阻斷 ATG5 則加重損傷。此外，已有研究[30]證實 p38MAPK 抑制劑吡啶咪唑類化合物激活自噬并誘導抗血紅素氧合酶-1 發揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用。
H2S 通過抑制 MAPK 通路發揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用以減輕器官損傷。Zhang 等[31]通過體外脂多糖誘導大鼠骨骼肌細胞 L6 的膿毒癥膈肌損傷模型發現，脂多糖提高 MAPKs 磷酸化、ROS、促炎因子及凋亡水平，降低 H2S 及其合成酶（CSE、CBS 和 3-MST）表達，H2S 供體 NaHS 通過抑制 ROS/MAPK 途徑減輕炎癥、氧化應激及凋亡，改善膈肌功能障礙。Han 等[32]通過對大鼠進行大腦中動脈栓塞構建腦缺血再灌注損傷模型，證實了腦缺血再灌注損傷后 MAPKs（p38MAPK、ERK 1/2 和 JNK）磷酸化水平顯著升高；H2S 供體 GYY4137 通過抑制 MAPKs 磷酸化進而顯著降低促凋亡蛋白 Bax 水平，提高抗凋亡蛋白 Bcl-2 水平，抑制 caspase-3 活性，抑制神經元凋亡，減輕腦水腫及減小腦梗塞面積，促進神經功能恢復，發揮神經保護作用。綜上所述，H2S 通過抑制 MAPK 通路激活自噬，抑制炎癥、氧化應激及細胞凋亡，保護膿毒癥器官損傷。
2.3 AMPK 信號通路
AMPK 是維持機體能量穩態的重要調節因子，由催化亞基 α 和調節亞基 β 和 γ 組成，其 α 亞基 Thr172 磷酸化為主要激活機制。AMPK 磷酸化通過上游激酶（如 LKB1、CaMKKβ、TAK1）和磷酸酶（如 PP2A、PP2C）之間的平衡來調節，當能量充足時，磷酸酶結合 α 亞基 Thr172 抑制 AMPK 磷酸化；當能量耗竭時，大量 AMP/ADP 與 γ 亞基結合阻止磷酸酶進入 α 亞基使 AMPK 磷酸化激活，其中 AMP/ADP 與 γ 亞基結合使 LKB1 活化而激活 AMPK；此外，當細胞 Ca2+水平升高時，通過磷酸化 CaMKKβ 而激活 AMPK 以維持細胞內穩態[33]。
有研究[34]表明，在炎癥、衰老等病理條件下 AMPK 被抑制，導致自噬損傷、線粒體功能障礙及細胞能量衰竭，因而激活 AMPK 已成為治療膿毒癥的有效手段。AMPK 不僅使過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子-1α（PGC-1α）磷酸化而誘導線粒體生物發生，還通過增加 NAD+/NADH 激活 SIRT1，進而去乙酰化激活 PGC-1α 而調控線粒體功能，從而抑制氧化應激[35]；AMPK 還通過多種機制發揮抗氧化防御作用如激活 Nrf2 而上調抗氧化基因（血紅素氧合酶-1、超氧化物歧化酶）表達[36]來誘導下游轉錄因子 FOXO 核移位進而激活下游抗氧化酶基因表達等[37]。由于腸道既是膿毒癥極易受累的器官，又是膿毒癥病程進展的始動器官，因此，改善腸道屏障功能是治療膿毒癥的關鍵。AMPK 通過增強腸上皮分化的關鍵轉錄因子 CDX2 表達、磷酸化緊密連接蛋白而促進頂端連接組裝和穩定、抑制 Wnt/β-catenin 信號，改善腸屏障功能[33]。
近年來研究證實，通過激活 AMPK 能誘導自噬而保護膿毒癥器官損傷。AMPK 不僅通過直接磷酸化 ULK1 或抑制 mTORC1 間接激活 ULK1 進而增加自噬起始復合物 PI3KC3/Vps34 活性而直接促進自噬，還通過激活下游轉錄因子 FOXO3 上調 BNIP3、ATG4、LC3、ATG12 等自噬相關基因表達而間接促進自噬；此外，AMPK 還通過轉錄機制激活自噬的主要轉錄調節因子 TFEB，激活自噬-溶酶體途徑，誘導自噬，降解受損線粒體進而抗炎、抗氧化[38]。
H2S 可激活 AMPK 進而誘導自噬、抗炎、抗氧化，從而保護器官損傷[39]。具體地，H2S 不僅通過激活 AMPK 上游激酶（如 LKB1、CaMKKβ），還通過磷酸酶的蛋白質硫巰基化以抑制其活性，使 AMPK 激活。Yang 等[40]通過鏈脲佐菌素誘導大鼠 1 型糖尿病模型和體外高糖誘導 H9C2 細胞實驗發現，H2S 激活 AMPK/mTOR 通路而誘導自噬（Beclin-1、LCⅡ表達增加，p62 表達降低），通過清除受損線粒體、抑制 ROS 產生、抗心肌細胞凋亡，改善線粒體功能，提高心肌細胞存活率，減輕高糖誘導的心肌細胞損傷；Wang 等[41]通過油酸刺激人肝細胞 L02 建立炎癥模型，證明了油酸誘導 L02 細胞的核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族 3（NLRP3）炎性小體激活，導致過度炎癥反應，從而抑制自噬（降低 LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin-1 蛋白表達，增加 p62 蛋白表達，減少自噬小體和自溶酶體形成），然而給予 H2S 供體 NaHS 后，可通過 AMPK/mTOR 途徑促進 L02 細胞自噬，抑制油酸誘導的 NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應，減輕細胞損傷。以上研究結果提示，H2S 通過激活 AMPK 誘導自噬、抗炎、抗氧化及抗凋亡，保護線粒體功能及維持細胞內穩態，從而保護膿毒癥器官損傷。
3 小結與展望
膿毒癥時，炎癥、氧化應激、線粒體損傷、微循環障礙、免疫紊亂、自噬損傷、凋亡等病理機制使全身各種組織和器官損傷，最終導致多器官功能衰竭，因此，尋找有效的治療手段保護膿毒癥器官損傷至關重要。通過調控自噬可抑制炎癥、氧化應激及凋亡，調節免疫，維持細胞穩態，減輕膿毒癥器官損傷，可成為膿毒癥的有效治療靶點。在膿毒癥過度炎癥反應階段，自噬過度或不足均會致細胞自噬死亡，若過早誘導自噬可加重機體炎癥反應及免疫損傷，因此，調控自噬的時機及程度將成為未來研究的方向。H2S 可通過多種信號通路調控機體自噬、炎癥、氧化應激等多種病理過程，已證實多種外源性 H2S 供體通過調控自噬、抑制炎癥及氧化應激而減輕膿毒癥器官損傷，然而也有研究表明，H2S 在膿毒癥中介導的促炎作用與所研究的膿毒癥模型中膿毒癥嚴重程度不同及所用 H2S 供體不同有關，如 H2S 供體 Na2S、NaHS 等可快速大量釋放 H2S 造成細胞毒性，而新型緩釋供體如 GYY4137 可長時間緩慢釋放 H2S 模擬內源性 H2S 的生理作用，可成為未來的有效治療手段。因此，尚需大量基礎實驗及臨床前研究以掌握應用于臨床的安全、適宜的 H2S 供體藥物及其劑量，以及調控自噬的時機及度將成為膿毒癥治療的新方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：聶靜云、康富貴、張琛涵共同收集、整理文獻資料，同時聶靜云起草論文初稿，康富貴、張琛涵核對、審校稿件；柴琛老師指導文章定稿的修改并把關。
膿毒癥是因宿主對感染的反應失調而導致的器官功能障礙，是臨床危重病患者的主要死亡原因之一[1]。2020 年我國 ICU 膿毒癥患者的流行病學研究[2]顯示，膿毒癥占 ICU 患者的 20%，其 90 d 病死率高達 35.5%。過度炎癥、氧化應激、線粒體損傷、自噬損傷、微循環障礙、凝血異常、免疫功能紊亂等機制和核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多重信號通路介導了膿毒癥病理過程[3]。近年來，隨著拯救膿毒癥運動指南不斷更新[4]，抗感染、臟器保護、免疫調理等措施有效降低了膿毒癥病亡率，但因缺乏針對性的治療措施，其發病率和病死率仍然較高，因此，尋找有效的治療手段保護膿毒癥器官損傷至關重要。自噬通過清除受損細胞器并維持線粒體功能，進而抑制炎癥、氧化應激及凋亡，調節免疫，維持細胞穩態，減輕膿毒癥器官損傷，可成為膿毒癥的有效治療靶點[5-6]。硫化氫（H2S）是近年來研究發現的新型氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化應激、調節自噬、抗凋亡及信號通路調節作用，通過調節多重信號通路來調控自噬以減輕膿毒癥多器官損傷，已成為膿毒癥治療研究的新靶向[7-8]。筆者現就膿毒癥時 H2S 通過調控自噬來保護多器官損傷的作用機制進行簡要闡述。
1 自噬與膿毒癥的相關性及其器官保護作用
1.1 自噬與膿毒癥的相關性
膿毒癥的本質是機體對感染的免疫失衡，而自噬在炎癥和免疫過程中起著重要的調節作用。自噬是細胞物質被運送到溶酶體進行降解和循環的基本過程，可維持細胞穩態及細胞自我更新，若自噬異常則可能導致許多不同的病理生理過程[9]。自噬調節炎癥的主要可能機制[10]：調節炎癥相關轉錄因子如 NF-κB、紅細胞衍生核因子 2 樣蛋白 2的表達，調節炎癥復合物的活化，調節炎癥細胞因子的產生和降解，促進死亡細胞的清除，調節吞噬作用。
在膿毒癥的亞急性期，細胞凋亡（Ⅰ型程序性細胞死亡）和隨后的自噬（Ⅱ型程序性細胞死亡）是膿毒癥發展進程中的關鍵事件[11]。諸多證據[5-6]表明，自噬在膿毒癥的發生及發展中起保護作用并通過這些機制實現，如直接清除病原體，中和微生物毒素，調節細胞因子釋放，保護線粒體完整性，減少活性氧（ROS）過量產生而抑制氧化應激，減少細胞凋亡，促進抗原呈遞而調節免疫。
1.2 自噬在膿毒癥中的器官保護作用
在膿毒癥早期，自噬即被激活，負性調節炎癥反應，減輕各種組織和器官的損傷；然而在膿毒癥晚期，自噬活性受抑，導致免疫細胞的凋亡、免疫麻痹、氧化應激、線粒體功能障礙，最終導致多器官功能衰竭[5, 12]。
目前最常用的膿毒癥動物模型是盲腸結扎穿刺（CLP）模型和外源性毒素脂多糖攻擊模型，可較好地模擬膿毒癥的臨床病理過程。目前在大量基礎研究中采用膿毒癥模型證實了通過調控自噬可恢復自噬通量，抑制炎癥、氧化應激及凋亡，從而保護多器官損傷，如 Li 等[13]在 CLP 誘導的小鼠膿毒癥腦損傷中發現，自噬特異性蛋白輕鏈 3（LC3）-Ⅱ和p62 表達增加，LAMP1和Rab7 表達減少，未降解的自噬泡異常積累，自噬體-溶酶體融合過程受阻，自噬停滯，進而小膠質細胞活化、炎癥細胞因子過度表達、海馬神經元大量凋亡，從而導致膿毒癥相關性腦病，通過給予人參皂甙 Rg1 恢復自噬通量，可有效抑制小膠質細胞活化、海馬神經元凋亡，從而改善了膿毒癥腦損傷及認知障礙；Zhao 等[14]在內毒素脂多糖誘導的大鼠膿毒癥腎損傷中發現，低劑量脂多糖時自噬作用呈劑量依賴性增強，而高劑量脂多糖時即嚴重膿毒癥時自噬受抑，激活的腎小管上皮細胞自噬通過抑制炎癥、氧化應激及細胞凋亡，清除受損線粒體，從而改善腎功能及腎組織損傷，而通過給予自噬抑制劑 3-甲基腺嘌呤抑制自噬后則加重了脂多糖誘導的膿毒癥腎損傷；Yuan 等[15]通過 CLP 構建大鼠膿毒癥模型及體外用脂多糖誘導的 H9c2 細胞模擬膿毒癥心肌細胞損傷，發現膿毒癥時心肌細胞大量凋亡、促炎因子過度表達，而天然小分子化合物 Polydatin 預處理后通過促進長壽蛋白 Sirtuin 6（SIRT6）介導的自噬作用，抑制心肌細胞過度炎癥及凋亡，從而減輕膿毒癥心肌細胞損傷、提高膿毒癥大鼠存活率；Hu 等[16]通過燒傷誘導大鼠膿毒癥腸損傷模型，將燒傷誘導的膿毒癥腸損傷模型大鼠的血清與 IEC-6 細胞進行共培養實驗，發現燒傷后腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性降低而自噬不足，導致內質網應激、谷氨酰胺轉運受抑進而腸屏障損傷，通過給予腸三葉因子激活 AMPK 后能增強自噬，降低內質網應激，改善腸道谷氨酰胺轉運，保護腸屏障功能，減輕膿毒癥腸損傷。
除了基礎研究，近年來諸多臨床研究同樣證實了自噬在膿毒癥中的器官保護作用，可有效提高膿毒癥患者的生存率，如一項來自韓國的臨床前瞻性研究[17]通過觀察社區獲得性肺炎所致膿毒癥患者入院后 28 d 存活情況、分離其靜脈血中的中性粒細胞并利用電鏡及免疫印跡法評估和對比存活與非存活膿毒癥患者的自噬性發現，與存活膿毒癥患者相比，非存活膿毒癥患者無明顯自噬空泡形成、自噬特異性蛋白 LC3 總量及 LC3-Ⅱ轉化率降低、p62 降解受阻、游離 Atg12 和 ATG5-Atg12 復合物水平無明顯變化，自噬通量受損，同時 ROS 大量產生，證實了調節中性粒細胞自噬對提高膿毒癥患者生存率至關重要；Shao 等[18]通過對 80 例膿毒癥患者和 80 例健康對照組外周血單核細胞中參與自噬啟動和調控相關基因 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA 表達分析發現，膿毒癥患者 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA表達水平明顯低于健康對照組且隨著膿毒癥加重而降低，與膿毒癥 28 d 存活患者相比，非存活膿毒癥患者 ATG5 和 ATG16L1 的 mRNA 表達水平顯著降低，提示 ATG5 和 ATG16L1 在膿毒癥的進展和轉歸中起重要作用。
以上研究結果提示，通過改善膿毒癥時受損的自噬可有效減輕器官損傷而降低其病死率。
2 膿毒癥時 H2S 調節自噬的作用機制
大量體外細胞實驗及在體動物實驗均證實，低濃度 H2S 具有抗炎、抗氧化應激、調節自噬抗凋亡及信號通路調節作用，通過調節多重信號通路來調控自噬以減輕膿毒癥多器官損傷、改善膿毒癥病情和預后，已成為膿毒癥治療研究的新靶向[7-8]。下面綜述幾個主要的信號通路。
2.1 核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）信號通路
Nrf2 是維持細胞氧化還原穩態的重要轉錄因子。在生理狀態時，Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）識別并結合 Nrf2 的特定序列，使 Nrf2 泛素化而被蛋白酶體降解；當氧化應激時，Keap1 失去與 Nrf2 的結合能力，使 Nrf2 移位至細胞核并與抗氧化反應元件結合來誘導下游抗氧化基因（血紅素氧合酶-1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等）的表達，從而發揮細胞保護作用[19]。Nrf2/Keap1 通路通過抑制氧化應激和炎癥、調節自噬來保護膿毒癥器官功能障礙，一方面，Keap1 通過泛素化降解 NF-κB 激酶抑制劑抑制 NF-?B 活性而阻止促炎因子及 ROS 大量釋放，從而抗氧化及炎癥級聯反應；另一方面，Nrf2 與促炎因子 IL-6、IL-1β 及黏附因子（細胞間黏附分子 1、血管細胞黏附分子 1）的啟動子結合來抑制其轉錄激活[20]。
自噬在清除受損細胞器、抑制炎癥及氧化應激、保護器官損傷方面至關重要。最近研究[21]表明，自噬與 Nrf2/Keap1 通路抗氧化途徑密切相關。p62 作為自噬底物，不僅結合 LC3，還結合泛素蛋白將其運至自噬體經溶酶體清除，其積累視為自噬通量受損。p62 在 Nrf2/Keap1 和自噬之間起橋梁作用。p62 啟動子中包含抗氧化反應元件序列，氧化應激時 Nrf2 與其結合誘導 p62 表達，進而介導 Keap1 與泛素聚集體和自噬小體結合，刺激自噬，加速泛素聚集體清除，同時 p62 與 Keap1 的結合又使 Nrf2 核移位而激活，形成抗氧化正反饋回路。提示 p62 作為氧化應激下自噬與 Keap1/Nrf2 信號通路之間的關鍵樞紐，通過自噬與抗氧化作用發揮器官保護作用[22]。
H2S 通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路誘導自噬而發揮抗炎、抗氧化作用來保護器官損傷。蛋白質硫巰基化是 H2S 介導的翻譯后修飾之一，H2S 使 Keap1 的 Cys151 硫巰基化，誘導 Nrf2 與 Keap1 解離而核轉位，激活 Nrf2。Zhao 等[23]通過構建鏈脲佐菌素和高脂飲食誘導 LDLr－/－小鼠致肝損傷模型發現，H2S 供體 GYY4137 通過介導 Keap1 的 Cys151 硫巰基化誘導 Nrf2 與 Keap1 解離、核移位及下游抗氧化蛋白表達，抑制氧化應激，減輕脂質沉積及肝細胞損傷，改善肝功能，而敲除 Nrf2 基因可阻斷 GYY4137 介導的抗炎抗氧化保肝作用，并進一步通過體外高糖+氧化低密度脂蛋白與原代小鼠肝細胞共培養實驗證實了上述觀點。同樣地，Wu 等[24]通過構建 2 型糖尿病 db/db 小鼠模型及體外高糖和棕櫚酸酯培養 H9C2 細胞的 2 型糖尿病心肌細胞模型，證實了外源性 H2S（NaHS）促進兩個 Keap1 分子間二硫鍵形成，誘導自噬清除 ROS，抑制氧化應激和心肌細胞凋亡，阻止糖尿病性心肌病發生及發展。以上研究結果提示，Nrf2/Keap1 信號通路通過抗炎、抗氧化應激和調節自噬來參與膿毒癥器官保護作用，H2S 通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路保護膿毒癥器官損傷。
2.2 MAPK 信號通路
MAPK 介導了膿毒癥炎癥反應、氧化應激、免疫紊亂、自噬抑制和凋亡、微循環障礙等病理過程，使膿毒癥多器官功能損傷，其包含細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun-N 末端激酶（JNK）和 p38 三個亞家族，其中 ERK 通常被生長因子激活，在細胞增殖調控中起關鍵作用；p38 和 JNK 通常被應激激活，在炎癥、氧化應激及凋亡中起核心作用[25]。膿毒癥時，MAPK 作為 Toll 樣受體（TLR）下游靶點而被激活，調節促炎介質（TNF-α、HMGB1、ROS、iNOS、COX-2等）和促炎信號 NF-κB 的轉錄，從而引起過度炎癥反應[26]，使腸上皮細胞凋亡、緊密連接解離、腸屏障功能受損[25]。此外，ROS 觸發 ASK1-p38MAPK 級聯使組織因子升高、凝血異常導致微循環障礙[27]。
自噬在炎癥、免疫和維持腸道穩態中至關重要。MAPK 通過多種機制抑制自噬，加重膿毒癥炎癥和氧化應激。一方面，脂多糖通過上游 TLR4-MyD88-MAPK 通路激活負調控自噬的雷帕霉素（mTOR）[28]；另一方面，激活的 MAPK 和 mTOR 通過磷酸化自噬起始復合物中 ULK1 的 Ser757 抑制其活性并破壞與 ATG13 的相互作用，降低自噬通量[29]。Zhou 等[28]通過檢測結腸炎患者標本，以及構建脂多糖體外誘導人結腸腺癌細胞 Caco-2 和HT-29、脂多糖誘導 Balb/c 小鼠結腸炎模型均證實脂多糖使 MAPKs 活化而激活 mTOR，阻斷自噬通量，對 mTOR 基因敲除或藥理抑制可恢復自噬、減輕炎癥和氧化應激，而用 siRNAs 阻斷 ATG5 則加重損傷。此外，已有研究[30]證實 p38MAPK 抑制劑吡啶咪唑類化合物激活自噬并誘導抗血紅素氧合酶-1 發揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用。
H2S 通過抑制 MAPK 通路發揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用以減輕器官損傷。Zhang 等[31]通過體外脂多糖誘導大鼠骨骼肌細胞 L6 的膿毒癥膈肌損傷模型發現，脂多糖提高 MAPKs 磷酸化、ROS、促炎因子及凋亡水平，降低 H2S 及其合成酶（CSE、CBS 和 3-MST）表達，H2S 供體 NaHS 通過抑制 ROS/MAPK 途徑減輕炎癥、氧化應激及凋亡，改善膈肌功能障礙。Han 等[32]通過對大鼠進行大腦中動脈栓塞構建腦缺血再灌注損傷模型，證實了腦缺血再灌注損傷后 MAPKs（p38MAPK、ERK 1/2 和 JNK）磷酸化水平顯著升高；H2S 供體 GYY4137 通過抑制 MAPKs 磷酸化進而顯著降低促凋亡蛋白 Bax 水平，提高抗凋亡蛋白 Bcl-2 水平，抑制 caspase-3 活性，抑制神經元凋亡，減輕腦水腫及減小腦梗塞面積，促進神經功能恢復，發揮神經保護作用。綜上所述，H2S 通過抑制 MAPK 通路激活自噬，抑制炎癥、氧化應激及細胞凋亡，保護膿毒癥器官損傷。
2.3 AMPK 信號通路
AMPK 是維持機體能量穩態的重要調節因子，由催化亞基 α 和調節亞基 β 和 γ 組成，其 α 亞基 Thr172 磷酸化為主要激活機制。AMPK 磷酸化通過上游激酶（如 LKB1、CaMKKβ、TAK1）和磷酸酶（如 PP2A、PP2C）之間的平衡來調節，當能量充足時，磷酸酶結合 α 亞基 Thr172 抑制 AMPK 磷酸化；當能量耗竭時，大量 AMP/ADP 與 γ 亞基結合阻止磷酸酶進入 α 亞基使 AMPK 磷酸化激活，其中 AMP/ADP 與 γ 亞基結合使 LKB1 活化而激活 AMPK；此外，當細胞 Ca2+水平升高時，通過磷酸化 CaMKKβ 而激活 AMPK 以維持細胞內穩態[33]。
有研究[34]表明，在炎癥、衰老等病理條件下 AMPK 被抑制，導致自噬損傷、線粒體功能障礙及細胞能量衰竭，因而激活 AMPK 已成為治療膿毒癥的有效手段。AMPK 不僅使過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子-1α（PGC-1α）磷酸化而誘導線粒體生物發生，還通過增加 NAD+/NADH 激活 SIRT1，進而去乙酰化激活 PGC-1α 而調控線粒體功能，從而抑制氧化應激[35]；AMPK 還通過多種機制發揮抗氧化防御作用如激活 Nrf2 而上調抗氧化基因（血紅素氧合酶-1、超氧化物歧化酶）表達[36]來誘導下游轉錄因子 FOXO 核移位進而激活下游抗氧化酶基因表達等[37]。由于腸道既是膿毒癥極易受累的器官，又是膿毒癥病程進展的始動器官，因此，改善腸道屏障功能是治療膿毒癥的關鍵。AMPK 通過增強腸上皮分化的關鍵轉錄因子 CDX2 表達、磷酸化緊密連接蛋白而促進頂端連接組裝和穩定、抑制 Wnt/β-catenin 信號，改善腸屏障功能[33]。
近年來研究證實，通過激活 AMPK 能誘導自噬而保護膿毒癥器官損傷。AMPK 不僅通過直接磷酸化 ULK1 或抑制 mTORC1 間接激活 ULK1 進而增加自噬起始復合物 PI3KC3/Vps34 活性而直接促進自噬，還通過激活下游轉錄因子 FOXO3 上調 BNIP3、ATG4、LC3、ATG12 等自噬相關基因表達而間接促進自噬；此外，AMPK 還通過轉錄機制激活自噬的主要轉錄調節因子 TFEB，激活自噬-溶酶體途徑，誘導自噬，降解受損線粒體進而抗炎、抗氧化[38]。
H2S 可激活 AMPK 進而誘導自噬、抗炎、抗氧化，從而保護器官損傷[39]。具體地，H2S 不僅通過激活 AMPK 上游激酶（如 LKB1、CaMKKβ），還通過磷酸酶的蛋白質硫巰基化以抑制其活性，使 AMPK 激活。Yang 等[40]通過鏈脲佐菌素誘導大鼠 1 型糖尿病模型和體外高糖誘導 H9C2 細胞實驗發現，H2S 激活 AMPK/mTOR 通路而誘導自噬（Beclin-1、LCⅡ表達增加，p62 表達降低），通過清除受損線粒體、抑制 ROS 產生、抗心肌細胞凋亡，改善線粒體功能，提高心肌細胞存活率，減輕高糖誘導的心肌細胞損傷；Wang 等[41]通過油酸刺激人肝細胞 L02 建立炎癥模型，證明了油酸誘導 L02 細胞的核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族 3（NLRP3）炎性小體激活，導致過度炎癥反應，從而抑制自噬（降低 LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin-1 蛋白表達，增加 p62 蛋白表達，減少自噬小體和自溶酶體形成），然而給予 H2S 供體 NaHS 后，可通過 AMPK/mTOR 途徑促進 L02 細胞自噬，抑制油酸誘導的 NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應，減輕細胞損傷。以上研究結果提示，H2S 通過激活 AMPK 誘導自噬、抗炎、抗氧化及抗凋亡，保護線粒體功能及維持細胞內穩態，從而保護膿毒癥器官損傷。
3 小結與展望
膿毒癥時，炎癥、氧化應激、線粒體損傷、微循環障礙、免疫紊亂、自噬損傷、凋亡等病理機制使全身各種組織和器官損傷，最終導致多器官功能衰竭，因此，尋找有效的治療手段保護膿毒癥器官損傷至關重要。通過調控自噬可抑制炎癥、氧化應激及凋亡，調節免疫，維持細胞穩態，減輕膿毒癥器官損傷，可成為膿毒癥的有效治療靶點。在膿毒癥過度炎癥反應階段，自噬過度或不足均會致細胞自噬死亡，若過早誘導自噬可加重機體炎癥反應及免疫損傷，因此，調控自噬的時機及程度將成為未來研究的方向。H2S 可通過多種信號通路調控機體自噬、炎癥、氧化應激等多種病理過程，已證實多種外源性 H2S 供體通過調控自噬、抑制炎癥及氧化應激而減輕膿毒癥器官損傷，然而也有研究表明，H2S 在膿毒癥中介導的促炎作用與所研究的膿毒癥模型中膿毒癥嚴重程度不同及所用 H2S 供體不同有關，如 H2S 供體 Na2S、NaHS 等可快速大量釋放 H2S 造成細胞毒性，而新型緩釋供體如 GYY4137 可長時間緩慢釋放 H2S 模擬內源性 H2S 的生理作用，可成為未來的有效治療手段。因此，尚需大量基礎實驗及臨床前研究以掌握應用于臨床的安全、適宜的 H2S 供體藥物及其劑量，以及調控自噬的時機及度將成為膿毒癥治療的新方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：聶靜云、康富貴、張琛涵共同收集、整理文獻資料，同時聶靜云起草論文初稿，康富貴、張琛涵核對、審校稿件；柴琛老師指導文章定稿的修改并把關。