引用本文： 邱振東, 鄧文宏, 洪育蒲, 李滿, 余佳, 王衛星. ATP 檸檬酸裂解酶對結腸癌細胞脂質代謝及腫瘤生物學行為的作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(1): 48-52. doi: 10.7507/1007-9424.202004133 復制
結腸癌是嚴重威脅人類健康的腫瘤疾病，其發病率和病死率居全球所有惡性腫瘤的第 3 位，于我國居第 2 位[1]。目前結腸癌的治療手段仍是以手術為主，放化療為輔，但由于結腸癌易轉移與復發，治療效果依舊有限。關于結腸癌的治療，人們逐漸提出了腫瘤的代謝療法并取得重大進展[2-3]，近年來更多的研究針對腫瘤的脂質代謝進行治療[3]，并逐漸與免疫應答和臨床營養相結合[4]。ATP 檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是一種含有 1 101 個殘基的多肽且具備多功能性的四聚體[5]。ACLY 催化依賴 ATP 和依賴輔酶 A 的檸檬酸轉化為草酰乙酸酯和高能生物合成前體乙酰輔酶 A1，后者為關鍵的生化反應提供燃料，如合成脂肪酸、膽固醇和乙酰膽堿，以及組蛋白和蛋白的乙酰化[6]，且 ACLY 基因參與了腫瘤的脂質代謝。絕大多數正常的細胞主要通過攝取食物中的營養物質來利用外源性脂肪酸，因此與脂代謝相關的酶活性也比較低，而癌細胞內源性合成的脂肪酸卻占 93%[7]。研究[8]證實，在不同類型腫瘤的早期階段，參與脂肪酸合成的許多酶如ACLY、乙酰輔酶 A（acetyl coenzyme A，AC-CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶等表達就已開始上調。一方面，瘤細胞的快速增殖需要大量的脂質供應，因磷脂和膽固醇構成生物膜的主要結構；另一方面，脂肪酸和甘油三酯提供了充足的能量底物；再者，脂質也被用作前體來合成一些激素和介導信號轉導通路的第二信使。此外，研究還發現，脂肪酸的從頭合成（de novo lipogenesis，DNL）對于血管生成至關重要[9]，這可能為腫瘤細胞的再生轉移和表觀遺傳學的重編程提供了充分條件[10]，并有相關研究報道了 ACLY 能通過促進脂質相關蛋白的活性與核轉位從而促進結腸癌轉移[11]，這或許意味著腫瘤患者 ACLY 的低表達與良好預后相關[12]。不僅如此，癌細胞的 DNL 將相當數量的 NADPH 還原當量轉化為 NADP+，從而通過作為電子受體促進細胞氧化還原平衡[13]。由于 ACLY 是細胞 DNL 的第一個關鍵酶，近年來的研究開始探討其對腫瘤細胞生物學行為的影響，但目前關于 ACLY 在結腸癌中的脂質代謝作用研究較少。為進一步明確 ACLY 基因對結腸癌細胞脂質代謝的影響，本實驗在敲減 ACLY 基因后，分析結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移以及脂質代謝的變化，并對其機制進行初步探討。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
胎牛血清購自美國 Gibco 公司，雙抗購自澳洲 HyClone 公司，胰蛋白酶購自中國 Biosharp 公司，慢病毒相關試劑盒購自上海吉凱基因公司，CCK-8 試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購自美國 BD 公司，甘油三酯測試盒購自南京建成公司。本試驗一抗均購自 Abcam 公司，熒光和化學發光二抗均購自武漢塞維爾公司。主要設備包括：倒置熒光顯微鏡（MicroPublisher 5.0 RTV，加拿大 QIMAGING 公司）和酶標儀（EnSight ，美國 Perkin Elmer 公司）。
1.2 細胞培養
結腸癌細胞株 HCT116 來源于中國科學院昆明細胞庫，在 37 ℃、5% CO2、濕度為 95% 的培養箱內培養。完全培養基為含有 10% 胎牛血清及 1% 雙抗的高糖 DMEM 培養基，每 2～3 天換液 1 次，待細胞生長密度達到 80% 時，以胰蛋白酶消化，根據實驗需要進行傳代培養，收集對數生長期細胞用于后續研究。
1.3 方法
1.3.1 細胞轉染
收集對數生長期的細胞接種于6 孔板中，根據預實驗測出的最適感染復數（MOI，本研究 MOI=10）轉染細胞。轉染操作按試劑盒說明書進行。細胞轉染 72 h 后，根據預實驗測出的嘌呤霉素濃度篩選穩轉細胞系，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，最終轉染效果通過 Western blot 法檢測 ACLY 蛋白的表達來鑒定。以敲減 ACLY 基因的 HCT116 細胞作為 ACLY 敲減組，以空載體轉染細胞作為陰性對照組，以未經處理的結腸癌 HCT116 細胞作為空白對照組。
1.3.2 Western blot 法檢測相關蛋白表達
收集各組細胞，提取細胞中總蛋白，利用 Western blot 方法檢測 3 組細胞中 ACLY 蛋白和 GAPDH 蛋白的表達情況，用 Image J 軟件計算的條帶灰度值進行半定量。重復檢測 3 次。
1.3.3 CCK-8 檢測細胞增殖試驗
細胞以每孔5 000 個細胞的密度接種于 96 孔板中，用完全培養基（含 10% 胎牛血清）培養 24、48 和 120 h，在指定的時間加入 CCK-8，然后 37 ℃ 避光 1 h。最后，使用酶標儀在 450 nm 處測定每個樣品的吸光度（A）值。通過與未經處理的對照組進行比較，估計活細胞的百分比。每組設計 3 個復孔，重復檢測 3 次。
1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力
將約 5×105 個細胞接種到 6 孔板中。當樣本剛剛接觸和融合時，用 10 mL 吸管尖端在單層細胞上劃筆直的痕跡。在 0、8 和 24 h 時以倒置顯微鏡拍照，并通過 Image J 軟件計算劃痕間距與長度的比值。每組設計 3 個復孔。
1.3.5 細胞凋亡檢測
采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞在指定條件下培養后，收集至流式管，以 Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒染色。采用流式細胞術檢測凋亡細胞百分率，其中 Annexin Ⅴ-PE 陽性染色為早期凋亡細胞，7-AAD 陽性染色為晚期凋亡細胞，每組每次收集 1.5×104 個細胞。實驗重復 3 次。
1.3.6 細胞脂質檢測
細胞內總甘油三酯含量使用甘油三酯檢測試劑盒，根據產品說明書用酶標儀檢測。甘油三酯含量= ［（樣本 A 值–空白 A 值）/（校準 A 值–空白 A 值）］×校準品濃度/待測樣本蛋白濃度，其中甘油三酯含量單位為 mmol/gprot，校準品濃度單位為 mmol/L，待測樣本蛋白濃度單位為 gprot/L。每個樣本設計 3 個復孔。
2 結果
2.1 細胞轉染和 ACLY 基因敲減效果
倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉染后的綠色熒光蛋白（GFP）表達結果見圖 1a–1d，可見細胞轉染后 48 h 開始出現微弱熒光，72 h 后熒光強度趨于穩定，經篩選后（圖 1d）熒光強度更為集中。Western blot 結果可見，ACLY 敲減組細胞中 ACLY 蛋白的表達水平低于陰性對照組和空白對照組（圖 1e、1f）。
圖1
示 HCT116 細胞的轉染效果以及 3 組 HCT116 細胞的實驗結果
a–d：HCT116 細胞轉染慢病毒后 0 h（a）、48 h（b）和 72 h（c）以及嘌呤霉素篩選后（d）的細胞 GFP 表達（倒置熒光顯微鏡 ×100）；e、f：空白對照組、陰性對照組和 ACLY 敲減組細胞中 ACLY 蛋白表達的電泳結果（e）和半定量結果（f）；g：3 組 HCT116 細胞的存活率結果；h：空白對照組、陰性對照組和 ACLY 敲減組分別在 0、8 和 24 h 的細胞劃痕結果（倒置熒光顯微鏡 ×40）；i：8 h 時 3 組細胞的遷移率結果；j：24 h 時 3 組細胞的遷移率結果；k：3 組細胞的總凋亡率結果；l–n：空白對照組（l）、陰性對照組（m）和 ACLY 敲減組（n）的流式細胞儀凋亡檢測結果；o：3 組細胞的總甘油三酯含量結果
2.2 ACLY 基因敲減抑制腫瘤細胞的晚期增殖
CCK-8 檢測 3 組 HCT116 細胞的存活率結果見圖 1g，可見 24 h 和 48 h 時，ACLY 敲減組的細胞存活率稍下降，但與空白對照組和陰性對照組比較差異不大。但當細胞培養至 120 h 時，ACLY 敲減組的細胞存活率下降，較空白對照組和陰性對照組低。
2.3 ACLY 基因敲減抑制細胞的遷移能力
細胞劃痕實驗檢測的 3 組 HCT116 細胞的遷移能力結果見圖 1h。用 Image J 軟件計算出每張劃痕細胞間距與長度的比值后，以 0 h 為基準，分別計算8 h 和 24 h 時 3 組的 HCT116 細胞遷移率。結果顯示，ACLY 敲減組細胞 8 h 時的遷移率無明顯下降，與空白對照組和陰性對照組比較差異不大，見圖 1i；在 24 h 時ACLY 敲減組的遷移率較空白對照組和陰性對照組低，見圖 1j。
2.4 ACLY 基因敲減使細胞凋亡增加
流式細胞儀檢測 3 組 HCT116 細胞的凋亡結果見圖 1k–1n，可見 ACLY 敲減組 HCT116 細胞的總凋亡率明顯升高，高于空白對照組和陰性對照組。
2.5 ACLY 基因敲減抑制細胞甘油三酯生成
ACLY 敲減組的 HCT116 細胞內甘油三酯含量低于空白對照組和陰性對照組，見圖 1o。
3 討論
在動物的正常細胞中，脂質合成的目標是將從營養物質中提取的碳轉化為脂肪酸、膽固醇、磷酸甘油酯、二十烷類和鞘脂；脂質的獲得主要是通過生長因子信號傳導，然后直接攝取養分，刺激細胞內的脂質感應激酶，建立信號級聯，將脂質從分解代謝途徑轉向合成代謝途徑[4]。脂質組成的復雜性、多功能性等是決定生物膜甚至細胞本身特性的重要因素。線粒體、高爾基體、內質網等細胞器有著豐富的生物膜。因此，改變脂質性質會極大地影響生物膜的拓撲結構、空間組織甚至是整個細胞的生長增殖機制。除此之外，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的平衡對細胞的生理起著重要作用，過量飽和脂肪酸的積累會引起內質網應激[3]。細胞代謝需要的脂肪酸主要有兩個來源，外源性脂肪酸通過膳食攝取的脂肪酸延長獲得；內源性脂肪酸通過 DNL 獲得。AC-CoA 是 DNL 所必需的原料，并且只能是糖代謝產生的 AC-CoA。線粒體檸檬酸轉運蛋白在線粒體內與三羧酸循環中的 AC-CoA 結合為檸檬酸后，轉移到胞質中，ACLY 蛋白再將胞質的檸檬酸分解為草酰乙酸和 AC-CoA，從而實現對葡萄糖產生的 AC-CoA 的利用[14]。
腫瘤細胞快速的增殖能力與其旺盛的脂質代謝密切相關。腫瘤細胞內豐富的脂質構成細胞膜及胞內細胞器的生物質膜，從而促進腫瘤細胞的增殖。其次，脂質也可以是信號傳遞的信使物質，為細胞代謝活動的通路網提供諸多可能。此外，腫瘤細胞中的脂質大多不能像正常細胞一樣儲存下來，而是分解供能[15]。
腫瘤患者惡病質的原因之一為腫瘤細胞的瓦博格效應，即腫瘤細胞即便在有氧環境下仍進行無氧酵解[16]，這種代謝方式消耗大量葡萄糖卻生成極少的能量，其間生成的大量中間產物乳酸便通過乳酸反應途徑生成葡萄糖，從而形成循環，或者生成谷氨酰胺間接為脂肪酸合成提供原料[17]。此外，臨床研究[18]表明，結腸癌患者腸道來源的脂質原料攝取并不會減少，然而在腫瘤細胞中，即便外源性脂質的攝入也要通過一定的方式重新進入 DNL 途徑才能被腫瘤細胞自身利用。
大多研究認為，腫瘤脂質合成的主要原料來源于糖代謝，但近年來研究[19-20]表明，膠質瘤、結腸癌等多種腫瘤細胞的主要碳來源是谷氨酰胺。在消耗 ATP 的基礎上，ACLY 蛋白催化檸檬酸生成AC-CoA 和草酰乙酸，而 AC-CoA 可以參與脂肪酸和膽固醇合成，以及組蛋白乙酰化過程[21-22]。三羧酸循環產生的檸檬酸可以通過線粒體和核膜，作為細胞質和核內 ACLY 蛋白催化產生 AC-CoA 的底物[23-24]。細胞的脂肪酸來源分為外源性脂肪酸合成和內源性 DNL，而在腫瘤細胞中 DNL 源性的脂肪酸超過 90%[13]，因此 ACLY 蛋白作為 DNL 第一步反應的關鍵酶有重大的研究價值。既往研究[3, 7]中，大量數據證明，ACLY 基因在結腸癌組織和結腸癌細胞系細胞中的表達高于結腸癌癌旁組織和正常結腸細胞系。本研究應用慢病毒敲減了 HCT116 結腸癌細胞的 ACLY 基因，發現 HCT116 細胞在 ACLY 基因敲減后，胞內甘油三酯含量顯著下降，遷移能力和晚期增殖能力下降，凋亡細胞比例顯著增加。其中，細胞增殖能力在敲減后 24 h 和 48 h 變化不大，直到 120 h 才顯著降低，意味著在腫瘤的早期，ACLY 基因并不是腫瘤細胞增殖的關鍵因素。在劃痕實驗中，細胞的遷移能力在 24 h 明顯下降，表明 ACLY 基因在 HCT116 結腸癌細胞的遷移方面起著重要作用。此外，其胞內的甘油三酯含量下降意味著 ACLY 基因在調控結腸癌細胞生物學行為的同時還影響了其脂質代謝，甚至是通過調控結腸癌細胞的脂質代謝從而影響其生物學行為，這意味著 ACLY 基因是調控結腸癌細胞發生發展與代謝網絡的重要基因。
綜上所述，ACLY 基因通過調節結腸癌細胞的脂質合成從而影響著腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為，兩者有望作為結腸癌個體化治療的雙重靶點，在基因、免疫、營養代謝治療等方面均擁有重大前景，但其中的詳細機制仍待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：邱振東、鄧文宏、洪育蒲和李滿負責具體的實驗設計、細胞實驗的實施和論文撰寫工作；余佳協助數據整理與論文修改；王衛星教授提出實驗的研究思路并在論文撰寫、修改過程中提出建議。
結腸癌是嚴重威脅人類健康的腫瘤疾病，其發病率和病死率居全球所有惡性腫瘤的第 3 位，于我國居第 2 位[1]。目前結腸癌的治療手段仍是以手術為主，放化療為輔，但由于結腸癌易轉移與復發，治療效果依舊有限。關于結腸癌的治療，人們逐漸提出了腫瘤的代謝療法并取得重大進展[2-3]，近年來更多的研究針對腫瘤的脂質代謝進行治療[3]，并逐漸與免疫應答和臨床營養相結合[4]。ATP 檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是一種含有 1 101 個殘基的多肽且具備多功能性的四聚體[5]。ACLY 催化依賴 ATP 和依賴輔酶 A 的檸檬酸轉化為草酰乙酸酯和高能生物合成前體乙酰輔酶 A1，后者為關鍵的生化反應提供燃料，如合成脂肪酸、膽固醇和乙酰膽堿，以及組蛋白和蛋白的乙酰化[6]，且 ACLY 基因參與了腫瘤的脂質代謝。絕大多數正常的細胞主要通過攝取食物中的營養物質來利用外源性脂肪酸，因此與脂代謝相關的酶活性也比較低，而癌細胞內源性合成的脂肪酸卻占 93%[7]。研究[8]證實，在不同類型腫瘤的早期階段，參與脂肪酸合成的許多酶如ACLY、乙酰輔酶 A（acetyl coenzyme A，AC-CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶等表達就已開始上調。一方面，瘤細胞的快速增殖需要大量的脂質供應，因磷脂和膽固醇構成生物膜的主要結構；另一方面，脂肪酸和甘油三酯提供了充足的能量底物；再者，脂質也被用作前體來合成一些激素和介導信號轉導通路的第二信使。此外，研究還發現，脂肪酸的從頭合成（de novo lipogenesis，DNL）對于血管生成至關重要[9]，這可能為腫瘤細胞的再生轉移和表觀遺傳學的重編程提供了充分條件[10]，并有相關研究報道了 ACLY 能通過促進脂質相關蛋白的活性與核轉位從而促進結腸癌轉移[11]，這或許意味著腫瘤患者 ACLY 的低表達與良好預后相關[12]。不僅如此，癌細胞的 DNL 將相當數量的 NADPH 還原當量轉化為 NADP+，從而通過作為電子受體促進細胞氧化還原平衡[13]。由于 ACLY 是細胞 DNL 的第一個關鍵酶，近年來的研究開始探討其對腫瘤細胞生物學行為的影響，但目前關于 ACLY 在結腸癌中的脂質代謝作用研究較少。為進一步明確 ACLY 基因對結腸癌細胞脂質代謝的影響，本實驗在敲減 ACLY 基因后，分析結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移以及脂質代謝的變化，并對其機制進行初步探討。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
胎牛血清購自美國 Gibco 公司，雙抗購自澳洲 HyClone 公司，胰蛋白酶購自中國 Biosharp 公司，慢病毒相關試劑盒購自上海吉凱基因公司，CCK-8 試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購自美國 BD 公司，甘油三酯測試盒購自南京建成公司。本試驗一抗均購自 Abcam 公司，熒光和化學發光二抗均購自武漢塞維爾公司。主要設備包括：倒置熒光顯微鏡（MicroPublisher 5.0 RTV，加拿大 QIMAGING 公司）和酶標儀（EnSight ，美國 Perkin Elmer 公司）。
1.2 細胞培養
結腸癌細胞株 HCT116 來源于中國科學院昆明細胞庫，在 37 ℃、5% CO2、濕度為 95% 的培養箱內培養。完全培養基為含有 10% 胎牛血清及 1% 雙抗的高糖 DMEM 培養基，每 2～3 天換液 1 次，待細胞生長密度達到 80% 時，以胰蛋白酶消化，根據實驗需要進行傳代培養，收集對數生長期細胞用于后續研究。
1.3 方法
1.3.1 細胞轉染
收集對數生長期的細胞接種于6 孔板中，根據預實驗測出的最適感染復數（MOI，本研究 MOI=10）轉染細胞。轉染操作按試劑盒說明書進行。細胞轉染 72 h 后，根據預實驗測出的嘌呤霉素濃度篩選穩轉細胞系，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，最終轉染效果通過 Western blot 法檢測 ACLY 蛋白的表達來鑒定。以敲減 ACLY 基因的 HCT116 細胞作為 ACLY 敲減組，以空載體轉染細胞作為陰性對照組，以未經處理的結腸癌 HCT116 細胞作為空白對照組。
1.3.2 Western blot 法檢測相關蛋白表達
收集各組細胞，提取細胞中總蛋白，利用 Western blot 方法檢測 3 組細胞中 ACLY 蛋白和 GAPDH 蛋白的表達情況，用 Image J 軟件計算的條帶灰度值進行半定量。重復檢測 3 次。
1.3.3 CCK-8 檢測細胞增殖試驗
細胞以每孔5 000 個細胞的密度接種于 96 孔板中，用完全培養基（含 10% 胎牛血清）培養 24、48 和 120 h，在指定的時間加入 CCK-8，然后 37 ℃ 避光 1 h。最后，使用酶標儀在 450 nm 處測定每個樣品的吸光度（A）值。通過與未經處理的對照組進行比較，估計活細胞的百分比。每組設計 3 個復孔，重復檢測 3 次。
1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力
將約 5×105 個細胞接種到 6 孔板中。當樣本剛剛接觸和融合時，用 10 mL 吸管尖端在單層細胞上劃筆直的痕跡。在 0、8 和 24 h 時以倒置顯微鏡拍照，并通過 Image J 軟件計算劃痕間距與長度的比值。每組設計 3 個復孔。
1.3.5 細胞凋亡檢測
采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞在指定條件下培養后，收集至流式管，以 Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒染色。采用流式細胞術檢測凋亡細胞百分率，其中 Annexin Ⅴ-PE 陽性染色為早期凋亡細胞，7-AAD 陽性染色為晚期凋亡細胞，每組每次收集 1.5×104 個細胞。實驗重復 3 次。
1.3.6 細胞脂質檢測
細胞內總甘油三酯含量使用甘油三酯檢測試劑盒，根據產品說明書用酶標儀檢測。甘油三酯含量= ［（樣本 A 值–空白 A 值）/（校準 A 值–空白 A 值）］×校準品濃度/待測樣本蛋白濃度，其中甘油三酯含量單位為 mmol/gprot，校準品濃度單位為 mmol/L，待測樣本蛋白濃度單位為 gprot/L。每個樣本設計 3 個復孔。
2 結果
2.1 細胞轉染和 ACLY 基因敲減效果
倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉染后的綠色熒光蛋白（GFP）表達結果見圖 1a–1d，可見細胞轉染后 48 h 開始出現微弱熒光，72 h 后熒光強度趨于穩定，經篩選后（圖 1d）熒光強度更為集中。Western blot 結果可見，ACLY 敲減組細胞中 ACLY 蛋白的表達水平低于陰性對照組和空白對照組（圖 1e、1f）。
圖1
示 HCT116 細胞的轉染效果以及 3 組 HCT116 細胞的實驗結果
a–d：HCT116 細胞轉染慢病毒后 0 h（a）、48 h（b）和 72 h（c）以及嘌呤霉素篩選后（d）的細胞 GFP 表達（倒置熒光顯微鏡 ×100）；e、f：空白對照組、陰性對照組和 ACLY 敲減組細胞中 ACLY 蛋白表達的電泳結果（e）和半定量結果（f）；g：3 組 HCT116 細胞的存活率結果；h：空白對照組、陰性對照組和 ACLY 敲減組分別在 0、8 和 24 h 的細胞劃痕結果（倒置熒光顯微鏡 ×40）；i：8 h 時 3 組細胞的遷移率結果；j：24 h 時 3 組細胞的遷移率結果；k：3 組細胞的總凋亡率結果；l–n：空白對照組（l）、陰性對照組（m）和 ACLY 敲減組（n）的流式細胞儀凋亡檢測結果；o：3 組細胞的總甘油三酯含量結果
2.2 ACLY 基因敲減抑制腫瘤細胞的晚期增殖
CCK-8 檢測 3 組 HCT116 細胞的存活率結果見圖 1g，可見 24 h 和 48 h 時，ACLY 敲減組的細胞存活率稍下降，但與空白對照組和陰性對照組比較差異不大。但當細胞培養至 120 h 時，ACLY 敲減組的細胞存活率下降，較空白對照組和陰性對照組低。
2.3 ACLY 基因敲減抑制細胞的遷移能力
細胞劃痕實驗檢測的 3 組 HCT116 細胞的遷移能力結果見圖 1h。用 Image J 軟件計算出每張劃痕細胞間距與長度的比值后，以 0 h 為基準，分別計算8 h 和 24 h 時 3 組的 HCT116 細胞遷移率。結果顯示，ACLY 敲減組細胞 8 h 時的遷移率無明顯下降，與空白對照組和陰性對照組比較差異不大，見圖 1i；在 24 h 時ACLY 敲減組的遷移率較空白對照組和陰性對照組低，見圖 1j。
2.4 ACLY 基因敲減使細胞凋亡增加
流式細胞儀檢測 3 組 HCT116 細胞的凋亡結果見圖 1k–1n，可見 ACLY 敲減組 HCT116 細胞的總凋亡率明顯升高，高于空白對照組和陰性對照組。
2.5 ACLY 基因敲減抑制細胞甘油三酯生成
ACLY 敲減組的 HCT116 細胞內甘油三酯含量低于空白對照組和陰性對照組，見圖 1o。
3 討論
在動物的正常細胞中，脂質合成的目標是將從營養物質中提取的碳轉化為脂肪酸、膽固醇、磷酸甘油酯、二十烷類和鞘脂；脂質的獲得主要是通過生長因子信號傳導，然后直接攝取養分，刺激細胞內的脂質感應激酶，建立信號級聯，將脂質從分解代謝途徑轉向合成代謝途徑[4]。脂質組成的復雜性、多功能性等是決定生物膜甚至細胞本身特性的重要因素。線粒體、高爾基體、內質網等細胞器有著豐富的生物膜。因此，改變脂質性質會極大地影響生物膜的拓撲結構、空間組織甚至是整個細胞的生長增殖機制。除此之外，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的平衡對細胞的生理起著重要作用，過量飽和脂肪酸的積累會引起內質網應激[3]。細胞代謝需要的脂肪酸主要有兩個來源，外源性脂肪酸通過膳食攝取的脂肪酸延長獲得；內源性脂肪酸通過 DNL 獲得。AC-CoA 是 DNL 所必需的原料，并且只能是糖代謝產生的 AC-CoA。線粒體檸檬酸轉運蛋白在線粒體內與三羧酸循環中的 AC-CoA 結合為檸檬酸后，轉移到胞質中，ACLY 蛋白再將胞質的檸檬酸分解為草酰乙酸和 AC-CoA，從而實現對葡萄糖產生的 AC-CoA 的利用[14]。
腫瘤細胞快速的增殖能力與其旺盛的脂質代謝密切相關。腫瘤細胞內豐富的脂質構成細胞膜及胞內細胞器的生物質膜，從而促進腫瘤細胞的增殖。其次，脂質也可以是信號傳遞的信使物質，為細胞代謝活動的通路網提供諸多可能。此外，腫瘤細胞中的脂質大多不能像正常細胞一樣儲存下來，而是分解供能[15]。
腫瘤患者惡病質的原因之一為腫瘤細胞的瓦博格效應，即腫瘤細胞即便在有氧環境下仍進行無氧酵解[16]，這種代謝方式消耗大量葡萄糖卻生成極少的能量，其間生成的大量中間產物乳酸便通過乳酸反應途徑生成葡萄糖，從而形成循環，或者生成谷氨酰胺間接為脂肪酸合成提供原料[17]。此外，臨床研究[18]表明，結腸癌患者腸道來源的脂質原料攝取并不會減少，然而在腫瘤細胞中，即便外源性脂質的攝入也要通過一定的方式重新進入 DNL 途徑才能被腫瘤細胞自身利用。
大多研究認為，腫瘤脂質合成的主要原料來源于糖代謝，但近年來研究[19-20]表明，膠質瘤、結腸癌等多種腫瘤細胞的主要碳來源是谷氨酰胺。在消耗 ATP 的基礎上，ACLY 蛋白催化檸檬酸生成AC-CoA 和草酰乙酸，而 AC-CoA 可以參與脂肪酸和膽固醇合成，以及組蛋白乙酰化過程[21-22]。三羧酸循環產生的檸檬酸可以通過線粒體和核膜，作為細胞質和核內 ACLY 蛋白催化產生 AC-CoA 的底物[23-24]。細胞的脂肪酸來源分為外源性脂肪酸合成和內源性 DNL，而在腫瘤細胞中 DNL 源性的脂肪酸超過 90%[13]，因此 ACLY 蛋白作為 DNL 第一步反應的關鍵酶有重大的研究價值。既往研究[3, 7]中，大量數據證明，ACLY 基因在結腸癌組織和結腸癌細胞系細胞中的表達高于結腸癌癌旁組織和正常結腸細胞系。本研究應用慢病毒敲減了 HCT116 結腸癌細胞的 ACLY 基因，發現 HCT116 細胞在 ACLY 基因敲減后，胞內甘油三酯含量顯著下降，遷移能力和晚期增殖能力下降，凋亡細胞比例顯著增加。其中，細胞增殖能力在敲減后 24 h 和 48 h 變化不大，直到 120 h 才顯著降低，意味著在腫瘤的早期，ACLY 基因并不是腫瘤細胞增殖的關鍵因素。在劃痕實驗中，細胞的遷移能力在 24 h 明顯下降，表明 ACLY 基因在 HCT116 結腸癌細胞的遷移方面起著重要作用。此外，其胞內的甘油三酯含量下降意味著 ACLY 基因在調控結腸癌細胞生物學行為的同時還影響了其脂質代謝，甚至是通過調控結腸癌細胞的脂質代謝從而影響其生物學行為，這意味著 ACLY 基因是調控結腸癌細胞發生發展與代謝網絡的重要基因。
綜上所述，ACLY 基因通過調節結腸癌細胞的脂質合成從而影響著腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為，兩者有望作為結腸癌個體化治療的雙重靶點，在基因、免疫、營養代謝治療等方面均擁有重大前景，但其中的詳細機制仍待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：邱振東、鄧文宏、洪育蒲和李滿負責具體的實驗設計、細胞實驗的實施和論文撰寫工作；余佳協助數據整理與論文修改；王衛星教授提出實驗的研究思路并在論文撰寫、修改過程中提出建議。
