引用本文： 楊發才, 李敬東, 邱應和. 長鏈非編碼 RNA 對膽囊癌惡性生物學行為調節的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(11): 1436-1443. doi: 10.7507/1007-9424.202004091 復制
膽囊癌是膽管系統惡性腫瘤中的首位致死因素。由于膽囊癌的惡性程度高、增殖轉移活性強，因此，其病程進展迅速，致患者臨床預后通常很差[1-2]。膽囊癌發生、發展、侵襲、轉移的調控機制非常復雜，與一系列信號通路激活密切相關，是一個由多因素參與、多階段遞增的復雜過程[2-3]。因此，深入研究和篩選膽囊癌發病相關分子機制和分子靶標及建立并優化的綜合性治療策略是改善膽囊癌患者預后的重要方面。人類基因組中大部分非編碼基因曾被認為是“垃圾 DNA”，然而隨著高通量技術（如新一代測序技術）的發展以及對非編碼基因組的深入研究，這一觀點已經被徹底改變。盡管只有不到 2% 的人類基因組編碼蛋白質，但大多數人類基因組都可以被轉錄為非編碼 RNA 且這些非編碼 RNA 與基因表達、調控密切相關[4]。在各種類型非編碼 RNA 中，長鏈非編碼（long non-coding，lnc）RNA（lncRNA）受到越來越多的關注，其是一類長度超過 200 個核苷酸、不能翻譯為蛋白質的非編碼 RNA[5]。對 lncRNA 靶基因的功能分析揭示，lncRNA 可通過結合啟動子和遠端調控元件來發揮其功能[6-7]。近年來研究[8]發現，包括膽囊癌在內的多種實體腫瘤中均發現了特定的 lncRNA 異常表達且與腫瘤的發生及發展相關。因此，現就近年來 lncRNA 對膽囊癌惡性生物學行為調節的研究進展作一綜述，以期為 lncRNA 與膽囊癌的相關研究提供一定的參考。
1 lncRNA 與膽囊癌的惡性生物學行為相關
目前已發現多種 lncRNA 與膽囊癌的發生和進展密切相關[9]。將膽囊癌相關 lncRNA 在調節腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、“海綿化”miRNAs、化療抵抗等方面發揮的重要作用進行了匯總[10-37]，見表 1。其中 MEG3[10-13]、lncRNA-LET[14-15]和 GCASPC[16]在膽囊癌組織中表達下調并具有抑癌作用；H19[17-19]、MALAT1[20-22]、HOTAIR[23]、CCAT1[24-25]、ANRIL[12]、LINC00152[26-27]、MINCR[28]、AFAP1-AS1[29]、UCA1[30]、PVT1[31]、PAGBC[32]、Loc344887[33]、ROR[34]、HEGBC[35]則在腫瘤組織中表達上調并促進腫瘤的進展，具有促癌作用。另外，筆者團隊最近一項研究[36]提示 lncRNA NEAT1 在膽囊癌組織中表達上調且具有致癌作用。此外，lncRNA ENST00000425894 在對膽囊癌的化療抵抗方面也具有重要作用[37]。
表1
與膽囊癌相關 lncRNAs 的生物學功能及影響途徑
2 膽囊癌中 lncRNA 的作用機制
2.1 lncRNA 的抑癌作用
2.1.1 MEG3
MEG3 為母系表達的印跡基因，從該基因可轉錄多個選擇性剪接的轉錄變體，均是 lncRNA。MEG3 基因在多種正常組織中表達，但是在不同組織起源的多個癌細胞系中表達降低[38]。Liu 等[12]發現，MEG3 在膽囊癌組織中表達較其在正常組織中顯著降低，其低表達提示預后不良，導致膽囊癌中 MEG3 低表達的機制可能是由于 MEG3 啟動子的高甲基化；同時體外實驗顯示，大多數膽囊癌細胞轉染了 pcDNA-MEG3 后細胞周期停滯于 G0/G1 期、p53 蛋白表達上調、cyclin D1 降低、細胞活性和克隆計數下降，注射 pcDNA-MEG3 轉染細胞后的小鼠腫瘤組織行免疫組織化學分析結果發現，Ki-67 表達水平較低，caspase-3 表達明顯上調，提示 MEG3 可抑制膽囊癌細胞增殖并促進細胞凋亡。MEG3 還與腫瘤抑制因子 p53 相互作用而抑制腫瘤的血管生成[10-11]。以上研究結果提示，MEG3 在膽囊癌中可能是抑癌基因，通過促進 p53 表達而降低 cyclin D1 表達來抑制癌細胞的生長。除此之外，最近一項研究[13]發現，MEG3 還可通過促進 EZH2 泛素化來調節下游靶基因 LATS2 的功能，從而抑制膽囊癌的增殖和侵襲。
2.1.2 lncRNA-LET
lncRNA-LET 首先在肝癌中被發現[39]，此后發現其在食管癌[40]、腎透明細胞癌[41]、乳腺癌[42]等腫瘤中表達下調。Ma 等[14]發現，在膽囊癌組織中 lncRNA-LET 表達也明顯下調，且其表達下調患者腫瘤分化較差、淋巴結轉移、臨床分期更晚和預后較差；同時研究還發現，在體外低氧或常氧條件下 lncRNA-LET 過表達可抑制膽囊癌細胞的侵襲，而在缺氧條件下 lncRNA-LET 敲低后癌細胞的侵襲潛能增加；此外，在分子水平 lncRNA-LET 過表達可導致 p21、caspase-3 表達增加、Bax/Bcl-2 比值升高（低氧條件下），從而促進膽囊癌細胞的凋亡。提示 lncRNA-LET 過表達可導致缺氧條件下細胞周期停滯在 G0/G1 期以及腫瘤細胞凋亡，從而抑制膽囊癌細胞的增殖。另有研究[15]表明，lncRNA-LET可促進 NF90 蛋白泛素化和降解，其表達下調可通過泛素-蛋白酶體途徑調節 NF90 蛋白的穩定性從而增強癌細胞侵襲性；此外，lncRNA-LET 可通過 HIF-1α/HDAC3/lncRNA -LET/NF-90 途徑誘導癌細胞侵襲和腫瘤轉移。以上研究結果提示，lncRNA-LET 可作為膽囊癌潛在治療靶點和預后的分子生物標志物。
2.1.3 GCASPC
GCASPC 是新近在膽囊癌組織中發現的一種 lncRNA，在 2 個不同的膽囊癌患者群體中均發現其表達下調，與早期腫瘤相比，在腫瘤直徑較大、TNM 分期較晚患者中 GCASPC 表達水平明顯較低，GCASPC 的表達下調和腫瘤局部浸潤是影響膽囊癌根治術后患者預后的獨立危險因素；CCK8 法分析結果表明，與空載的平行穩定細胞系相比，GCASPC 過表達降低了 SGC-996 和 NOZ 細胞的增殖能力，相反 GCASPC 敲低則使細胞的增殖能力增加，GCASPC 過表達將細胞周期阻滯在 G1－S 期；在翻譯或翻譯后水平，GCASPC 與丙酮酸羧化酶（PC，其在膽囊癌組織中表達上調）結合，通過破壞 PC 蛋白的穩定性而下調其蛋白水平和活性，從而抑制腫瘤的進展，這可能是 GCASPC 通過泛素化-蛋白酶體途徑下調 PC 蛋白豐度而實現，并且發現，miR-17-3p 與 GCASPC 具有相同的功能性結合位點，GCASPC 和 miR-17-3p 都是通過限制蛋白質穩定性來下調 PC 的水平和活性進而導致腫瘤進展[16]。結果提示，GCASPC 是膽囊癌的抑癌基因，上調其表達可以抑制腫瘤進展。
2.2 lncRNA 的致癌作用
2.2.1 H19
H19 位于人 11 號染色體 11p15.5 位置，僅表達于母體遺傳來的染色體。H19 在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤細胞系或組織中均存在過表達[43]，其表達失調與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[44]。有研究[17]發現，在膽囊癌組織中 H19 和 AKT2 表達上調，miR-194-5p 表達明顯下調，在 GBC-SD 和 NOZ 細胞中敲低 H19 后腫瘤細胞增殖能力顯著降低，細胞被阻滯在 G0/G1 期，H19 表達上調則可以顯著促進細胞進入 S 期；進一步的雙熒光素酶基因報告實驗證明，H19 和 miR-194-5p 具有相同的功能性結合位點，而 AKT2 是 miR-194-5p 直接下游靶基因。在另一項研究[18]中表明，沉默 H19 基因后 miR-342-3p 表達明顯上調，而 H19 過表達則通過競爭性“海綿”miR-342-3p 使 FOXM1（miR-342-3p 的直接下游靶基因）表達上調，進而使膽囊癌細胞侵襲和增殖。此外，H19 表達上調可促進膽囊癌細胞的 EMT，在膽囊癌細胞系和小鼠中 H19 的表達失調導致上皮細胞黏附因子E-cadherin 的表達降低，間充質細胞標志物 Vimentin和 1 種 EMT 相關轉錄因子 Twist1 的表達增加[19]。以上研究結果提示，H19/miR-194-5p/AKT2 軸和 H19/miR-342-3p/FOXM1 軸可能在調節膽囊癌的進展過程中起重要作用。
2.2.2 MALAT1
MALAT1 是細胞內含量較多且高度保守的 lncRNA，與常規剪切和聚腺苷酸化機制不同，MALAT1 的 3′末端缺少 poly（A）尾部結構，而是由 3′三重螺旋結構構成[45]。MALAT1 作為一種與肺腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤相關的生物標志物，它可能是眾多基因的轉錄調控因子（包括一些參與腫瘤轉移和細胞遷移的基因），并參與細胞周期調控且在腫瘤組織中表達明顯上調[46]，這可能與腫瘤細胞的增殖和轉移有關。Wang 等[20]研究表明，MALAT1 在膽囊癌組織中表達上調，且與 miR-363-3p 具有相同的功能性結合位點，MALAT1 可作為 miR-363-3p 的競爭性內源性 RNA 調控髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukaemia-1，MCL-1）的表達，在體外 MALAT1 沉默可降低膽囊癌細胞增殖和 S 期細胞數量、誘導細胞凋亡，在體內 MALAT1 沉默可導致腫瘤體積顯著下降，結果提示，MALAT1 可通過 MALAT1/miR-363-3p/MCL-1 軸調控膽囊癌的進展。另有研究[21]發現，MALAT1 的表達上調與膽囊癌的大小和淋巴結轉移呈正相關、與總體生存呈負相關；在一項系統評價和 meta 分析[9]中也提示 MALAT1 高表達與膽囊癌大小和淋巴結轉移顯著相關。此外，MALAT1 的表達可能是膽囊癌復發、轉移和預后的預測指標。MALAT1 表達水平、腫瘤大小和 TNM 分期是膽囊癌患者預后的獨立影響因素[47]。MALAT1 可作為 miR-206 的競爭性內源性 RNA，且 miR-206 可直接調控 ANXA2 和 K-ras的表達水平，提示 miR-206 與 MALAT1 結合在膽囊癌組織和細胞中具有致癌作用[21]。近年一項研究[22]發現，在膽囊癌組織和細胞系中 MALAT1 表達上調，而 ABI 家族成員 3 結合蛋白（ABI family member 3 binding protein，ABI3BP）表達下調，MALAT1 可通過將 EZH2 的增強子募集到 ABI3BP 啟動子區域來下調 ABI3BP 的表達，而 MALAT1 沉默或 H3K27 甲基化抑制可促進 ABI3BP 的表達，提示 MALAT1 沉默和 ABI3BP 升高通過 EZH2 誘導的 H3K27 甲基化抑制作用，從而阻礙了膽囊癌的進展。
2.2.3 HOTAIR
HOTAIR 位于 12 號染色體上的 Homeobox C（HOXC）基因簇內，并與 HOXC 基因共表達，其通過結合賴氨酸特異性脫甲基酶 1（lysine specific demethylase 1，LSD1）和多梳蛋白抑制復合體 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的 RNA 產物發揮功能，并充當在 HOXD 基因簇上組裝這些調控因子的支架，從而促進 HOXD 的表觀遺傳抑制[48]。HOTAIR 在多種腫瘤中高表達。Ma 等[23]對 65 例膽囊癌患者的研究表明，癌組織中 HOTAIR 的表達水平顯著升高，分子研究表明，HOTAIR 的表達受 c-myc 的調控，該相互作用是通過與 HOTAIR 基因上游區域中存在的 4 個假定的 c-myc 目標反應元件相互作用而實現。miRNA-130a（一種抑癌 miRNA）和 HOTAIR 具有相同的功能性結合位點，HOTAIR 的高表達可導致 miRNA-130a 的表達下調，這可能是 HOTAIR 通過增加 miRNA-130a 啟動子的甲基化狀態而導致其表達下調。以上研究結果提示，HOTAIR 在膽囊癌中具有致癌作用，其表達受 c-myc 和 miRNA-130a 共同調控。
2.2.4 CCAT1
CCAT1 是近幾年發現的致癌 lncRNA，其在多種腫瘤組織中表達上調，且與腫瘤的發生和發展密切相關。CCAT1 具有兩個相互重疊的亞型即 CCAT1-S 和 CCAT1-L，CCAT1-L 僅位于細胞核中，而 CCAT1-S 位于細胞質，CCAT1-L 表達下調可導致 CCAT1-S 表達中斷，提示 CCAT1-S可能是由 CCAT1-L 轉變而來，兩者之間可能存在正相關關系[49]。近來一項 meta 分析[50]結果顯示，CCAT1 表達上調與膽管腫瘤的預后不良密切相關。Ma 等[24]也發現在膽囊癌中 CCAT1 表達上調，且與淋巴結轉移和 TNM 分期較晚相關，CCAT1 對 miRNA-218-5p 具有負性調控作用。既往研究[25]表明，miRNA-218-5p 通過靶向作用于多梳家族基因 Bmi1來抑制腫瘤的侵襲、遷移和增殖；此外 CCAT1 和 Bmi1 在 miRNA 基因中共享相同的反應元件且均依賴 miRNA-218-5p 的調控，在膽囊癌中 CCAT1 可通過對 miRNA-218-5p 的負性調控促進腫瘤的發生及發展[24]。以上研究結果提示，CCAT1 在膽囊癌中的具體作用機制仍不清，不過 CCAT1 可能作為競爭性內源性 RNA 網絡的一部分，在幫助研究膽囊癌惡性生物學行為過程中提供了寶貴的研究基礎。
2.2.5 ANRIL
ANRIL 首次在家族性黑色素瘤患者中被發現，位于人染色體 9p21 的 CDKN2B-CDKN2A 基因簇內[51]，目前在多種惡性腫瘤中均發現 ANRIL 表達失調。Liu 等[12]對 84 例膽囊癌患者的 ANRIL 表達水平檢測發現，與周圍正常組織相比，癌組織內 ANRIL 的表達明顯上調，進一步研究發現，ANRIL 表達水平較高的患者總體生存率較低，但未發現其表達與患者年齡、組織學類型、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移等相關；同時在 GBC-SD 細胞中過表達 ANRIL 明顯增加了細胞增殖、細胞集落生長和 S 期細胞數量；同樣，對 5 周齡雄性無胸腺 BALB/c 小鼠注射 pcDNA-ANRIL 載體，其腫瘤生長體積明顯比空白載體組大；免疫組化分析發現，過表達 ANRIL 的小鼠組織 Ki-67 表達升高，caspase-3 蛋白表達降低。結果提示，ANRIL 具有抑制膽囊癌細胞凋亡、促進細胞增殖的作用，其是膽囊癌的致癌基因，下調其表達可能被認為是抑制膽囊癌進展的潛在治療策略。
2.2.6 LINC00152
LINC00152 也稱 CYTOR（cytoskeleton regulator RNA，細胞骨架調節 RNA），在許多類型的人類腫瘤組織中特別是在消化系統的惡性腫瘤中高表達并促進細胞增殖和 EMT，該 RNA 可以結合 EZH2 的增強子并參與腫瘤抑制基因的轉錄沉默，LINC00152 可以充當 microRNA 的分子海綿[52]。Cai 等[26]研究表明，LINC00152 在膽囊癌組織中高表達且與腫瘤進展、淋巴結轉移和 TNM 分期呈正相關；同時發現，LINC00152 過表達在體外可顯著促進膽囊癌細胞增殖、轉移和抑制細胞凋亡，在體內可顯著促進腫瘤生長，其機制分析表明，LINC00152 可參與磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路；此外，SP1 直接與 LINC00152 啟動子結合并正向調控其在膽囊癌細胞中的表達。結果提示，在膽囊癌中 LINC00152 具有致癌潛能，SP1/LINC00152/PI3K/AKT可能是膽囊癌潛在的治療靶點。另一項研究[27]也表明，LINC00152 在膽囊癌中表達上調，在體外促進細胞遷移、侵襲和 EMT 進程，在體內促進了腫瘤的腹膜擴散和轉移，其機制分析表明，LINC00152 充當miR-138 的分子海綿，miR-138 可直接抑制缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達，miR-138 可作為膽囊癌的抑癌基因。結果提示，LINC00152 可能是經由 LINC00152/miR-138/HIF-1α 通路促進膽囊癌的進展。
2.2.7 MINCR
Doose 等[53]在 IG-MYC 陽性的伯基特淋巴瘤患者中首次報道了 MINCR。MINCR 位于 8q24.3 號染色體上 GLI4 和 ZNF696 兩個編碼基因之間，其距離分別為 3 和 9.5 kb，是一種致癌基因。近年來發現 MINCR 在膽囊癌[28]、肝細胞癌[54]、非小細胞肺癌[55]和口腔鱗癌[56]中表達上調。MINCR 和 miR-26a-5p 具有相同的功能性結合位點，在膽囊癌組織中 MINCR 表達上調可引起 miR-26a-5p 表達水平明顯下調，此外 EZH2 在膽囊癌組織中呈現出高表達狀態并促進膽囊癌的細胞侵襲和增殖，這是由于 EZH2 促進了膽囊癌細胞的 EMT，其機制分析表明，MINCR 是通過負性調控 miR-26a-5p 從而刺激 EZH2 表達；同時在研究中還觀察到在膽囊癌細胞中 MINCR 過表達顯著降低了 E-cadherin 蛋白的表達水平，但增加了 Vimentin 蛋白的表達[28]。結果提示，MINCR 在膽囊癌中具有促癌作用，可能通過 MINCR/miR-26a-5p/ EZH2 途徑促進腫瘤進展。
2.2.8 AFAP1-AS1
AFAP1-AS1 長度為 6 810 bp，位于人類 4 號染色體的 4p16.1 區域，AFAP1-AS1 是由 AFAP1 基因反向轉錄而來，在 AFAP1-AS1 和 AFAP1的外顯子之間包含多個重疊和互補區域[57]。AFAP1-AS1 是與腫瘤相關的 lncRNA，發現其在膽管癌、膽囊癌、肝細胞癌等十余種惡性腫瘤異常表達[57-58]；此外，AFAP1-AS1 的表達失調與致癌性、總生存期、無病生存期、無進展生存期以及腫瘤進展相關，包括淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分級、腫瘤大小和腫瘤分期[58]。Ma 等[29]通過 qRT-PCR 分析了 40 例膽囊癌組織和鄰近正常組織發現 AFAP1-AS1 在膽囊癌組織中表達水平明顯升高，其表達水平與腫瘤大小顯著相關，其高表達提示患者預后不良；同時發現，AFAP1-AS1 表達下調可抑制 NOZ 和 GBC-SD 細胞的增殖和侵襲，其表達下調可通過下調轉錄因子 Twist1 和 Vimentin、上調 E-cadherin 來抑制 EMT。結果提示，AFAP1-AS1 在膽囊癌中有致癌作用，其表達失調可引起腫瘤細胞的增殖和侵襲，但是其具體作用機制仍需進一步研究加以闡述。
2.2.9 UCA1
UCA1 在人膀胱癌細胞系中首次被發現，長度為 1.4 kb，其表達上調可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和化學耐藥[59]。Cai 等[30]研究顯示，在膽囊癌中 UCA1 明顯過表達且與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期及預后不良呈正相關；同時發現，在體外 UCA1 可通過調控細胞周期和細胞凋亡促進膽囊癌細胞的增殖，從而促進膽囊癌進展，進一步研究表明，敲低 UCA1 可上調 E-cadherin和 p21 在 NOZ 細胞中的表達，其機制分析表明，UCA1 通過將 EZH2 募集到 p21 和 E-cadherin 啟動子區域來抑制其轉錄，從而促進膽囊癌細胞的增殖和轉移[30]。結果提示，UCA1/EZH2/p21 和 E-cadherin軸在膽囊癌細胞增殖中起重要作用。
2.2.10 PVT1
PVT1 是已知的在癌變過程中具有多種功能的 lncRNA，因與小鼠漿細胞瘤可變易位 1（PVT1）基因具有同源性而命名，該基因過表達與許多類型的腫瘤相關，包括乳腺癌、卵巢癌、急性髓系白血病和霍奇金淋巴瘤；且其在腫瘤發生過程中，PVT1 的轉錄受 p53（腫瘤抑制因子）通過典型的 p53 結合位點調控且與 myc（原癌基因）的表達相關[60]。Chen 等[31]研究發現，在膽囊癌組織中 PVT1 明顯高表達且與晚期腫瘤、淋巴結轉移、遠處轉移和不良預后相關；同時體外研究發現，PVT1 表達上調，促進細胞增殖、遷移和浸潤并抑制體內腫瘤的生長，其機制分析表明，PVT1 是通過競爭性結合 miR-143，從而正向調控 HK2 的表達；此外，敲低 PVT1 后 GBC-SD 細胞中 HK2 的表達顯著降低，但轉染 miR-143 抑制劑后，其表達水平明顯上調。結果提示，PVT1 可能通過 miR-143/HK2 軸誘導膽囊癌細胞增殖、遷移和侵襲，從而促進膽囊癌進展。
2.2.11 NEAT1
NEAT1 是一種新型 lncRNA，位于核內并參與構成核旁斑的核心結構[61]，核旁斑是在細胞核染色質間隙內發現的形狀不規則的間隔[62]。核旁斑可在細胞分化、病毒感染等多個生物學過程中起調控基因表達的作用[63]。NEAT1 是一種與腫瘤進展相關的轉錄調節因子[61]，通過與遠端調控元件相互作用調控 PI3K-AKT 信號通路中 13.3% 的基因[6]。研究[64-67]已經證實，在胃癌、膽管癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌等多種實體腫瘤中存在 NEAT1 的表達失調。最近筆者團隊一項研究[36]表明，NEAT1 在膽囊癌組織中表達上調，可通過 NEAT1/miRNA-335/survivin 軸在體外促進腫瘤細胞侵襲和轉移，在體內促進癌細胞生長，在該研究中雖然探討了 NEAT1、miR-335 和 survivin 共同參與調控膽囊癌的發生與進展，但是還沒有進一步闡明 NEAT1 和 miR-335 以及 miR-335 和 survivin 之間的具體作用機制，在此過程中可以采取何種措施或手段干擾其作用進而阻止腫瘤發生或發展，這是需要進一步闡明的問題。
2.2.12 其他 lncRNA
近年來，在關于膽囊癌相關的 lncRNA 研究中還發現，PAGBC、LOC344887、ROR、HEGBC 在腫瘤組織中表達上調且與膽囊癌的惡性生物學行為密切相關，如 Wu 等[32]研究發現，PAGBC 作為競爭性內源性 RNA 可與 miR-133b 和 miR-511（抑癌基因）競爭性結合，從而促進膽囊癌細胞的增殖、轉移以及激活 Akt/mTOR 通路；Wu 等[33]研究發現，LOC344887 在膽囊癌的腫瘤細胞增殖和 EMT 過程中起重要作用，這可能作為膽囊癌治療過程中的一個潛在靶點；Wang 等[34]發現，ROR 通過介導 EMT 促進膽囊癌的惡性生物學行為；Yang 等[35]發現，HEGBC 通過與 IL-11/STAT3 信號通路形成正反饋回路，從而促進膽囊癌的發生和轉移。
3 lncRNA 對腫瘤微環境的調控
腫瘤微環境是一個由成纖維細胞、內皮細胞、腫瘤浸潤免疫細胞等基質細胞組成的復雜生理生化系統，在腫瘤的發生、發展和轉移過程中起著重要作用[68]。lncRNA 可直接或間接參與基質細胞和腫瘤細胞之間的相互作用，然而在這些細胞中 lncRNA 的異常表達可能會促進腫瘤發生。在成纖維細胞中 lncRNA-ZEB2NAT（膀胱癌）、lncRNA HOTAIR（乳腺癌）、lncRNA-CAF（口腔鱗癌）、LINC00092（卵巢癌細胞）表達失調與細胞 EMT、腫瘤細胞增殖和維持成纖維細胞的功能密切相關[69]；在膠質瘤中 H19 表達失調并與血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成相關[70]；APC1 則通過降低 Rab5b mRNA 表達的穩定性而降低結直腸癌細胞外泌體的產生來抑制內皮細胞中 MAPK 通路的過度激活從而抑制腫瘤血管生成[71]；此外，CCAT1、NIFK-AS1、MM2P、LNMAT1 和 lnc-BM（長鏈非編碼腦轉移瘤）在腫瘤相關巨噬細胞中表達，lnc-chop、lnc-C/EBPβ 和 lncRNA Pvt1 在髓源性抑制細胞中表達，lnc-Tim3 和 lnc-sox5 在 CD8+ T 細胞中表達，lnc-EGFR（表皮生長因子受體）和 lncRNA SNHG1（小核糖體管家基因 RNA1）在調節 T 細胞中表達。以上所有這些 lncRNA 在腫瘤浸潤免疫細胞中的異常表達與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲、腫瘤血管生成、EMT 和腫瘤轉移相關[69]。雖然在許多人類腫瘤中均發現 lncRNA 參與腫瘤微環境的調控，但是 lncRNA 對膽囊癌微環境的調控仍然缺乏系統性研究，還需進一步闡明。
4 小結與展望
通過文獻復習，本綜述共總結了 19 種與膽囊癌生物學行為相關的 lncRNA， 大多數 lncRNA 傾向于具有致癌特性（僅 3 種具有抑癌作用）。通過了解 lncRNA 在惡性腫瘤發展和進程中的作用，可以制定預防和（或）治療膽囊癌的策略。在人類多種腫瘤中均發現 lncRNA 表達失調，并且發現少數 lncRNA 可在患者的血清或尿液中特異性表達，提示這部分 lncRNA 有望成為腫瘤診斷和預后的生物標志物。目前針對 lncRNA 作為腫瘤的生物標志物研究仍處于臨床試驗階段，其臨床應用仍然存在許多挑戰。lncRNA 在不同類型的腫瘤中存在表達失調并與腫瘤發生、侵襲和分期相關，可作為潛在的腫瘤治療靶點。因此，可通過使 lncRNA 轉錄產物降解或不穩定、改變 lncRNA 編碼的啟動子活性來調節其轉錄、阻斷 lncRNA 與調控因子的相互作用或使用適配子破壞 lncRNA 的功能，從而靶向 lncRNA 來調節其表達，這可能是一種有效阻斷腫瘤進展的治療方式，但目前在膽囊癌中仍沒有針對于 lncRNA 的靶向藥物。雖然總結了各種 lncRNA 的促進或抑制腫瘤發生、發展的機制和作用，但是目前對于其機制的研究仍然是有限的。因此，對于膽囊癌的靶向治療策略的制定仍然存在巨大挑戰，特別是對于無癥狀膽囊癌的診斷和后續治療。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊發才選題并撰寫和修改文章；李敬東和邱應和在論文指導中提出了批判性的修改意見，具有同等貢獻。
膽囊癌是膽管系統惡性腫瘤中的首位致死因素。由于膽囊癌的惡性程度高、增殖轉移活性強，因此，其病程進展迅速，致患者臨床預后通常很差[1-2]。膽囊癌發生、發展、侵襲、轉移的調控機制非常復雜，與一系列信號通路激活密切相關，是一個由多因素參與、多階段遞增的復雜過程[2-3]。因此，深入研究和篩選膽囊癌發病相關分子機制和分子靶標及建立并優化的綜合性治療策略是改善膽囊癌患者預后的重要方面。人類基因組中大部分非編碼基因曾被認為是“垃圾 DNA”，然而隨著高通量技術（如新一代測序技術）的發展以及對非編碼基因組的深入研究，這一觀點已經被徹底改變。盡管只有不到 2% 的人類基因組編碼蛋白質，但大多數人類基因組都可以被轉錄為非編碼 RNA 且這些非編碼 RNA 與基因表達、調控密切相關[4]。在各種類型非編碼 RNA 中，長鏈非編碼（long non-coding，lnc）RNA（lncRNA）受到越來越多的關注，其是一類長度超過 200 個核苷酸、不能翻譯為蛋白質的非編碼 RNA[5]。對 lncRNA 靶基因的功能分析揭示，lncRNA 可通過結合啟動子和遠端調控元件來發揮其功能[6-7]。近年來研究[8]發現，包括膽囊癌在內的多種實體腫瘤中均發現了特定的 lncRNA 異常表達且與腫瘤的發生及發展相關。因此，現就近年來 lncRNA 對膽囊癌惡性生物學行為調節的研究進展作一綜述，以期為 lncRNA 與膽囊癌的相關研究提供一定的參考。
1 lncRNA 與膽囊癌的惡性生物學行為相關
目前已發現多種 lncRNA 與膽囊癌的發生和進展密切相關[9]。將膽囊癌相關 lncRNA 在調節腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、“海綿化”miRNAs、化療抵抗等方面發揮的重要作用進行了匯總[10-37]，見表 1。其中 MEG3[10-13]、lncRNA-LET[14-15]和 GCASPC[16]在膽囊癌組織中表達下調并具有抑癌作用；H19[17-19]、MALAT1[20-22]、HOTAIR[23]、CCAT1[24-25]、ANRIL[12]、LINC00152[26-27]、MINCR[28]、AFAP1-AS1[29]、UCA1[30]、PVT1[31]、PAGBC[32]、Loc344887[33]、ROR[34]、HEGBC[35]則在腫瘤組織中表達上調并促進腫瘤的進展，具有促癌作用。另外，筆者團隊最近一項研究[36]提示 lncRNA NEAT1 在膽囊癌組織中表達上調且具有致癌作用。此外，lncRNA ENST00000425894 在對膽囊癌的化療抵抗方面也具有重要作用[37]。
表1
與膽囊癌相關 lncRNAs 的生物學功能及影響途徑
2 膽囊癌中 lncRNA 的作用機制
2.1 lncRNA 的抑癌作用
2.1.1 MEG3
MEG3 為母系表達的印跡基因，從該基因可轉錄多個選擇性剪接的轉錄變體，均是 lncRNA。MEG3 基因在多種正常組織中表達，但是在不同組織起源的多個癌細胞系中表達降低[38]。Liu 等[12]發現，MEG3 在膽囊癌組織中表達較其在正常組織中顯著降低，其低表達提示預后不良，導致膽囊癌中 MEG3 低表達的機制可能是由于 MEG3 啟動子的高甲基化；同時體外實驗顯示，大多數膽囊癌細胞轉染了 pcDNA-MEG3 后細胞周期停滯于 G0/G1 期、p53 蛋白表達上調、cyclin D1 降低、細胞活性和克隆計數下降，注射 pcDNA-MEG3 轉染細胞后的小鼠腫瘤組織行免疫組織化學分析結果發現，Ki-67 表達水平較低，caspase-3 表達明顯上調，提示 MEG3 可抑制膽囊癌細胞增殖并促進細胞凋亡。MEG3 還與腫瘤抑制因子 p53 相互作用而抑制腫瘤的血管生成[10-11]。以上研究結果提示，MEG3 在膽囊癌中可能是抑癌基因，通過促進 p53 表達而降低 cyclin D1 表達來抑制癌細胞的生長。除此之外，最近一項研究[13]發現，MEG3 還可通過促進 EZH2 泛素化來調節下游靶基因 LATS2 的功能，從而抑制膽囊癌的增殖和侵襲。
2.1.2 lncRNA-LET
lncRNA-LET 首先在肝癌中被發現[39]，此后發現其在食管癌[40]、腎透明細胞癌[41]、乳腺癌[42]等腫瘤中表達下調。Ma 等[14]發現，在膽囊癌組織中 lncRNA-LET 表達也明顯下調，且其表達下調患者腫瘤分化較差、淋巴結轉移、臨床分期更晚和預后較差；同時研究還發現，在體外低氧或常氧條件下 lncRNA-LET 過表達可抑制膽囊癌細胞的侵襲，而在缺氧條件下 lncRNA-LET 敲低后癌細胞的侵襲潛能增加；此外，在分子水平 lncRNA-LET 過表達可導致 p21、caspase-3 表達增加、Bax/Bcl-2 比值升高（低氧條件下），從而促進膽囊癌細胞的凋亡。提示 lncRNA-LET 過表達可導致缺氧條件下細胞周期停滯在 G0/G1 期以及腫瘤細胞凋亡，從而抑制膽囊癌細胞的增殖。另有研究[15]表明，lncRNA-LET可促進 NF90 蛋白泛素化和降解，其表達下調可通過泛素-蛋白酶體途徑調節 NF90 蛋白的穩定性從而增強癌細胞侵襲性；此外，lncRNA-LET 可通過 HIF-1α/HDAC3/lncRNA -LET/NF-90 途徑誘導癌細胞侵襲和腫瘤轉移。以上研究結果提示，lncRNA-LET 可作為膽囊癌潛在治療靶點和預后的分子生物標志物。
2.1.3 GCASPC
GCASPC 是新近在膽囊癌組織中發現的一種 lncRNA，在 2 個不同的膽囊癌患者群體中均發現其表達下調，與早期腫瘤相比，在腫瘤直徑較大、TNM 分期較晚患者中 GCASPC 表達水平明顯較低，GCASPC 的表達下調和腫瘤局部浸潤是影響膽囊癌根治術后患者預后的獨立危險因素；CCK8 法分析結果表明，與空載的平行穩定細胞系相比，GCASPC 過表達降低了 SGC-996 和 NOZ 細胞的增殖能力，相反 GCASPC 敲低則使細胞的增殖能力增加，GCASPC 過表達將細胞周期阻滯在 G1－S 期；在翻譯或翻譯后水平，GCASPC 與丙酮酸羧化酶（PC，其在膽囊癌組織中表達上調）結合，通過破壞 PC 蛋白的穩定性而下調其蛋白水平和活性，從而抑制腫瘤的進展，這可能是 GCASPC 通過泛素化-蛋白酶體途徑下調 PC 蛋白豐度而實現，并且發現，miR-17-3p 與 GCASPC 具有相同的功能性結合位點，GCASPC 和 miR-17-3p 都是通過限制蛋白質穩定性來下調 PC 的水平和活性進而導致腫瘤進展[16]。結果提示，GCASPC 是膽囊癌的抑癌基因，上調其表達可以抑制腫瘤進展。
2.2 lncRNA 的致癌作用
2.2.1 H19
H19 位于人 11 號染色體 11p15.5 位置，僅表達于母體遺傳來的染色體。H19 在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤細胞系或組織中均存在過表達[43]，其表達失調與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[44]。有研究[17]發現，在膽囊癌組織中 H19 和 AKT2 表達上調，miR-194-5p 表達明顯下調，在 GBC-SD 和 NOZ 細胞中敲低 H19 后腫瘤細胞增殖能力顯著降低，細胞被阻滯在 G0/G1 期，H19 表達上調則可以顯著促進細胞進入 S 期；進一步的雙熒光素酶基因報告實驗證明，H19 和 miR-194-5p 具有相同的功能性結合位點，而 AKT2 是 miR-194-5p 直接下游靶基因。在另一項研究[18]中表明，沉默 H19 基因后 miR-342-3p 表達明顯上調，而 H19 過表達則通過競爭性“海綿”miR-342-3p 使 FOXM1（miR-342-3p 的直接下游靶基因）表達上調，進而使膽囊癌細胞侵襲和增殖。此外，H19 表達上調可促進膽囊癌細胞的 EMT，在膽囊癌細胞系和小鼠中 H19 的表達失調導致上皮細胞黏附因子E-cadherin 的表達降低，間充質細胞標志物 Vimentin和 1 種 EMT 相關轉錄因子 Twist1 的表達增加[19]。以上研究結果提示，H19/miR-194-5p/AKT2 軸和 H19/miR-342-3p/FOXM1 軸可能在調節膽囊癌的進展過程中起重要作用。
2.2.2 MALAT1
MALAT1 是細胞內含量較多且高度保守的 lncRNA，與常規剪切和聚腺苷酸化機制不同，MALAT1 的 3′末端缺少 poly（A）尾部結構，而是由 3′三重螺旋結構構成[45]。MALAT1 作為一種與肺腺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤相關的生物標志物，它可能是眾多基因的轉錄調控因子（包括一些參與腫瘤轉移和細胞遷移的基因），并參與細胞周期調控且在腫瘤組織中表達明顯上調[46]，這可能與腫瘤細胞的增殖和轉移有關。Wang 等[20]研究表明，MALAT1 在膽囊癌組織中表達上調，且與 miR-363-3p 具有相同的功能性結合位點，MALAT1 可作為 miR-363-3p 的競爭性內源性 RNA 調控髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukaemia-1，MCL-1）的表達，在體外 MALAT1 沉默可降低膽囊癌細胞增殖和 S 期細胞數量、誘導細胞凋亡，在體內 MALAT1 沉默可導致腫瘤體積顯著下降，結果提示，MALAT1 可通過 MALAT1/miR-363-3p/MCL-1 軸調控膽囊癌的進展。另有研究[21]發現，MALAT1 的表達上調與膽囊癌的大小和淋巴結轉移呈正相關、與總體生存呈負相關；在一項系統評價和 meta 分析[9]中也提示 MALAT1 高表達與膽囊癌大小和淋巴結轉移顯著相關。此外，MALAT1 的表達可能是膽囊癌復發、轉移和預后的預測指標。MALAT1 表達水平、腫瘤大小和 TNM 分期是膽囊癌患者預后的獨立影響因素[47]。MALAT1 可作為 miR-206 的競爭性內源性 RNA，且 miR-206 可直接調控 ANXA2 和 K-ras的表達水平，提示 miR-206 與 MALAT1 結合在膽囊癌組織和細胞中具有致癌作用[21]。近年一項研究[22]發現，在膽囊癌組織和細胞系中 MALAT1 表達上調，而 ABI 家族成員 3 結合蛋白（ABI family member 3 binding protein，ABI3BP）表達下調，MALAT1 可通過將 EZH2 的增強子募集到 ABI3BP 啟動子區域來下調 ABI3BP 的表達，而 MALAT1 沉默或 H3K27 甲基化抑制可促進 ABI3BP 的表達，提示 MALAT1 沉默和 ABI3BP 升高通過 EZH2 誘導的 H3K27 甲基化抑制作用，從而阻礙了膽囊癌的進展。
2.2.3 HOTAIR
HOTAIR 位于 12 號染色體上的 Homeobox C（HOXC）基因簇內，并與 HOXC 基因共表達，其通過結合賴氨酸特異性脫甲基酶 1（lysine specific demethylase 1，LSD1）和多梳蛋白抑制復合體 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的 RNA 產物發揮功能，并充當在 HOXD 基因簇上組裝這些調控因子的支架，從而促進 HOXD 的表觀遺傳抑制[48]。HOTAIR 在多種腫瘤中高表達。Ma 等[23]對 65 例膽囊癌患者的研究表明，癌組織中 HOTAIR 的表達水平顯著升高，分子研究表明，HOTAIR 的表達受 c-myc 的調控，該相互作用是通過與 HOTAIR 基因上游區域中存在的 4 個假定的 c-myc 目標反應元件相互作用而實現。miRNA-130a（一種抑癌 miRNA）和 HOTAIR 具有相同的功能性結合位點，HOTAIR 的高表達可導致 miRNA-130a 的表達下調，這可能是 HOTAIR 通過增加 miRNA-130a 啟動子的甲基化狀態而導致其表達下調。以上研究結果提示，HOTAIR 在膽囊癌中具有致癌作用，其表達受 c-myc 和 miRNA-130a 共同調控。
2.2.4 CCAT1
CCAT1 是近幾年發現的致癌 lncRNA，其在多種腫瘤組織中表達上調，且與腫瘤的發生和發展密切相關。CCAT1 具有兩個相互重疊的亞型即 CCAT1-S 和 CCAT1-L，CCAT1-L 僅位于細胞核中，而 CCAT1-S 位于細胞質，CCAT1-L 表達下調可導致 CCAT1-S 表達中斷，提示 CCAT1-S可能是由 CCAT1-L 轉變而來，兩者之間可能存在正相關關系[49]。近來一項 meta 分析[50]結果顯示，CCAT1 表達上調與膽管腫瘤的預后不良密切相關。Ma 等[24]也發現在膽囊癌中 CCAT1 表達上調，且與淋巴結轉移和 TNM 分期較晚相關，CCAT1 對 miRNA-218-5p 具有負性調控作用。既往研究[25]表明，miRNA-218-5p 通過靶向作用于多梳家族基因 Bmi1來抑制腫瘤的侵襲、遷移和增殖；此外 CCAT1 和 Bmi1 在 miRNA 基因中共享相同的反應元件且均依賴 miRNA-218-5p 的調控，在膽囊癌中 CCAT1 可通過對 miRNA-218-5p 的負性調控促進腫瘤的發生及發展[24]。以上研究結果提示，CCAT1 在膽囊癌中的具體作用機制仍不清，不過 CCAT1 可能作為競爭性內源性 RNA 網絡的一部分，在幫助研究膽囊癌惡性生物學行為過程中提供了寶貴的研究基礎。
2.2.5 ANRIL
ANRIL 首次在家族性黑色素瘤患者中被發現，位于人染色體 9p21 的 CDKN2B-CDKN2A 基因簇內[51]，目前在多種惡性腫瘤中均發現 ANRIL 表達失調。Liu 等[12]對 84 例膽囊癌患者的 ANRIL 表達水平檢測發現，與周圍正常組織相比，癌組織內 ANRIL 的表達明顯上調，進一步研究發現，ANRIL 表達水平較高的患者總體生存率較低，但未發現其表達與患者年齡、組織學類型、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移等相關；同時在 GBC-SD 細胞中過表達 ANRIL 明顯增加了細胞增殖、細胞集落生長和 S 期細胞數量；同樣，對 5 周齡雄性無胸腺 BALB/c 小鼠注射 pcDNA-ANRIL 載體，其腫瘤生長體積明顯比空白載體組大；免疫組化分析發現，過表達 ANRIL 的小鼠組織 Ki-67 表達升高，caspase-3 蛋白表達降低。結果提示，ANRIL 具有抑制膽囊癌細胞凋亡、促進細胞增殖的作用，其是膽囊癌的致癌基因，下調其表達可能被認為是抑制膽囊癌進展的潛在治療策略。
2.2.6 LINC00152
LINC00152 也稱 CYTOR（cytoskeleton regulator RNA，細胞骨架調節 RNA），在許多類型的人類腫瘤組織中特別是在消化系統的惡性腫瘤中高表達并促進細胞增殖和 EMT，該 RNA 可以結合 EZH2 的增強子并參與腫瘤抑制基因的轉錄沉默，LINC00152 可以充當 microRNA 的分子海綿[52]。Cai 等[26]研究表明，LINC00152 在膽囊癌組織中高表達且與腫瘤進展、淋巴結轉移和 TNM 分期呈正相關；同時發現，LINC00152 過表達在體外可顯著促進膽囊癌細胞增殖、轉移和抑制細胞凋亡，在體內可顯著促進腫瘤生長，其機制分析表明，LINC00152 可參與磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路；此外，SP1 直接與 LINC00152 啟動子結合并正向調控其在膽囊癌細胞中的表達。結果提示，在膽囊癌中 LINC00152 具有致癌潛能，SP1/LINC00152/PI3K/AKT可能是膽囊癌潛在的治療靶點。另一項研究[27]也表明，LINC00152 在膽囊癌中表達上調，在體外促進細胞遷移、侵襲和 EMT 進程，在體內促進了腫瘤的腹膜擴散和轉移，其機制分析表明，LINC00152 充當miR-138 的分子海綿，miR-138 可直接抑制缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達，miR-138 可作為膽囊癌的抑癌基因。結果提示，LINC00152 可能是經由 LINC00152/miR-138/HIF-1α 通路促進膽囊癌的進展。
2.2.7 MINCR
Doose 等[53]在 IG-MYC 陽性的伯基特淋巴瘤患者中首次報道了 MINCR。MINCR 位于 8q24.3 號染色體上 GLI4 和 ZNF696 兩個編碼基因之間，其距離分別為 3 和 9.5 kb，是一種致癌基因。近年來發現 MINCR 在膽囊癌[28]、肝細胞癌[54]、非小細胞肺癌[55]和口腔鱗癌[56]中表達上調。MINCR 和 miR-26a-5p 具有相同的功能性結合位點，在膽囊癌組織中 MINCR 表達上調可引起 miR-26a-5p 表達水平明顯下調，此外 EZH2 在膽囊癌組織中呈現出高表達狀態并促進膽囊癌的細胞侵襲和增殖，這是由于 EZH2 促進了膽囊癌細胞的 EMT，其機制分析表明，MINCR 是通過負性調控 miR-26a-5p 從而刺激 EZH2 表達；同時在研究中還觀察到在膽囊癌細胞中 MINCR 過表達顯著降低了 E-cadherin 蛋白的表達水平，但增加了 Vimentin 蛋白的表達[28]。結果提示，MINCR 在膽囊癌中具有促癌作用，可能通過 MINCR/miR-26a-5p/ EZH2 途徑促進腫瘤進展。
2.2.8 AFAP1-AS1
AFAP1-AS1 長度為 6 810 bp，位于人類 4 號染色體的 4p16.1 區域，AFAP1-AS1 是由 AFAP1 基因反向轉錄而來，在 AFAP1-AS1 和 AFAP1的外顯子之間包含多個重疊和互補區域[57]。AFAP1-AS1 是與腫瘤相關的 lncRNA，發現其在膽管癌、膽囊癌、肝細胞癌等十余種惡性腫瘤異常表達[57-58]；此外，AFAP1-AS1 的表達失調與致癌性、總生存期、無病生存期、無進展生存期以及腫瘤進展相關，包括淋巴結轉移、遠處轉移、組織學分級、腫瘤大小和腫瘤分期[58]。Ma 等[29]通過 qRT-PCR 分析了 40 例膽囊癌組織和鄰近正常組織發現 AFAP1-AS1 在膽囊癌組織中表達水平明顯升高，其表達水平與腫瘤大小顯著相關，其高表達提示患者預后不良；同時發現，AFAP1-AS1 表達下調可抑制 NOZ 和 GBC-SD 細胞的增殖和侵襲，其表達下調可通過下調轉錄因子 Twist1 和 Vimentin、上調 E-cadherin 來抑制 EMT。結果提示，AFAP1-AS1 在膽囊癌中有致癌作用，其表達失調可引起腫瘤細胞的增殖和侵襲，但是其具體作用機制仍需進一步研究加以闡述。
2.2.9 UCA1
UCA1 在人膀胱癌細胞系中首次被發現，長度為 1.4 kb，其表達上調可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和化學耐藥[59]。Cai 等[30]研究顯示，在膽囊癌中 UCA1 明顯過表達且與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期及預后不良呈正相關；同時發現，在體外 UCA1 可通過調控細胞周期和細胞凋亡促進膽囊癌細胞的增殖，從而促進膽囊癌進展，進一步研究表明，敲低 UCA1 可上調 E-cadherin和 p21 在 NOZ 細胞中的表達，其機制分析表明，UCA1 通過將 EZH2 募集到 p21 和 E-cadherin 啟動子區域來抑制其轉錄，從而促進膽囊癌細胞的增殖和轉移[30]。結果提示，UCA1/EZH2/p21 和 E-cadherin軸在膽囊癌細胞增殖中起重要作用。
2.2.10 PVT1
PVT1 是已知的在癌變過程中具有多種功能的 lncRNA，因與小鼠漿細胞瘤可變易位 1（PVT1）基因具有同源性而命名，該基因過表達與許多類型的腫瘤相關，包括乳腺癌、卵巢癌、急性髓系白血病和霍奇金淋巴瘤；且其在腫瘤發生過程中，PVT1 的轉錄受 p53（腫瘤抑制因子）通過典型的 p53 結合位點調控且與 myc（原癌基因）的表達相關[60]。Chen 等[31]研究發現，在膽囊癌組織中 PVT1 明顯高表達且與晚期腫瘤、淋巴結轉移、遠處轉移和不良預后相關；同時體外研究發現，PVT1 表達上調，促進細胞增殖、遷移和浸潤并抑制體內腫瘤的生長，其機制分析表明，PVT1 是通過競爭性結合 miR-143，從而正向調控 HK2 的表達；此外，敲低 PVT1 后 GBC-SD 細胞中 HK2 的表達顯著降低，但轉染 miR-143 抑制劑后，其表達水平明顯上調。結果提示，PVT1 可能通過 miR-143/HK2 軸誘導膽囊癌細胞增殖、遷移和侵襲，從而促進膽囊癌進展。
2.2.11 NEAT1
NEAT1 是一種新型 lncRNA，位于核內并參與構成核旁斑的核心結構[61]，核旁斑是在細胞核染色質間隙內發現的形狀不規則的間隔[62]。核旁斑可在細胞分化、病毒感染等多個生物學過程中起調控基因表達的作用[63]。NEAT1 是一種與腫瘤進展相關的轉錄調節因子[61]，通過與遠端調控元件相互作用調控 PI3K-AKT 信號通路中 13.3% 的基因[6]。研究[64-67]已經證實，在胃癌、膽管癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌等多種實體腫瘤中存在 NEAT1 的表達失調。最近筆者團隊一項研究[36]表明，NEAT1 在膽囊癌組織中表達上調，可通過 NEAT1/miRNA-335/survivin 軸在體外促進腫瘤細胞侵襲和轉移，在體內促進癌細胞生長，在該研究中雖然探討了 NEAT1、miR-335 和 survivin 共同參與調控膽囊癌的發生與進展，但是還沒有進一步闡明 NEAT1 和 miR-335 以及 miR-335 和 survivin 之間的具體作用機制，在此過程中可以采取何種措施或手段干擾其作用進而阻止腫瘤發生或發展，這是需要進一步闡明的問題。
2.2.12 其他 lncRNA
近年來，在關于膽囊癌相關的 lncRNA 研究中還發現，PAGBC、LOC344887、ROR、HEGBC 在腫瘤組織中表達上調且與膽囊癌的惡性生物學行為密切相關，如 Wu 等[32]研究發現，PAGBC 作為競爭性內源性 RNA 可與 miR-133b 和 miR-511（抑癌基因）競爭性結合，從而促進膽囊癌細胞的增殖、轉移以及激活 Akt/mTOR 通路；Wu 等[33]研究發現，LOC344887 在膽囊癌的腫瘤細胞增殖和 EMT 過程中起重要作用，這可能作為膽囊癌治療過程中的一個潛在靶點；Wang 等[34]發現，ROR 通過介導 EMT 促進膽囊癌的惡性生物學行為；Yang 等[35]發現，HEGBC 通過與 IL-11/STAT3 信號通路形成正反饋回路，從而促進膽囊癌的發生和轉移。
3 lncRNA 對腫瘤微環境的調控
腫瘤微環境是一個由成纖維細胞、內皮細胞、腫瘤浸潤免疫細胞等基質細胞組成的復雜生理生化系統，在腫瘤的發生、發展和轉移過程中起著重要作用[68]。lncRNA 可直接或間接參與基質細胞和腫瘤細胞之間的相互作用，然而在這些細胞中 lncRNA 的異常表達可能會促進腫瘤發生。在成纖維細胞中 lncRNA-ZEB2NAT（膀胱癌）、lncRNA HOTAIR（乳腺癌）、lncRNA-CAF（口腔鱗癌）、LINC00092（卵巢癌細胞）表達失調與細胞 EMT、腫瘤細胞增殖和維持成纖維細胞的功能密切相關[69]；在膠質瘤中 H19 表達失調并與血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成相關[70]；APC1 則通過降低 Rab5b mRNA 表達的穩定性而降低結直腸癌細胞外泌體的產生來抑制內皮細胞中 MAPK 通路的過度激活從而抑制腫瘤血管生成[71]；此外，CCAT1、NIFK-AS1、MM2P、LNMAT1 和 lnc-BM（長鏈非編碼腦轉移瘤）在腫瘤相關巨噬細胞中表達，lnc-chop、lnc-C/EBPβ 和 lncRNA Pvt1 在髓源性抑制細胞中表達，lnc-Tim3 和 lnc-sox5 在 CD8+ T 細胞中表達，lnc-EGFR（表皮生長因子受體）和 lncRNA SNHG1（小核糖體管家基因 RNA1）在調節 T 細胞中表達。以上所有這些 lncRNA 在腫瘤浸潤免疫細胞中的異常表達與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲、腫瘤血管生成、EMT 和腫瘤轉移相關[69]。雖然在許多人類腫瘤中均發現 lncRNA 參與腫瘤微環境的調控，但是 lncRNA 對膽囊癌微環境的調控仍然缺乏系統性研究，還需進一步闡明。
4 小結與展望
通過文獻復習，本綜述共總結了 19 種與膽囊癌生物學行為相關的 lncRNA， 大多數 lncRNA 傾向于具有致癌特性（僅 3 種具有抑癌作用）。通過了解 lncRNA 在惡性腫瘤發展和進程中的作用，可以制定預防和（或）治療膽囊癌的策略。在人類多種腫瘤中均發現 lncRNA 表達失調，并且發現少數 lncRNA 可在患者的血清或尿液中特異性表達，提示這部分 lncRNA 有望成為腫瘤診斷和預后的生物標志物。目前針對 lncRNA 作為腫瘤的生物標志物研究仍處于臨床試驗階段，其臨床應用仍然存在許多挑戰。lncRNA 在不同類型的腫瘤中存在表達失調并與腫瘤發生、侵襲和分期相關，可作為潛在的腫瘤治療靶點。因此，可通過使 lncRNA 轉錄產物降解或不穩定、改變 lncRNA 編碼的啟動子活性來調節其轉錄、阻斷 lncRNA 與調控因子的相互作用或使用適配子破壞 lncRNA 的功能，從而靶向 lncRNA 來調節其表達，這可能是一種有效阻斷腫瘤進展的治療方式，但目前在膽囊癌中仍沒有針對于 lncRNA 的靶向藥物。雖然總結了各種 lncRNA 的促進或抑制腫瘤發生、發展的機制和作用，但是目前對于其機制的研究仍然是有限的。因此，對于膽囊癌的靶向治療策略的制定仍然存在巨大挑戰，特別是對于無癥狀膽囊癌的診斷和后續治療。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊發才選題并撰寫和修改文章；李敬東和邱應和在論文指導中提出了批判性的修改意見，具有同等貢獻。
