引用本文： 賀賽, 耿潔, 楊曉民, 王虎霞, 韓丕華, 侯艷妮, 范擁國, 陳楠. shRNA靶向沉默CNTN1表達對人乳腺癌細胞株MDA-MB-468裸鼠皮下移植瘤的抑制作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(11): 1371-1374. doi: 10.7507/1007-9424.202002056 復制
乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤第 1 位[1]。雖然以手術為主的綜合治療使乳腺癌的預后有了明顯改善，但總體預后仍不理想[2-3]。有研究發現接觸蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因作為癌基因在包括前列腺癌、肺癌及胃癌在內的多種腫瘤中異常表達與其發生及發展有關[4-7]，然而其在乳腺癌中的功能研究卻鮮有報道。本課題組通過前期研究[8]發現沉默 CNTN1 基因表達可以顯著降低乳腺癌細胞的增殖及克隆形成能力，為進一步探討 CNTN1 基因在乳腺癌中的功能，本研究采用皮下注射乳腺癌細胞構建裸鼠人乳腺癌移植模型，進一步觀察沉默 CNTN1 基因在體內環境中對乳腺癌移植瘤生長的影響，從而為乳腺癌的治療發現新靶點提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料
DMEM 細胞培養基和胎牛血清購自美國 Invitrogen 公司，兔抗人 CNTN1、Ki-67 單克隆一抗購自美國 Epitomics 公司，羊抗兔二抗、SP 兔 HRP 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2 實驗動物與細胞株
4 周齡雄性 BALB/c 裸鼠 18 只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于 SPF 條件下。人乳腺癌細胞株 MDA-MB-468（空白對照組）、轉染無義 shRNA 片段的 MDA-MB-468 細胞（空載體組）及轉染 shRNA 載體片段的 MDA-MB-468 細胞（沉默組）均由本課題組前期構建并保存，置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液中在 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，取生長狀態良好的細胞進行實驗。
1.3 裸鼠移植瘤模型的建立
18 只 BALB/c 裸鼠采用隨機數字表法隨機分為 3 組，DMEM 細胞培養每組 6 只。收集處于對數生長期的各組（空白對照組、空載體組和沉默組）細胞，細胞密度均調整至 5×106/mL，然后分別于裸鼠后背部皮下注射 0.2 mL 不同細胞，種植完成后，每天觀察并記錄腫塊出現時間。腫瘤形成后繼續觀察，每 3 d 用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑后計算腫瘤體積（腫瘤體積=π/6×長徑×短徑2）并繪制腫瘤生長曲線。于腫塊長至直徑 1.5～2.0 cm 大小時，斷頸處死裸鼠，摘取移植瘤并稱其質量，然后計算抑瘤率，其公式為：抑瘤率（%）=（空白對照組瘤平均質量–沉默組瘤平均質量）/空白對照組瘤平均質量×100%。
1.4 移植瘤組織中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達檢測
采用免疫組化法檢測各組裸鼠移植瘤組織中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白的表達。將各組裸鼠移植瘤組織經 4% 多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片（ 4～6 μm 厚）。依次將載玻片放入二甲苯→二甲苯→100% 乙醇→100% 乙醇→95% 乙醇→90% 乙醇→80% 乙醇→70% 乙醇，每種試劑中放 10 min，清水沖洗，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，清水沖洗 2 次，后加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮 3 min（中火），冷卻至室溫，將檸檬酸緩沖液倒掉，清水沖洗 2 次，并將載玻片置于 PBS 中 5 min，擦干組織周圍的 PBS，加血清，放入 37 ℃ 溫箱 30 min，加一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存過夜。取出載玻片，放入 PBS 中沖洗 3 次，每次 5 min，擦干組織周圍的 PBS 后加入二抗，37 ℃ 溫箱中 30 min。后放入 PBS 中沖洗 3 次，每次 5 min，擦干組織周圍的 PBS 后加入顯色劑。將顯色后的片子用清水沖洗，浸泡于蘇木精中染色 1 min。依次將載玻片放入 70% 乙醇→80% 乙醇→90% 乙醇→95% 乙醇→100% 乙醇→100% 乙醇→二甲苯→二甲苯，每種試劑中放置 2 min，用中性樹膠封片，以 PBS 代替一抗作陰性對照。胞質或胞核呈棕黃色染色為陽性，其中 CNTN1 蛋白陽性表達以胞質著色為主，Ki-67 蛋白陽性表達以胞核染色為主，每張切片隨機取 5 個視野（×400），每個視野觀察 200 個細胞，計算陽性細胞率。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 13.0 統計軟件對數據進行統計學分析。對符合正態分布的計量數據以均數±標準差（
±s）表示，多個樣本均數比較用單因素方差分析，兩樣本均數比較用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 沉默 CNTN1 基因表達對裸鼠皮下種植瘤生長的影響
裸鼠皮下分別接種各組細胞懸液后全部存活且于第 6 天有腫瘤形成，致瘤成功率 100%。各組種植瘤持續生長，未出現致瘤裸鼠死亡。至第 18 天時，腫瘤生長至 1.5～2.0 cm，拍照記錄并處死裸鼠獲取腫瘤（圖 1a）。繪制腫瘤生長曲線（圖 1b），可見沉默組種植瘤生長速度低于空白對照組（P<0.05）與空載體組（P<0.05），空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）；至第 18 天處死裸鼠時沉默組裸鼠皮下種植瘤的體積顯著小于空白對照組（P<0.05）與空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）。處死裸鼠時獲取的各組腫瘤質量見圖 1c，種植瘤質量沉默組明顯低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）。沉默組的抑瘤率為 51.72%。
圖1
示各組裸鼠皮下種植瘤生長情況及 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達檢測結果
a：各組移植瘤生長至第 18 天時的腫瘤情況及取出的腫瘤；b：各組裸鼠移植瘤生長曲線；c：各組裸鼠移植瘤質量；d、e：分別為各組種植瘤中 CNTN1 蛋白表達的定性（SP ×200）及半定量結果；f、g：分別為各組種植瘤中 Ki-67 蛋白表達的定性（SP ×200）及半定量結果。1：空白對照組；2：空載體組；3：沉默組。與空白對照組和空載體組比較，*
2.2 各組種植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達結果
結果見圖 1d-1g。CNTN1 蛋白在腫瘤細胞中呈陽性棕黃色染色表達于細胞質（圖 1d）；Ki-67 蛋白在腫瘤細胞中呈陽性棕黃色染色表達于細胞核（圖 1f）。腫瘤細胞中 CNTN1 蛋白表達陽性率在沉默組低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1e；Ki-67 蛋白表達陽性率在沉默組明顯低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1g。
3 討論
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[9]，預后欠佳并有年輕化趨勢[10]。隨著新的藥物研發、手術方式的改進和多種治療方法的介入，乳腺癌患者生存期顯著提高，但綜合治療副作用較大，患者對治療效果仍有較高預期[11-12]。近年來，隨著遺傳學和腫瘤分子生物學研究的深入，腫瘤的基因治療作為一種新的治療手段逐步應用于臨床[13]，人們期待基因治療在乳腺癌領域也能夠發揮作用，但目前仍未能找到有效的乳腺癌治療靶點[14]。
惡性腫瘤的發生及發展與基因的異常表達密切相關[15]。隨著對腫瘤相關基因研究的深入，CNTN1 作為一種神經接觸分子漸漸開始被研究者關注[16]，其參與介導了神經系統的生長發育和多種神經細胞的功能[17]，它的異常表達與腫瘤的發生發展、遷移侵襲、轉移甚至預后關系密切[18-20]。Su 等[21]通過基因芯片技術，首次發現 CNTN1 基因是影響肺癌細胞侵襲能力的重要基因之一。Wu 等[22]發現 CNTN1 的表達與口腔鱗狀細胞癌的淋巴道轉移相關。Liu 等[23]在一項研究 CNTN1 與食管鱗狀細胞癌關系的實驗中發現，CNTN1 基因和其受體促進了腫瘤的血管和淋巴管生成，并且發現 VEGF-C 是通過調控 CNTN1 的表達，從而促進食管鱗狀細胞癌細胞系的侵襲能力。亦有研究[24]顯示，CNTN1 在胃癌原發灶中異常表達，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基礎，影響胃癌淋巴道的轉移，對胃癌的診斷、治療及預后有一定的指導價值。目前針對 CNTN1 在乳腺腫瘤中的研究相對較少[25]，在乳腺癌中的功能仍尚不明確，因此，本課題組擬通過系列研究闡明 CNTN1 在乳腺癌中的功能并進一步明確其影響乳腺癌發生及發展的可能機制。
在前期工作中，本課題組已成功獲得沉默 CNTN1 基因表達的人乳腺癌細胞株 MDA-MB-468，發現沉默乳腺癌細胞系中 CNTN1 的表達可抑制乳腺癌細胞系的增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力。為進一步明確 CNTN1 在乳腺癌中的作用，本實驗擬在體內實驗通過沉默乳腺癌細胞中 CNTN1 的表達，研究其與裸鼠皮下移植瘤生長的關系。結果顯示，沉默組腫瘤生長速度、體積及質量均顯著慢或小或輕于空白對照組，提示沉默 CNTN1 的表達能抑制 MDA-MB-468 移植瘤的生長。此外，通過免疫組化法檢測移植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 的表達情況，結果顯示，沉默組種植瘤中 CNTN1 蛋白表達陽性率明顯低于空白對照組，這是 CNTN1 基因被沉默表達的結果；同時該組中增殖細胞核抗原 Ki-67 的蛋白表達陽性率明顯低于空白對照組，基于 Ki-67 體現的是腫瘤增殖活性，這與沉默組腫瘤生長被抑制結果相符。
本實驗結果初步證明沉默 CNTN1 表達可有效抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的生長，提示 CNTN1 在乳腺癌的發病中可能起重要作用，為后續研究 CNTN1 基因在乳腺癌中的作用奠定了基礎，同時為乳腺癌的治療發現新靶點提供初步的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：賀賽參與實驗設計及部分實驗研究；陳楠參與分析、解釋數據及統計分析；耿潔、楊曉民、王虎霞、韓丕華參與部分實驗研究及采集數據；侯艷妮、范擁國參與對文章的知識性內容作批評性審閱及起草文章。
倫理聲明：本研究已通過陜西省腫瘤醫院倫理委員會的審核批準。
乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤第 1 位[1]。雖然以手術為主的綜合治療使乳腺癌的預后有了明顯改善，但總體預后仍不理想[2-3]。有研究發現接觸蛋白-1（contactin-1，CNTN1）基因作為癌基因在包括前列腺癌、肺癌及胃癌在內的多種腫瘤中異常表達與其發生及發展有關[4-7]，然而其在乳腺癌中的功能研究卻鮮有報道。本課題組通過前期研究[8]發現沉默 CNTN1 基因表達可以顯著降低乳腺癌細胞的增殖及克隆形成能力，為進一步探討 CNTN1 基因在乳腺癌中的功能，本研究采用皮下注射乳腺癌細胞構建裸鼠人乳腺癌移植模型，進一步觀察沉默 CNTN1 基因在體內環境中對乳腺癌移植瘤生長的影響，從而為乳腺癌的治療發現新靶點提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料
DMEM 細胞培養基和胎牛血清購自美國 Invitrogen 公司，兔抗人 CNTN1、Ki-67 單克隆一抗購自美國 Epitomics 公司，羊抗兔二抗、SP 兔 HRP 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2 實驗動物與細胞株
4 周齡雄性 BALB/c 裸鼠 18 只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于 SPF 條件下。人乳腺癌細胞株 MDA-MB-468（空白對照組）、轉染無義 shRNA 片段的 MDA-MB-468 細胞（空載體組）及轉染 shRNA 載體片段的 MDA-MB-468 細胞（沉默組）均由本課題組前期構建并保存，置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液中在 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，取生長狀態良好的細胞進行實驗。
1.3 裸鼠移植瘤模型的建立
18 只 BALB/c 裸鼠采用隨機數字表法隨機分為 3 組，DMEM 細胞培養每組 6 只。收集處于對數生長期的各組（空白對照組、空載體組和沉默組）細胞，細胞密度均調整至 5×106/mL，然后分別于裸鼠后背部皮下注射 0.2 mL 不同細胞，種植完成后，每天觀察并記錄腫塊出現時間。腫瘤形成后繼續觀察，每 3 d 用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑后計算腫瘤體積（腫瘤體積=π/6×長徑×短徑2）并繪制腫瘤生長曲線。于腫塊長至直徑 1.5～2.0 cm 大小時，斷頸處死裸鼠，摘取移植瘤并稱其質量，然后計算抑瘤率，其公式為：抑瘤率（%）=（空白對照組瘤平均質量–沉默組瘤平均質量）/空白對照組瘤平均質量×100%。
1.4 移植瘤組織中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達檢測
采用免疫組化法檢測各組裸鼠移植瘤組織中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白的表達。將各組裸鼠移植瘤組織經 4% 多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片（ 4～6 μm 厚）。依次將載玻片放入二甲苯→二甲苯→100% 乙醇→100% 乙醇→95% 乙醇→90% 乙醇→80% 乙醇→70% 乙醇，每種試劑中放 10 min，清水沖洗，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，清水沖洗 2 次，后加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮 3 min（中火），冷卻至室溫，將檸檬酸緩沖液倒掉，清水沖洗 2 次，并將載玻片置于 PBS 中 5 min，擦干組織周圍的 PBS，加血清，放入 37 ℃ 溫箱 30 min，加一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存過夜。取出載玻片，放入 PBS 中沖洗 3 次，每次 5 min，擦干組織周圍的 PBS 后加入二抗，37 ℃ 溫箱中 30 min。后放入 PBS 中沖洗 3 次，每次 5 min，擦干組織周圍的 PBS 后加入顯色劑。將顯色后的片子用清水沖洗，浸泡于蘇木精中染色 1 min。依次將載玻片放入 70% 乙醇→80% 乙醇→90% 乙醇→95% 乙醇→100% 乙醇→100% 乙醇→二甲苯→二甲苯，每種試劑中放置 2 min，用中性樹膠封片，以 PBS 代替一抗作陰性對照。胞質或胞核呈棕黃色染色為陽性，其中 CNTN1 蛋白陽性表達以胞質著色為主，Ki-67 蛋白陽性表達以胞核染色為主，每張切片隨機取 5 個視野（×400），每個視野觀察 200 個細胞，計算陽性細胞率。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 13.0 統計軟件對數據進行統計學分析。對符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，多個樣本均數比較用單因素方差分析，兩樣本均數比較用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 沉默 CNTN1 基因表達對裸鼠皮下種植瘤生長的影響
裸鼠皮下分別接種各組細胞懸液后全部存活且于第 6 天有腫瘤形成，致瘤成功率 100%。各組種植瘤持續生長，未出現致瘤裸鼠死亡。至第 18 天時，腫瘤生長至 1.5～2.0 cm，拍照記錄并處死裸鼠獲取腫瘤（圖 1a）。繪制腫瘤生長曲線（圖 1b），可見沉默組種植瘤生長速度低于空白對照組（P<0.05）與空載體組（P<0.05），空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）；至第 18 天處死裸鼠時沉默組裸鼠皮下種植瘤的體積顯著小于空白對照組（P<0.05）與空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）。處死裸鼠時獲取的各組腫瘤質量見圖 1c，種植瘤質量沉默組明顯低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組比較差異無統計學意義（P>0.05）。沉默組的抑瘤率為 51.72%。
圖1
示各組裸鼠皮下種植瘤生長情況及 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達檢測結果
a：各組移植瘤生長至第 18 天時的腫瘤情況及取出的腫瘤；b：各組裸鼠移植瘤生長曲線；c：各組裸鼠移植瘤質量；d、e：分別為各組種植瘤中 CNTN1 蛋白表達的定性（SP ×200）及半定量結果；f、g：分別為各組種植瘤中 Ki-67 蛋白表達的定性（SP ×200）及半定量結果。1：空白對照組；2：空載體組；3：沉默組。與空白對照組和空載體組比較，*
2.2 各組種植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 蛋白表達結果
結果見圖 1d-1g。CNTN1 蛋白在腫瘤細胞中呈陽性棕黃色染色表達于細胞質（圖 1d）；Ki-67 蛋白在腫瘤細胞中呈陽性棕黃色染色表達于細胞核（圖 1f）。腫瘤細胞中 CNTN1 蛋白表達陽性率在沉默組低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1e；Ki-67 蛋白表達陽性率在沉默組明顯低于空白對照組（P<0.05）及空載體組（P<0.05），而空白對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1g。
3 討論
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[9]，預后欠佳并有年輕化趨勢[10]。隨著新的藥物研發、手術方式的改進和多種治療方法的介入，乳腺癌患者生存期顯著提高，但綜合治療副作用較大，患者對治療效果仍有較高預期[11-12]。近年來，隨著遺傳學和腫瘤分子生物學研究的深入，腫瘤的基因治療作為一種新的治療手段逐步應用于臨床[13]，人們期待基因治療在乳腺癌領域也能夠發揮作用，但目前仍未能找到有效的乳腺癌治療靶點[14]。
惡性腫瘤的發生及發展與基因的異常表達密切相關[15]。隨著對腫瘤相關基因研究的深入，CNTN1 作為一種神經接觸分子漸漸開始被研究者關注[16]，其參與介導了神經系統的生長發育和多種神經細胞的功能[17]，它的異常表達與腫瘤的發生發展、遷移侵襲、轉移甚至預后關系密切[18-20]。Su 等[21]通過基因芯片技術，首次發現 CNTN1 基因是影響肺癌細胞侵襲能力的重要基因之一。Wu 等[22]發現 CNTN1 的表達與口腔鱗狀細胞癌的淋巴道轉移相關。Liu 等[23]在一項研究 CNTN1 與食管鱗狀細胞癌關系的實驗中發現，CNTN1 基因和其受體促進了腫瘤的血管和淋巴管生成，并且發現 VEGF-C 是通過調控 CNTN1 的表達，從而促進食管鱗狀細胞癌細胞系的侵襲能力。亦有研究[24]顯示，CNTN1 在胃癌原發灶中異常表達，可能是胃癌新生淋巴管生成的分子基礎，影響胃癌淋巴道的轉移，對胃癌的診斷、治療及預后有一定的指導價值。目前針對 CNTN1 在乳腺腫瘤中的研究相對較少[25]，在乳腺癌中的功能仍尚不明確，因此，本課題組擬通過系列研究闡明 CNTN1 在乳腺癌中的功能并進一步明確其影響乳腺癌發生及發展的可能機制。
在前期工作中，本課題組已成功獲得沉默 CNTN1 基因表達的人乳腺癌細胞株 MDA-MB-468，發現沉默乳腺癌細胞系中 CNTN1 的表達可抑制乳腺癌細胞系的增殖、克隆形成以及遷移侵襲能力。為進一步明確 CNTN1 在乳腺癌中的作用，本實驗擬在體內實驗通過沉默乳腺癌細胞中 CNTN1 的表達，研究其與裸鼠皮下移植瘤生長的關系。結果顯示，沉默組腫瘤生長速度、體積及質量均顯著慢或小或輕于空白對照組，提示沉默 CNTN1 的表達能抑制 MDA-MB-468 移植瘤的生長。此外，通過免疫組化法檢測移植瘤中 CNTN1 和 Ki-67 的表達情況，結果顯示，沉默組種植瘤中 CNTN1 蛋白表達陽性率明顯低于空白對照組，這是 CNTN1 基因被沉默表達的結果；同時該組中增殖細胞核抗原 Ki-67 的蛋白表達陽性率明顯低于空白對照組，基于 Ki-67 體現的是腫瘤增殖活性，這與沉默組腫瘤生長被抑制結果相符。
本實驗結果初步證明沉默 CNTN1 表達可有效抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的生長，提示 CNTN1 在乳腺癌的發病中可能起重要作用，為后續研究 CNTN1 基因在乳腺癌中的作用奠定了基礎，同時為乳腺癌的治療發現新靶點提供初步的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：賀賽參與實驗設計及部分實驗研究；陳楠參與分析、解釋數據及統計分析；耿潔、楊曉民、王虎霞、韓丕華參與部分實驗研究及采集數據；侯艷妮、范擁國參與對文章的知識性內容作批評性審閱及起草文章。
倫理聲明：本研究已通過陜西省腫瘤醫院倫理委員會的審核批準。
