引用本文： 薛源, 李沛東, 張廣軍. 結直腸癌患者血清外泌體 microRNAs 的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(9): 1169-1174. doi: 10.7507/1007-9424.202002049 復制
結直腸癌（CRC）是世界上最常見的惡性腫瘤，是全球第二大與癌癥相關的死亡原因。在中國，近 10 年來 CRC 發病率呈升高趨勢，其中 60～74 歲年齡段的發病率最高[1]；此外，因防控體系不健全，我國 CRC 早期診斷率低，由此帶來了沉重的經濟負擔[2]。CRC 是男性中第 4 常見和女性中第 3 常見的惡性腫瘤[3]。早期 CRC 的 5 年生存率為 90%，而有遠處轉移者的 5 年生存率不到 10%[4]。因此，提高早期診斷率對防治 CRC 具有十分重要的意義。結腸鏡檢查是結直腸腺瘤及 CRC 篩查的金標準[5]，但結腸鏡系侵入性檢查，且需繁瑣的腸道準備，使其在早期 CRC 篩查方面的作用受到限制。癌胚抗原（CEA）等標志物早已廣泛應用于臨床，但其敏感度差，特別是在診斷方面的作用甚微[6]。為提高早期 CRC 的診斷效率，亟需尋找新的具有特異性的敏感生物標志物。近年來，外泌體在人類惡性腫瘤中的作用受到越來越多的關注[7-8]。有研究[9-11]表明，血清外泌體 microRNAs（miRs）介導了腫瘤的發生發展、侵襲、轉移、耐藥等多種生物學行為。筆者結合近年來的研究，就血清外泌體 miRs 介導 CRC 的作用作一綜述。
1 血清外泌體 miRs 與癌癥的關系概述
1.1 外泌體概述
外泌體是一種直徑為 40～100 nm 的細胞外囊泡，具有雙層膜結構，首先在綿羊的網織紅細胞中被發現[12]。外泌體包含脂質、蛋白質、DNA、RNA（mRNA、miR 及長鏈非編碼 RNA）和其他分子[13]；通過轉運蛋白、核酸和其他具有生物活性的成分介導了細胞間的通訊[14]。外泌體的形成是一個高度調控的過程，包括啟動、內吞作用、多囊泡（MVB）形成和分泌[15]。細胞內的早期核內體形成后，這類早期核內體的質膜內陷形成內翻的囊泡、啟動外泌體的形成；早期核內體的磷脂雙分子層隨后折疊形成 MVB；隨后，MVB 以鈣依賴的方式與質膜結合，被分泌到環境中[16]。在生理和病理條件下，外泌體可由癌細胞、上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板等多種細胞分泌[17-19]。外泌體廣泛分布在各種體液中，如外周血、尿液、膽汁、唾液、腹水、羊水等[20]。按常理來講，由于有這么多細胞釋放外泌體，這些囊泡可能不會成為理想的生物標志物；然而，外泌體從它們的來源細胞到靶細胞，都非常有效地攜帶和傳遞了分子信號（如核酸和蛋白質），而且這種信號可很容易地在血液中檢測到，這個顯著而重要的特征使之可能成為具有組織/器官特異性的生物標志物[15]。此外，癌細胞會比正常細胞產生更多的外泌體[21]，腫瘤細胞分泌的外泌體可通過影響組織微環境中的其他類型細胞來促進腫瘤發生和轉移[22]。因此，外泌體在腫瘤中作用的研究受到越來越多的關注，這其中涉及到外泌體在腫瘤發生、轉移、抗腫瘤或抗腫瘤免疫等方面的作用及其在腫瘤治療、診斷和預后中的應用[23]。
1.2 miRs 與癌癥
1993 年，Lee 等[24]首先在線蟲基因中發現了 miRs。它們是一類包含 20～25 個核苷酸的高度保守的非編碼小分子 RNA，是強大的轉錄后調節因子，可以調節 mRNA 的翻譯；通過與目的基因 mRNA 3′非翻譯區（3′UTR）結合，誘導其降解或抑制翻譯[25]。2002 年，研究者[26]首次發現，miRs 與慢性淋巴細胞白血病的發病相關。經過近 20 年來深入的研究，miRs 已被證實在調控人類惡性腫瘤中具有非常重要的作用。在 236 條 KEGG 通路中，超過 99% 的通路在人體內有 miRs 來源和靶標，這表明了 miRs 介導的調控在生物通路中具有巨大影響[27]。雖然 miRs 不編碼任何蛋白，但它們參與了基因調控和關鍵的生物學進程，包括癌癥的發生和發展、細胞增殖、分化、凋亡等；異常表達的 miRs 既可以作為促癌因子，也可以作為腫瘤抑制因子，這取決于腫瘤的微環境[28]。miRs 在 CRC 的生物學進程、診斷、預測預后等多個方面具有十分重要的意義。
1.3 血清外泌體 miRs 與癌癥
外泌體廣泛分布在各種體液（如血液、尿液、膽汁、乳汁、唾液等）中，目前關于血液中外泌體的研究最為深入。血清中的外泌體可以作為載體介導蛋白質、核酸（包括 miR）等物質在細胞間的傳遞。癌細胞可以通過外泌體形式將 miRs 分泌到體液中，外泌體 miRs 的不當釋放或失調可能導致某些生物學過程的顯著改變，從而影響癌癥的發展和進程[29]。已有研究[30]表明，外泌體是血清中 miRs 的主要載體。作為一種理想載體，血清外泌體具有兩大特點：一是其外膜可防止 miRs 和其他內容物在循環系統中被降解[31]；二是通過循環外泌體作用于靶細胞，與靶細胞質膜融合并釋放內容物以發揮特定功能[32]。通過這些機制，外泌體攜帶的分子才可以從供體細胞傳遞到受體細胞，從而促進腫瘤的發展。越來越多的研究證實，血清外泌體 miRs 參與了人惡性腫瘤（如前列腺癌[33]、肺癌[34]、胃癌[35]等）的進程，可能成為診斷、預后及治療相關的生物標志物。有研究[32]證明，血清外泌體 miRs 可通過改變腫瘤的微環境促進上皮間質轉化（EMT）、促進腫瘤血管生成、影響腫瘤免疫力等導致 CRC 的發生發展、侵襲和轉移。因此，血清外泌體 miRs 作為診斷和預測人類癌癥的生物標志物具有巨大潛力。
2 CRC 相關血清外泌體 miRs
2.1 與 CRC 細胞增殖相關的血清外泌體 miRs
目前一些研究表明，部分血清外泌體 miRs 的失調能明顯影響 CRC 細胞的增殖（表 1）。Dai 等[36]的研究證實，CRC 細胞分泌的外泌體中 miR-10b 的含量明顯高于正常結直腸上皮細胞分泌的外泌體，含有 miR-10b 的外泌體被轉移到成纖維細胞中，通過抑制磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路的活性，激活成纖維細胞成為癌癥相關成纖維細胞（CAFs），從而促進 CRC 細胞增殖。Xu 等[37]從血清中分離出骨髓間充質干細胞來源的外泌體，經體外增殖實驗觀察到，上調的外泌體 miR-16-5p 通過降低整合素 α2（ITGA2）的表達水平來抑制 CRC 細胞（Caco-2 細胞和 LoVo 細胞）增殖并促進其凋亡。一項樣本量為 53 例 CRC 患者的研究[38]發現，血清外泌體 miR-146a 高表達可促進 CRC 干細胞樣特性，從而導致 CRC 細胞增殖。有研究者[39]通過細胞計數法（14 d）及凋亡實驗證實，血清外泌體 miR-375 能抑制 CRC 細胞（HCT116 細胞）增殖、促進其凋亡，并通過機制驗證證實，血清外泌體 miR-375 通過 B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）通路參與 CRC 的調控。一項包含 77 例 CRC 患者和 20 名健康對照的研究[40]發現，與健康對照組相比，CRC 患者血清外泌體 miR-548c-5p 的表達水平顯著降低；EdU 及 CCK-8 實驗證實，血清外泌體 miR-548c-5p 能有效抑制 CRC 細胞（HCT116 細胞）增殖，但具體機制尚不清楚。早期的研究[48]證實，血清外泌體 miR-1229 水平在 29 例原發性 CRC 患者中顯著升高，且在手術切除腫瘤后顯著下調。最近的研究[41]發現，血清外泌體 miR-1229 通過調控蛋白激酶 2/血管內皮生長因子（HIPK2/VEGF）通路促進 CRC 血管生成，并經裸鼠移植瘤實驗證實，下調血清外泌體 miR-1229 可抑制體內 CRC 腫瘤的生長。這些證據間接表明，血清外泌體 miR-1229 可促進 CRC 細胞增殖，但目前尚缺乏直接證據，需進一步研究證實。總之，血清外泌體 miRs 對 CRC 細胞的增殖具有較大影響。
表1
與 CRC 生物學行為相關的血清外泌體 miRs
2.2 與 CRC 轉移相關的血清外泌體 miRs
近年來的一些研究發現，部分血清外泌體 miRs 參與并調控了 CRC 的轉移（表 1）。有一項研究[42]采集了 10 例健康志愿者、18 例 CRC 非轉移患者及 11 例 CRC 伴轉移患者的血清，經 RT-qPCR 檢測發現，血清中的外泌體 miR-17-5p 和 miR-92a-3p 表達水平趨勢為：CRC 患者顯著高于健康對照者，而 CRC 伴轉移患者顯著高于非轉移患者，差異具有統計學意義。Tsukamoto 等[43]的研究發現，同一患者的血清外泌體 miR-21 水平與腫瘤組織中的miR-21 水平呈顯著正相關；CRC 患者的血清外泌體 miR-21 表達水平明顯升高，并且與肝轉移的相關性具有統計學意義；但上述 3 種外泌體 miRs 促 CRC 轉移的分子機制和相關的通路目前尚未得到證實。有研究者[44]發現，在小鼠結腸癌轉移肝組織中外泌體 miR-193a 的表達上調；并通過 qPCR 分析證實，CRC 患者的血清外泌體中 miR-193a 的含量明顯高于健康對照組；此外，與不伴轉移的結腸癌患者（25 例）相比，CRC 肝轉移患者（15 例）血清中的外泌體顯示出更高的 miR-193a 的表達水平。隨后，該研究團隊進行了一項前瞻性研究，在初步診斷后的 6 個月隨訪中進一步調查了肝轉移的發生率，結果表明，外周血外泌體中 miR-193a 含量高的結腸癌患者轉移的風險更高[44]。在腫瘤組織中分離的 miR-203 被證實具有抑制 CRC 發展的作用[49]。然而 Takano 等[45]的研究卻發現，在異種移植小鼠模型中，與對照組相比，轉染了血清外泌體 miR-203的 CRC 細胞發生了更多的肝轉移，這一過程可能是通過促進單核細胞向 M2-腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的分化來實現的。Tang 等[46]收集了 34 例轉移性 CRC 和 108 例非轉移性 CRC 患者的血清后證實，血清外泌體 miR-320d 在 CRC 伴轉移患者血清中的表達水平明顯升高，并且對轉移性 CRC 具有診斷意義。一項有趣的研究[47]發現，在結腸癌肝轉移的患者中，腸系膜靜脈血中外泌體 miR-328 的含量遠遠大于外周靜脈血，這表明外泌體 miR-328 可能在結腸癌肝轉移的發展中發揮了作用。Yan 等[29]通過基因芯片分析鑒定出 CRC 患者的血清外泌體中有 10 種 miRs 表達上調，29 種 miRs 表達下調；而血清外泌體中低水平的 miR-638 與 CRC 患者肝轉移的風險增加有關。有研究[21]報道，正常人的血液中大約包含 2 000 萬億個外泌體，癌癥患者的血液中大約包含 4 000 萬億個外泌體；由此可以看出，癌癥細胞比正常細胞分泌更多的外泌體，而外泌體作為一種載體將供體細胞來源的分子（包含 miRs 在內）傳遞給靶細胞并調節其功能，這無疑是血清外泌體 miRs 介導癌癥血行轉移的一種機制。通過復習上述研究，筆者總結，目前與 CRC 轉移相關的血清外泌體 miRs 缺乏細胞水平、動物模型的功能實驗以及相關分子機制和通路的驗證。
2.3 與 CRC 耐藥相關的血清外泌體 miRs
近年來，隨著治療方案的改進及靶向藥物的應用，CRC 的總體生存率有了較為顯著的提高，但晚期 CRC 患者在應用化療或靶向治療過程中迅速出現的耐藥性限制了當前癌癥治療的效果。在研究者們研究耐藥機制的過程中可能會發現一些新的分子，這些分子可能有助于預測那些轉移性 CRC 患者的臨床結局，還可能基于對這些生物分子的識別，提出更合理的治療策略來改善或克服耐藥性[50]。有研究者[51]通過 miR 芯片分析發現，外泌體miR-125b 在基于 mFOLFOX6 化療方案耐藥的血漿外泌體 miRs 中上調幅度最大，并進一步證實血漿外泌體 miR-125b 的表達水平有助于早期檢測對基于 mFOLFOX6 一線化療的耐藥性，但未對其具體作用機制進行研究。Cheng 等[38]的研究發現，血清外泌體 miR-146a 的表達可調節腫瘤免疫治療的療效，血清外泌體 miR-146a 的表達有利于腫瘤浸潤性 CD8+T 細胞數量的減少，以及腫瘤浸潤性 CD66b+中性粒細胞數量的增加。血漿外泌體 miRs 在介導 CRC 耐藥的機制過程中還可能存在多個分子的聯合調控。有研究者[52]證實，化療耐藥組患者血清外泌體中 miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p 和 miR-96-5p 的表達水平明顯高于化療敏感組；ROC 曲線顯示，4 種 miRs 的組合曲線下面積（AUC）為 0.804（P<0.05）；靶向這些 miRNAs 可能促進 CRC 對奧沙利鉑和 5-氟尿嘧啶的化學敏感性。目前關于血清中的外泌體 miRs 介導 CRC 耐藥的研究較少，尚需更多的研究進一步了解其具體機制。
2.4 與 CRC 診斷及預后相關的血清外泌體 miRs
眾所周知，外周靜脈血液標本采集在臨床應用中最為常見，具有安全、簡便、易實施等優點。自 21 世紀初以來，研究人員一直試圖從血液或活檢中檢測出具有表達特征的基因以作為生物標志物來診斷癌癥[53]，而癌細胞能將包裹 miRs 等分子的外泌體分泌到血液中。因此，近年來關于血清外泌體 miRs 在 CRC 診斷及預后中應用的研究越來越多。有文獻[54]報道，在血清中，與低外泌體 miR-19a 表達相比，高外泌體 miR-19a 表達與較差的存活率顯著相關；外泌體 miR-19a 在血清中的大量表達被確定為 CRC 患者復發的預后生物標志物。miR-21 在血清外泌體、原發腫瘤組織和肝轉移組織中表達上調；血清外泌體 miR-21 高表達患者的總生存（OS）率和無進展生存（DFS）率明顯低于血清外泌體 miR-21 低表達患者[43]。Liu 等[55]納入了 369 例 CRC 患者的外周血標本，經研究發現，血清外泌體miR-27a 或 miR-130a 高表達 CRC 患者的預后較差。Yagi 等[51]發現，血清中外泌體 miR-125b 高表達的患者 DFS 率明顯低于 miR-125b 低表達的患者，經 Cox 多因素分析證實，血清外泌體 miR-125b 對晚期/復發性 CRC 患者的 DFS 具有獨立的預后價值。如前所述[49]，腫瘤組織中的 miR-203 可作為腫瘤抑制因子，而血清中的外泌體 miR-203 被證實為促癌因子；血清外泌體 miR-203 的高表達是 CRC 獨立的不良預后因素[45]。外泌體 miR-548c-5p 在 CRC Ⅲ/Ⅳ期及伴有肝轉移患者血清中的表達水平顯著降低；Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，CRC 血清外泌體 miR-548c-5p 低表達組的 OS 縮短。血清外泌體 miR-548c-5p 的下調可預測 CRC 患者的不良預后[40]。Liu 等[56]進行的前瞻性研究，納入 84 例Ⅱ/Ⅲ期結腸癌患者，在腫瘤切除后輔助治療前采集該隊列患者的血液樣本，隨后進行了隨訪和 RNA 測序以確定血清外泌體 miRs 譜，在復發與非復發患者（27 例復發，57 例未復發）間鑒定出了差異表達 miRs，并通過 Kaplan-Meier 生存分析、腫瘤復發風險的 logistic 回歸、ROC 分析、Cox 回歸分析等一系列研究證實，血清外泌體 miR-4772-3p 的低表達是預測Ⅱ期和Ⅲ期結腸癌患者腫瘤復發的生物標志物。另一項研究[57]納入 168 例 CRC 患者，在 TNM 晚期或有轉移的 CRC 患者中，血清外泌體 miR-6803-5p 明顯升高，其升高者的 OS 和 DFS 較差；經 Cox 回歸分析顯示，高表達的血清外泌體 miR-6803-5p 是 CRC 獨立的不良預后因素。
有研究[58]顯示，作為生物標志物應用于診斷或判斷預后時，單個基因的敏感性往往不如兩個甚至多個基因的組合。如 Wang 等[58]的研究證實，早期結腸癌患者血清外泌體中 miR-125a-3p 的表達明顯上調；此外，miR-125a-3p 能提高 CEA 對早期 CRC 的診斷敏感性。Yu 等[59]發現，與健康受試者相比，CRC 患者血清外泌體中 CRNDE-p（CRC 差異表達的長編碼 RNA）的表達水平較高，而 miR-217 的表達水平較低；ROC 曲線分析結果表明，血清外泌體 CRNDE-p和 miR-217 的組合表達顯示出高靈敏度和特異性，比常規腫瘤標志物 CEA 具有更好的診斷預測效能。Tang 等[46]招募了 142 例 CRC 患者（其中 34 例伴轉移，108 例不伴轉移），經 ROC 曲線分析發現，血清外泌體 miR-320d 診斷 CRC 發生轉移的 AUC 為 0.633，敏感性為 62.0%，特異性為 64.7%；而血清外泌體 miR-320d 和 CEA 組合的 AUC 為 0.804，敏感性為 63.3%，特異性為 91.3%。
綜上，血清外泌體 miRs 的表達在 CRC 診斷、預測預后等方面的應用具有巨大潛力。此外，兩個及以上分子組合的生物標志物有可能提高診斷的敏感性及特異性。
3 小結與展望
盡可能早地發現和診斷 CRC 是改善其預后的關鍵環節。為此，研究者們不斷嘗試尋找敏感性和特異性俱佳的 CRC 生物標志物。而理想的 CRC 生物標志物應該是能夠基于血液或者糞便等體液標本進行準確的篩選，因為這種非侵入性的方式對患者的風險最小，很容易執行，而且可以在短時間間隔內重復[60]。近年來，大量的研究證實，血液循環系統中外泌體 miRs 介導了包括 CRC 在內的人類各種惡性腫瘤的生物學行為[15, 32]。而血清外泌體 miRs 是血液循環系統中外泌體 miRs 的主要形式。通過閱讀、總結上述相關文獻，筆者總結，血清外泌體 miRs 介導了 CRC 的發生發展、轉移、耐藥等多種生物學過程，但其具體的作用通路及分子機制有待進一步的研究。此外，血清外泌體 miRs 在 CRC 診斷及預測預后方面具有巨大潛力，但目前的證據尚不能支撐其應用于臨床。值得一提的是，有研究[59]發現，兩個及以上分子組合的生物標志能提高診斷效率；一些血清外泌體 miRs 能提高傳統的生物標志物（如 CEA 等）的敏感性和特異性。此外，有研究者[47]發現，一些外泌體 miRs 在結腸癌伴肝轉移患者的引流靜脈（腸系膜上靜脈）中與外周靜脈血中的表達并不一致。基于此發現，將來有可能在術中采集 CRC 患者引流靜脈的血液預測其發生肝轉移的風險，從而改善結直腸的預后。筆者認為，這些發現為我們提供了一種新的研究思路，如何更有效地提高已廣泛應用于臨床的現有生物標志物的敏感性和特異性，更值得思考。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：薛源，負責選題、文獻檢索和初稿撰寫工作；李沛東，負責文獻檢索及文章修改；張廣軍，指導選題、審閱文章并及提出修改意見。
結直腸癌（CRC）是世界上最常見的惡性腫瘤，是全球第二大與癌癥相關的死亡原因。在中國，近 10 年來 CRC 發病率呈升高趨勢，其中 60～74 歲年齡段的發病率最高[1]；此外，因防控體系不健全，我國 CRC 早期診斷率低，由此帶來了沉重的經濟負擔[2]。CRC 是男性中第 4 常見和女性中第 3 常見的惡性腫瘤[3]。早期 CRC 的 5 年生存率為 90%，而有遠處轉移者的 5 年生存率不到 10%[4]。因此，提高早期診斷率對防治 CRC 具有十分重要的意義。結腸鏡檢查是結直腸腺瘤及 CRC 篩查的金標準[5]，但結腸鏡系侵入性檢查，且需繁瑣的腸道準備，使其在早期 CRC 篩查方面的作用受到限制。癌胚抗原（CEA）等標志物早已廣泛應用于臨床，但其敏感度差，特別是在診斷方面的作用甚微[6]。為提高早期 CRC 的診斷效率，亟需尋找新的具有特異性的敏感生物標志物。近年來，外泌體在人類惡性腫瘤中的作用受到越來越多的關注[7-8]。有研究[9-11]表明，血清外泌體 microRNAs（miRs）介導了腫瘤的發生發展、侵襲、轉移、耐藥等多種生物學行為。筆者結合近年來的研究，就血清外泌體 miRs 介導 CRC 的作用作一綜述。
1 血清外泌體 miRs 與癌癥的關系概述
1.1 外泌體概述
外泌體是一種直徑為 40～100 nm 的細胞外囊泡，具有雙層膜結構，首先在綿羊的網織紅細胞中被發現[12]。外泌體包含脂質、蛋白質、DNA、RNA（mRNA、miR 及長鏈非編碼 RNA）和其他分子[13]；通過轉運蛋白、核酸和其他具有生物活性的成分介導了細胞間的通訊[14]。外泌體的形成是一個高度調控的過程，包括啟動、內吞作用、多囊泡（MVB）形成和分泌[15]。細胞內的早期核內體形成后，這類早期核內體的質膜內陷形成內翻的囊泡、啟動外泌體的形成；早期核內體的磷脂雙分子層隨后折疊形成 MVB；隨后，MVB 以鈣依賴的方式與質膜結合，被分泌到環境中[16]。在生理和病理條件下，外泌體可由癌細胞、上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板等多種細胞分泌[17-19]。外泌體廣泛分布在各種體液中，如外周血、尿液、膽汁、唾液、腹水、羊水等[20]。按常理來講，由于有這么多細胞釋放外泌體，這些囊泡可能不會成為理想的生物標志物；然而，外泌體從它們的來源細胞到靶細胞，都非常有效地攜帶和傳遞了分子信號（如核酸和蛋白質），而且這種信號可很容易地在血液中檢測到，這個顯著而重要的特征使之可能成為具有組織/器官特異性的生物標志物[15]。此外，癌細胞會比正常細胞產生更多的外泌體[21]，腫瘤細胞分泌的外泌體可通過影響組織微環境中的其他類型細胞來促進腫瘤發生和轉移[22]。因此，外泌體在腫瘤中作用的研究受到越來越多的關注，這其中涉及到外泌體在腫瘤發生、轉移、抗腫瘤或抗腫瘤免疫等方面的作用及其在腫瘤治療、診斷和預后中的應用[23]。
1.2 miRs 與癌癥
1993 年，Lee 等[24]首先在線蟲基因中發現了 miRs。它們是一類包含 20～25 個核苷酸的高度保守的非編碼小分子 RNA，是強大的轉錄后調節因子，可以調節 mRNA 的翻譯；通過與目的基因 mRNA 3′非翻譯區（3′UTR）結合，誘導其降解或抑制翻譯[25]。2002 年，研究者[26]首次發現，miRs 與慢性淋巴細胞白血病的發病相關。經過近 20 年來深入的研究，miRs 已被證實在調控人類惡性腫瘤中具有非常重要的作用。在 236 條 KEGG 通路中，超過 99% 的通路在人體內有 miRs 來源和靶標，這表明了 miRs 介導的調控在生物通路中具有巨大影響[27]。雖然 miRs 不編碼任何蛋白，但它們參與了基因調控和關鍵的生物學進程，包括癌癥的發生和發展、細胞增殖、分化、凋亡等；異常表達的 miRs 既可以作為促癌因子，也可以作為腫瘤抑制因子，這取決于腫瘤的微環境[28]。miRs 在 CRC 的生物學進程、診斷、預測預后等多個方面具有十分重要的意義。
1.3 血清外泌體 miRs 與癌癥
外泌體廣泛分布在各種體液（如血液、尿液、膽汁、乳汁、唾液等）中，目前關于血液中外泌體的研究最為深入。血清中的外泌體可以作為載體介導蛋白質、核酸（包括 miR）等物質在細胞間的傳遞。癌細胞可以通過外泌體形式將 miRs 分泌到體液中，外泌體 miRs 的不當釋放或失調可能導致某些生物學過程的顯著改變，從而影響癌癥的發展和進程[29]。已有研究[30]表明，外泌體是血清中 miRs 的主要載體。作為一種理想載體，血清外泌體具有兩大特點：一是其外膜可防止 miRs 和其他內容物在循環系統中被降解[31]；二是通過循環外泌體作用于靶細胞，與靶細胞質膜融合并釋放內容物以發揮特定功能[32]。通過這些機制，外泌體攜帶的分子才可以從供體細胞傳遞到受體細胞，從而促進腫瘤的發展。越來越多的研究證實，血清外泌體 miRs 參與了人惡性腫瘤（如前列腺癌[33]、肺癌[34]、胃癌[35]等）的進程，可能成為診斷、預后及治療相關的生物標志物。有研究[32]證明，血清外泌體 miRs 可通過改變腫瘤的微環境促進上皮間質轉化（EMT）、促進腫瘤血管生成、影響腫瘤免疫力等導致 CRC 的發生發展、侵襲和轉移。因此，血清外泌體 miRs 作為診斷和預測人類癌癥的生物標志物具有巨大潛力。
2 CRC 相關血清外泌體 miRs
2.1 與 CRC 細胞增殖相關的血清外泌體 miRs
目前一些研究表明，部分血清外泌體 miRs 的失調能明顯影響 CRC 細胞的增殖（表 1）。Dai 等[36]的研究證實，CRC 細胞分泌的外泌體中 miR-10b 的含量明顯高于正常結直腸上皮細胞分泌的外泌體，含有 miR-10b 的外泌體被轉移到成纖維細胞中，通過抑制磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路的活性，激活成纖維細胞成為癌癥相關成纖維細胞（CAFs），從而促進 CRC 細胞增殖。Xu 等[37]從血清中分離出骨髓間充質干細胞來源的外泌體，經體外增殖實驗觀察到，上調的外泌體 miR-16-5p 通過降低整合素 α2（ITGA2）的表達水平來抑制 CRC 細胞（Caco-2 細胞和 LoVo 細胞）增殖并促進其凋亡。一項樣本量為 53 例 CRC 患者的研究[38]發現，血清外泌體 miR-146a 高表達可促進 CRC 干細胞樣特性，從而導致 CRC 細胞增殖。有研究者[39]通過細胞計數法（14 d）及凋亡實驗證實，血清外泌體 miR-375 能抑制 CRC 細胞（HCT116 細胞）增殖、促進其凋亡，并通過機制驗證證實，血清外泌體 miR-375 通過 B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）通路參與 CRC 的調控。一項包含 77 例 CRC 患者和 20 名健康對照的研究[40]發現，與健康對照組相比，CRC 患者血清外泌體 miR-548c-5p 的表達水平顯著降低；EdU 及 CCK-8 實驗證實，血清外泌體 miR-548c-5p 能有效抑制 CRC 細胞（HCT116 細胞）增殖，但具體機制尚不清楚。早期的研究[48]證實，血清外泌體 miR-1229 水平在 29 例原發性 CRC 患者中顯著升高，且在手術切除腫瘤后顯著下調。最近的研究[41]發現，血清外泌體 miR-1229 通過調控蛋白激酶 2/血管內皮生長因子（HIPK2/VEGF）通路促進 CRC 血管生成，并經裸鼠移植瘤實驗證實，下調血清外泌體 miR-1229 可抑制體內 CRC 腫瘤的生長。這些證據間接表明，血清外泌體 miR-1229 可促進 CRC 細胞增殖，但目前尚缺乏直接證據，需進一步研究證實。總之，血清外泌體 miRs 對 CRC 細胞的增殖具有較大影響。
表1
與 CRC 生物學行為相關的血清外泌體 miRs
2.2 與 CRC 轉移相關的血清外泌體 miRs
近年來的一些研究發現，部分血清外泌體 miRs 參與并調控了 CRC 的轉移（表 1）。有一項研究[42]采集了 10 例健康志愿者、18 例 CRC 非轉移患者及 11 例 CRC 伴轉移患者的血清，經 RT-qPCR 檢測發現，血清中的外泌體 miR-17-5p 和 miR-92a-3p 表達水平趨勢為：CRC 患者顯著高于健康對照者，而 CRC 伴轉移患者顯著高于非轉移患者，差異具有統計學意義。Tsukamoto 等[43]的研究發現，同一患者的血清外泌體 miR-21 水平與腫瘤組織中的miR-21 水平呈顯著正相關；CRC 患者的血清外泌體 miR-21 表達水平明顯升高，并且與肝轉移的相關性具有統計學意義；但上述 3 種外泌體 miRs 促 CRC 轉移的分子機制和相關的通路目前尚未得到證實。有研究者[44]發現，在小鼠結腸癌轉移肝組織中外泌體 miR-193a 的表達上調；并通過 qPCR 分析證實，CRC 患者的血清外泌體中 miR-193a 的含量明顯高于健康對照組；此外，與不伴轉移的結腸癌患者（25 例）相比，CRC 肝轉移患者（15 例）血清中的外泌體顯示出更高的 miR-193a 的表達水平。隨后，該研究團隊進行了一項前瞻性研究，在初步診斷后的 6 個月隨訪中進一步調查了肝轉移的發生率，結果表明，外周血外泌體中 miR-193a 含量高的結腸癌患者轉移的風險更高[44]。在腫瘤組織中分離的 miR-203 被證實具有抑制 CRC 發展的作用[49]。然而 Takano 等[45]的研究卻發現，在異種移植小鼠模型中，與對照組相比，轉染了血清外泌體 miR-203的 CRC 細胞發生了更多的肝轉移，這一過程可能是通過促進單核細胞向 M2-腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的分化來實現的。Tang 等[46]收集了 34 例轉移性 CRC 和 108 例非轉移性 CRC 患者的血清后證實，血清外泌體 miR-320d 在 CRC 伴轉移患者血清中的表達水平明顯升高，并且對轉移性 CRC 具有診斷意義。一項有趣的研究[47]發現，在結腸癌肝轉移的患者中，腸系膜靜脈血中外泌體 miR-328 的含量遠遠大于外周靜脈血，這表明外泌體 miR-328 可能在結腸癌肝轉移的發展中發揮了作用。Yan 等[29]通過基因芯片分析鑒定出 CRC 患者的血清外泌體中有 10 種 miRs 表達上調，29 種 miRs 表達下調；而血清外泌體中低水平的 miR-638 與 CRC 患者肝轉移的風險增加有關。有研究[21]報道，正常人的血液中大約包含 2 000 萬億個外泌體，癌癥患者的血液中大約包含 4 000 萬億個外泌體；由此可以看出，癌癥細胞比正常細胞分泌更多的外泌體，而外泌體作為一種載體將供體細胞來源的分子（包含 miRs 在內）傳遞給靶細胞并調節其功能，這無疑是血清外泌體 miRs 介導癌癥血行轉移的一種機制。通過復習上述研究，筆者總結，目前與 CRC 轉移相關的血清外泌體 miRs 缺乏細胞水平、動物模型的功能實驗以及相關分子機制和通路的驗證。
2.3 與 CRC 耐藥相關的血清外泌體 miRs
近年來，隨著治療方案的改進及靶向藥物的應用，CRC 的總體生存率有了較為顯著的提高，但晚期 CRC 患者在應用化療或靶向治療過程中迅速出現的耐藥性限制了當前癌癥治療的效果。在研究者們研究耐藥機制的過程中可能會發現一些新的分子，這些分子可能有助于預測那些轉移性 CRC 患者的臨床結局，還可能基于對這些生物分子的識別，提出更合理的治療策略來改善或克服耐藥性[50]。有研究者[51]通過 miR 芯片分析發現，外泌體miR-125b 在基于 mFOLFOX6 化療方案耐藥的血漿外泌體 miRs 中上調幅度最大，并進一步證實血漿外泌體 miR-125b 的表達水平有助于早期檢測對基于 mFOLFOX6 一線化療的耐藥性，但未對其具體作用機制進行研究。Cheng 等[38]的研究發現，血清外泌體 miR-146a 的表達可調節腫瘤免疫治療的療效，血清外泌體 miR-146a 的表達有利于腫瘤浸潤性 CD8+T 細胞數量的減少，以及腫瘤浸潤性 CD66b+中性粒細胞數量的增加。血漿外泌體 miRs 在介導 CRC 耐藥的機制過程中還可能存在多個分子的聯合調控。有研究者[52]證實，化療耐藥組患者血清外泌體中 miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p 和 miR-96-5p 的表達水平明顯高于化療敏感組；ROC 曲線顯示，4 種 miRs 的組合曲線下面積（AUC）為 0.804（P<0.05）；靶向這些 miRNAs 可能促進 CRC 對奧沙利鉑和 5-氟尿嘧啶的化學敏感性。目前關于血清中的外泌體 miRs 介導 CRC 耐藥的研究較少，尚需更多的研究進一步了解其具體機制。
2.4 與 CRC 診斷及預后相關的血清外泌體 miRs
眾所周知，外周靜脈血液標本采集在臨床應用中最為常見，具有安全、簡便、易實施等優點。自 21 世紀初以來，研究人員一直試圖從血液或活檢中檢測出具有表達特征的基因以作為生物標志物來診斷癌癥[53]，而癌細胞能將包裹 miRs 等分子的外泌體分泌到血液中。因此，近年來關于血清外泌體 miRs 在 CRC 診斷及預后中應用的研究越來越多。有文獻[54]報道，在血清中，與低外泌體 miR-19a 表達相比，高外泌體 miR-19a 表達與較差的存活率顯著相關；外泌體 miR-19a 在血清中的大量表達被確定為 CRC 患者復發的預后生物標志物。miR-21 在血清外泌體、原發腫瘤組織和肝轉移組織中表達上調；血清外泌體 miR-21 高表達患者的總生存（OS）率和無進展生存（DFS）率明顯低于血清外泌體 miR-21 低表達患者[43]。Liu 等[55]納入了 369 例 CRC 患者的外周血標本，經研究發現，血清外泌體miR-27a 或 miR-130a 高表達 CRC 患者的預后較差。Yagi 等[51]發現，血清中外泌體 miR-125b 高表達的患者 DFS 率明顯低于 miR-125b 低表達的患者，經 Cox 多因素分析證實，血清外泌體 miR-125b 對晚期/復發性 CRC 患者的 DFS 具有獨立的預后價值。如前所述[49]，腫瘤組織中的 miR-203 可作為腫瘤抑制因子，而血清中的外泌體 miR-203 被證實為促癌因子；血清外泌體 miR-203 的高表達是 CRC 獨立的不良預后因素[45]。外泌體 miR-548c-5p 在 CRC Ⅲ/Ⅳ期及伴有肝轉移患者血清中的表達水平顯著降低；Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，CRC 血清外泌體 miR-548c-5p 低表達組的 OS 縮短。血清外泌體 miR-548c-5p 的下調可預測 CRC 患者的不良預后[40]。Liu 等[56]進行的前瞻性研究，納入 84 例Ⅱ/Ⅲ期結腸癌患者，在腫瘤切除后輔助治療前采集該隊列患者的血液樣本，隨后進行了隨訪和 RNA 測序以確定血清外泌體 miRs 譜，在復發與非復發患者（27 例復發，57 例未復發）間鑒定出了差異表達 miRs，并通過 Kaplan-Meier 生存分析、腫瘤復發風險的 logistic 回歸、ROC 分析、Cox 回歸分析等一系列研究證實，血清外泌體 miR-4772-3p 的低表達是預測Ⅱ期和Ⅲ期結腸癌患者腫瘤復發的生物標志物。另一項研究[57]納入 168 例 CRC 患者，在 TNM 晚期或有轉移的 CRC 患者中，血清外泌體 miR-6803-5p 明顯升高，其升高者的 OS 和 DFS 較差；經 Cox 回歸分析顯示，高表達的血清外泌體 miR-6803-5p 是 CRC 獨立的不良預后因素。
有研究[58]顯示，作為生物標志物應用于診斷或判斷預后時，單個基因的敏感性往往不如兩個甚至多個基因的組合。如 Wang 等[58]的研究證實，早期結腸癌患者血清外泌體中 miR-125a-3p 的表達明顯上調；此外，miR-125a-3p 能提高 CEA 對早期 CRC 的診斷敏感性。Yu 等[59]發現，與健康受試者相比，CRC 患者血清外泌體中 CRNDE-p（CRC 差異表達的長編碼 RNA）的表達水平較高，而 miR-217 的表達水平較低；ROC 曲線分析結果表明，血清外泌體 CRNDE-p和 miR-217 的組合表達顯示出高靈敏度和特異性，比常規腫瘤標志物 CEA 具有更好的診斷預測效能。Tang 等[46]招募了 142 例 CRC 患者（其中 34 例伴轉移，108 例不伴轉移），經 ROC 曲線分析發現，血清外泌體 miR-320d 診斷 CRC 發生轉移的 AUC 為 0.633，敏感性為 62.0%，特異性為 64.7%；而血清外泌體 miR-320d 和 CEA 組合的 AUC 為 0.804，敏感性為 63.3%，特異性為 91.3%。
綜上，血清外泌體 miRs 的表達在 CRC 診斷、預測預后等方面的應用具有巨大潛力。此外，兩個及以上分子組合的生物標志物有可能提高診斷的敏感性及特異性。
3 小結與展望
盡可能早地發現和診斷 CRC 是改善其預后的關鍵環節。為此，研究者們不斷嘗試尋找敏感性和特異性俱佳的 CRC 生物標志物。而理想的 CRC 生物標志物應該是能夠基于血液或者糞便等體液標本進行準確的篩選，因為這種非侵入性的方式對患者的風險最小，很容易執行，而且可以在短時間間隔內重復[60]。近年來，大量的研究證實，血液循環系統中外泌體 miRs 介導了包括 CRC 在內的人類各種惡性腫瘤的生物學行為[15, 32]。而血清外泌體 miRs 是血液循環系統中外泌體 miRs 的主要形式。通過閱讀、總結上述相關文獻，筆者總結，血清外泌體 miRs 介導了 CRC 的發生發展、轉移、耐藥等多種生物學過程，但其具體的作用通路及分子機制有待進一步的研究。此外，血清外泌體 miRs 在 CRC 診斷及預測預后方面具有巨大潛力，但目前的證據尚不能支撐其應用于臨床。值得一提的是，有研究[59]發現，兩個及以上分子組合的生物標志能提高診斷效率；一些血清外泌體 miRs 能提高傳統的生物標志物（如 CEA 等）的敏感性和特異性。此外，有研究者[47]發現，一些外泌體 miRs 在結腸癌伴肝轉移患者的引流靜脈（腸系膜上靜脈）中與外周靜脈血中的表達并不一致。基于此發現，將來有可能在術中采集 CRC 患者引流靜脈的血液預測其發生肝轉移的風險，從而改善結直腸的預后。筆者認為，這些發現為我們提供了一種新的研究思路，如何更有效地提高已廣泛應用于臨床的現有生物標志物的敏感性和特異性，更值得思考。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：薛源，負責選題、文獻檢索和初稿撰寫工作；李沛東，負責文獻檢索及文章修改；張廣軍，指導選題、審閱文章并及提出修改意見。
