引用本文： 張東陽, 陳小龍, 宋小海, 張世姣, 張維漢, 劉凱, 黃巧容, 孟文彤, 楊昆, 陳心足, 莫顯明, 胡建昆. 胃癌患者外周血中CD45–CD44+CD54+細胞亞群含量及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(4): 434-441. doi: 10.7507/1007-9424.201912012 復制
胃癌是我國高發病率和高死亡率的惡性腫瘤[1]。由于消化內鏡的篩查程度較低，我國早期胃癌患者的比例仍較低，大部分患者診斷時已經處于進展期，其預后效果不佳。另外，胃癌患者在手術治療或藥物治療后，常常通過影像學、消化內鏡和腫瘤標志物聯合判斷腫瘤復發轉移情況，但當前常規的診療技術還無法有效發現一些隱匿的轉移灶，如淋巴結轉移、腹膜轉移、血行轉移等。如何能準確判斷胃癌患者是否存在微轉移對有效制定治療方案和準確判斷胃癌患者預后具有重要意義。
循環腫瘤細胞與腫瘤的復發轉移密切相關。有研究[2]報道，循環腫瘤細胞的數量可以預測腫瘤的轉移、治療反應、無病生存率和總體生存率。但目前研究[3-4]顯示，循環腫瘤細胞的標志物在腫瘤中的應用價值仍待商榷，如針對上皮來源的腫瘤細胞的特征蛋白，運用最廣泛的角蛋白（pan-CK）和上皮細胞黏附分子（EpCAM）的檢測效果還需要更多的長期隨訪數據予以論證[5]。研究[6]發現大部分循環腫瘤細胞可能在外周血中死亡，只有極少一部分能夠生存下來，可能形成復發轉移。已有研究[7-8]證明，腫瘤干細胞具有抵抗上述各種壓力的能力，是腫瘤發生發展、遷移侵襲和治療抵抗的根源，而這數目極少的細胞群很可能就是循環腫瘤干細胞。在胃癌中，我們前期通過無血清培養已分離出胃癌腫瘤干細胞，并發現 CD44 和 CD54 是其特征性標志物，聯合 CD44 和 CD54 這兩種標志物可能用于表征胃癌循環腫瘤細胞[9]。因此，本研究旨在探究胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究納入 2016 年 12 月至 2017 年 9 月期間在四川大學華西醫院胃腸外科住院的胃癌患者 38 例作為研究對象，其中行根治性切除（R0）28 例，姑息性切除 2 例，剖腹探查 3 例，未手術患者 5 例。術前采集其外周靜脈血 3～5 mL 進行流式細胞術檢測。其中，有術后病理學檢測的患者采用病理分期；無術后病理學檢測患者則采用術前臨床分期或術中分期。本研究采用美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第 8 版 TNM 分期系統進行分期。胃癌患者血液采集已獲得患者知情同意以及四川大學華西醫院倫理委員會的審批。本研究中患者的隨訪方式通過電話和門診隨訪，隨訪 31 例，隨訪率為 81.6%。
1.2 方法
1.2.1 流式細胞術檢測
本研究涉及的抗 CD45、CD44 和 CD54 抗體購自 BD Bioscience 公司。于患者術前，用含 EDTA 抗凝的真空采血管采集胃癌患者外周靜脈血 3～5 mL，1 h 內送至四川大學華西醫院胃癌研究室處理。將全血按照體積比為 1∶4 加入紅細胞裂解液中，裂解 15 min。以 300 g、15 min 離心后收集沉淀，觀察裂紅效果，如果不佳，則取裂紅液 5 mL 繼續裂紅細胞沉淀 5 min，離心，收集細胞沉淀。裂紅效果滿意后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）200 μL 重懸細胞沉淀，根據抗體說明書加入熒光標記的抗體 4～10 μL，室溫孵育 30 min，300 g、10 min 離心，PBS 洗滌沉淀，最后加入 0.8 mL PBS 重懸細胞沉淀，然后應用流式細胞儀（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）檢測分析。按照公式計算得到 CD45–CD44+CD54+細胞數量（個/mL）=流式細胞儀計算所得 CD45–CD44+CD54+細胞數量/初始檢測細胞數量×白細胞數量（個/mL）。
1.2.2 CD45–CD44+CD54+細胞亞群與胃癌臨床病理學特征的關系分析
本研究納入標準包括：① 經內鏡活檢證實的胃癌患者；② 臨床病理資料完善；③ 簽署研究知情同意書。本研究的排除標準為：拒絕加入本研究。納入的臨床病理學特征包括患者性別、年齡、腫瘤縱向部位、腫瘤橫向部位、大體分型、分化程度、腫瘤大小、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期、腫瘤標志物、生存時間和生存狀態。
1.2.3 隨訪策略
患者出院后每年 2 次規律電話隨訪加定期門診復查隨訪，記錄其生存狀態、并發癥、復發轉移情況等。本研究中患者的隨訪截止時間為 2019 年 10 月 31 日，結局指標為死亡。
1.3 統計學方法
本研究采用 GraphPad prism 8 軟件進行統計分析。連續變量采用t檢驗、秩和檢驗或方差檢驗，分類變量采用卡方檢驗或秩和檢驗，生存分析采用 Kaplan-Meier 曲線分析，雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。采用受試者操作曲線（ROC 曲線）和約登指數篩選連續變量的最佳截斷值，根據 ROC 曲線下面積的大小比較判斷其對腫瘤進展情況預測的準確性。
2 結果
2.1 外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數檢測結果
本研究共納入 38 例患者，其外周血 CD45–CD44+CD54+細胞流式細胞儀檢測結果見圖 1：納入本研究的 38 例胃癌患者外周血中的 CD45–CD44+CD54+細胞中位數為 541.9 個/mL（71.7～8 057.0 個/mL），R0 組患者的 CD45–CD44+CD54+細胞中位數為 555.9 個/mL（71.7～8 057.0 個/mL）。
圖1
示外周血 CD45–CD44+CD54+細胞流式細胞儀檢測結果
a：CD45–CD44+CD54+細胞流式圖；b：總病例和 R0 組患者的CD45–CD44+CD54+細胞數
2.2 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數與其臨床病理學特征的關系
結果見表 1。由表 1 可見：CD45–CD44+CD54+細胞數量在 N0 期較 N+期高（P=0.003），在 TNM Ⅰ–Ⅱ期中較 TNM Ⅲ–Ⅳ期高（P=0.016），除此之外，CD45–CD44+CD54+細胞數量在其他臨床病理學特征中的差異均無統計學意義（P>0.05）。
表1
胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數與其臨床病理學特征的關系
2.3 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞不同數值與其臨床病理學特征的關系
根據 CD45–CD44+CD54+細胞數對胃癌 TNM 分期判斷的 ROC 曲線（圖 2）及約登指數[10]，本研究以 CD45–CD44+CD54+細胞數 300 個/mL 和 700 個/mL 為分界，將納入本研究的患者分為 3 組，即 CD45–CD44+CD54+細胞數<300 個/mL 組（低細胞量組，n=9）、300～700 個/mL 組（中細胞量組，n=16）和≥700 個/mL 組（高細胞量組，n=13）。比較 3 組患者的臨床病理學特征發現：CD45–CD44+CD54+高細胞量組中 T3–4 期（P=0.025）、N+期（P=0.009）和 TNM Ⅲ–Ⅳ期（P=0.012）胃癌患者所占的比例明顯降低；分析其與腫瘤標志物的關系發現：相比于低細胞量組和高細胞量組，中細胞量組的 CA72-4 濃度最低（P=0.012）；但 3 組間其他臨床病理學特征分析結果顯示其差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
圖2
示 CD45–CD44+CD54+細胞數對胃癌 TNM 分期判斷的 ROC 曲線
2.4 CD45–CD44+CD54+細胞數聯合腫瘤直徑對胃癌 TNM 分期和 N 分期的判斷效果
前述結果提示 CD45–CD44+CD54+細胞數與胃癌的 N 分期和 TNM 分期相關，本研究對此開展了進一步分析。除 CD45–CD44+CD54+細胞量與腫瘤 N 分期和 TNM 分期密切相關外，對其余臨床病理學特征的曲線下面積相對較小，故未納入進一步分析。對 TNM 分期的判斷而言，在總病例中，CD45–CD44+CD54+細胞數 ROC 曲線下面積（AUC）為 0.762 ［95%CI 為（0.608，0.915）］，見圖 3a，在 R0 組中AUC為 0.842 ［95%CI為（0.700，0.988）］，見圖 3b。對 N 分期而言，在總病例中，CD45–CD44+CD54+細胞數AUC為 0.768 ［95% CI為（0.608，0.928）］，見圖 3c，在 R0 組中AUC為 0.804 ［95% CI為（0.634，0.973）］，見圖 3d。對 TNM 分期的判斷而言，在總病例中，腫瘤直徑（<5 cm 和≥5 cm）的AUC為 0.790 ［95% CI為（0.638，0.941）］，見圖 3e，在 R0 組中AUC為 0.784 ［95% CI為（0.591，0.976）］，見圖 3f。對 N 分期的判斷而言，在總病例中，腫瘤直徑的 AUC為 0.726 ［95% CI為（0.557，0.895）］，見圖 3g，在 R0 組中AUC為 0.679 ［95% CI為（0.475，0.882）］，見圖 3h。
圖3
示 CD45–CD44+CD54+細胞數量和腫瘤直徑以及二者的綜合評分對胃癌 TNM 分期和 N 分期的 ROC 曲線
a：在總病例中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 TNM 分期的 ROC 曲線；b：在 R0 組中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 TNM 分期的 ROC 曲線；c：在總病例中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 N 分期的 ROC 曲線；d：在 R0 組中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 N 分期的 ROC 曲線；e：在總病例中腫瘤直徑對 TNM 分期的 ROC 曲線；f：在 R0 組中腫瘤直徑對 TNM 分期的 ROC 曲線；g：在總病例中腫瘤直徑對 N 分期的 ROC 曲線；h：在 R0 組中腫瘤直徑對 N 分期的 ROC 曲線；i：在總病例中綜合得分對 TNM 分期的 ROC 曲線；j：在 R0 組中綜合得分對 TNM 分期的 ROC 曲線；k：在總病例中綜合得分對 N 分期的 ROC 曲線；l：在 R0 組中綜合得分對 N 分期的 ROC 曲線
進一步將 CD45–CD44+CD54+細胞的不同數量（低細胞量=2 分、中細胞量=1 分、高細胞量=0 分）和不同腫瘤直徑（<5 cm=0 分、≥5 cm=1 分）的分值相加形成綜合評分（0～3 分），利用 ROC 曲線分析此綜合評分對胃癌 TNM 分期和 N 分期的判斷效能。對胃癌 TNM 分期而言，在總病例中，綜合評分的AUC為 0.895 ［95% CI 為（0.795，0.995）］，見圖 3i；在 R0 組中，AUC為 0.930 ［95% CI 為（0.828，1.000）］，見圖 3j。對胃癌 N 分期而言，在總病例中，綜合評分的AUC為 0.857 ［95% CI 為（0.738，0.977）］，見圖 3k；在 R0 組中，AUC為 0.837 ［95% CI 為（0.685，0.988）］，見圖 3l。綜合評分的AUC均高于單獨的 CD45–CD44+CD54+細胞數和單獨的腫瘤直徑。
2.5 CD45–CD44+CD54+細胞數與胃癌患者短期預后的關系
本次研究的隨訪截止時間為 2019 年 10 月 31 日，結局指標為死亡，獲隨訪 31 例，隨訪率為 81.6%，中位隨訪時間為 26.2 個月（5.0～30 個月），隨訪結果為死亡。通過 Kaplan-Meier 曲線分析發現，CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者間的 2 年生存率差異無統計學意義（P=0.819），見圖 4a；在 R0 組中，CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者間的 2 年生存率差異也無統計學意義（P =0.942），見圖 4b。
圖4
示 CD45–CD44+CD54+細胞不同數量組的生存曲線
a：總病例 CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者的生存曲線；b：R0 組 CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者的生存曲線
3 討論
循環腫瘤細胞被認為在腫瘤轉移中發揮了重要作用，檢測循環腫瘤細胞的目的主要是判斷是否存在腫瘤轉移，是否能預測患者預后，是否能判斷腫瘤的治療效果。多數研究[2,11-18]發現循環腫瘤細胞的有無或多少與胃癌進展關系密切，存在或高含量的循環腫瘤細胞常常與胃癌淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發、神經浸潤、彌漫型腫瘤、更晚分期和不良預后相關。但也有研究[18-20]發現，循環腫瘤細胞與其臨床病理學特征包括與 TNM 分期無明顯相關性；還有學者[11]發現循環腫瘤細胞陰性的患者中 TNM Ⅲ–Ⅳ期比例更大，但差異并無統計學意義；有研究[19]報道，雖然循環腫瘤細胞陽性胃癌患者預后較陰性組差，但并未達到統計學差異。本研究通過生存分析發現：CD45–CD44+CD54+細胞亞群含量亞組之間的生存差異無統計學意義，可能系樣本量較少且隨訪時間較短所致。
循環腫瘤細胞的標志物主要以上皮源性分子為特征性識別靶點，包括 pan-CK、EpCAM 等，并以循環系統特異性標志物 CD45、CD68 等作為剔除標志，通過這些標志物富集外周血中得到的上皮源性細胞，即認定為循環腫瘤細胞[13,16-18,20-24]。但有研究者[25-26]認為，外周血中的循環腫瘤細胞可能在從腫瘤實體到外周血的過程中，發生上皮間質轉化（EMT）現象，導致通過只檢測上皮源性的分子來識別循環腫瘤細胞是不嚴謹和不足夠的。因此，有研究[16,24]把間質源性標志物如 Vimentin 和 Twist 也作為識別分子，聯合上皮源性分子共同識別循環腫瘤細胞。還有學者[27-29]認為，外周血中的循環腫瘤細胞可能大部分被血流剪切力破壞或免疫細胞殺傷而死亡，只有極少部分具有腫瘤干細胞特性的循環腫瘤細胞存活，即循環腫瘤干細胞，而這些循環腫瘤干細胞可能表達腫瘤干細胞的特征性分子。因此，在胃癌循環腫瘤細胞的研究中，也有研究者[11,30-31]把腫瘤干細胞相關標志物 CD44 也作為循環腫瘤細胞的特征性識別靶點。綜上，當前人們對循環腫瘤細胞的鑒定標準一直無法達成共識，其準確檢測技術也面臨較大的困難。筆者所在團隊前期通過無血清培養和連續移植成瘤的技術，成功分選和鑒定出了胃癌腫瘤干細胞，并發現其特征性表達 CD44 和 CD54[9]，因此，我們思考胃癌患者外周血中的循環腫瘤細胞是否也可能表達 CD44 和 CD54。目前尚無專門針對 CD44 和 CD54 識別的試劑盒和儀器設備[12-18,21-24,31]。所以本研究采用流式細胞術的方式，通過負選血液系統特征性標志物 CD45，正選胃癌腫瘤干細胞標志物 CD44 和 CD54，檢測胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量。其結果顯示：CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量較高，平均約 1 000 個/mL，較高于既往文獻報道的平均水平。分析原因，可能是本研究并未通過廣泛報道的上皮源性標志物和間質源性標志物來篩選細胞亞群。除此之外本研究還發現 CD45–CD44+CD54+細胞亞群數量與胃癌 N 分期和 TNM 分期之間存在相關性，即 N 分期和 TNM 分期晚者其 CD45–CD44+CD54+的細胞數量則少，差異具有統計學意義。由于本研究是單純通過標志物篩選 CD45–CD44+CD54+細胞亞群，尚未經過功能學實驗驗證。因此，該亞群細胞尚不能代表是循環腫瘤干細胞，這可能導致本研究出現與既往研究[2,11-18]不同的結果。另外，該細胞亞群可能存在某種機制促進胃癌的進展，還有待進一步研究。
另外，本研究發現結合 CD45–CD44+CD54+細胞數量與腫瘤大小形成的綜合評分對判斷胃癌 TNM 分期和 N 分期的效果較好，可能作為預測腫瘤 N 分期和 TNM 分期的指標。
本研究的不足之處在于樣本量較少，隨訪時間較短，失訪患者稍多，一定程度上影響了統計學檢驗效能。另外，本研究還納入了非手術的患者，可能對腫瘤的準確分期有一定影響。
4 結論
CD45–CD44+CD54+細胞亞群的數量與腫瘤進展有相關性，可能用于判斷胃癌的 TNM 分期和 N 分期。但由于本研究納入患者數較少，仍需擴大樣本進一步論證 CD45–CD44+CD54+細胞亞群在胃癌患者中的臨床意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張東陽、陳小龍、胡建昆、莫顯明設計研究思路；張維漢、劉凱、張世姣收集臨床資料與隨訪；宋小海、黃巧容、孟文彤完成流式細胞實驗；張東陽、陳小龍完成數據的整理及論文撰寫；陳心足、楊昆給予論文統計學分析；胡建昆、莫顯明審校論文。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院臨床試驗與生物倫理專委會審查［審批文號2014 年審（82）號］。
胃癌是我國高發病率和高死亡率的惡性腫瘤[1]。由于消化內鏡的篩查程度較低，我國早期胃癌患者的比例仍較低，大部分患者診斷時已經處于進展期，其預后效果不佳。另外，胃癌患者在手術治療或藥物治療后，常常通過影像學、消化內鏡和腫瘤標志物聯合判斷腫瘤復發轉移情況，但當前常規的診療技術還無法有效發現一些隱匿的轉移灶，如淋巴結轉移、腹膜轉移、血行轉移等。如何能準確判斷胃癌患者是否存在微轉移對有效制定治療方案和準確判斷胃癌患者預后具有重要意義。
循環腫瘤細胞與腫瘤的復發轉移密切相關。有研究[2]報道，循環腫瘤細胞的數量可以預測腫瘤的轉移、治療反應、無病生存率和總體生存率。但目前研究[3-4]顯示，循環腫瘤細胞的標志物在腫瘤中的應用價值仍待商榷，如針對上皮來源的腫瘤細胞的特征蛋白，運用最廣泛的角蛋白（pan-CK）和上皮細胞黏附分子（EpCAM）的檢測效果還需要更多的長期隨訪數據予以論證[5]。研究[6]發現大部分循環腫瘤細胞可能在外周血中死亡，只有極少一部分能夠生存下來，可能形成復發轉移。已有研究[7-8]證明，腫瘤干細胞具有抵抗上述各種壓力的能力，是腫瘤發生發展、遷移侵襲和治療抵抗的根源，而這數目極少的細胞群很可能就是循環腫瘤干細胞。在胃癌中，我們前期通過無血清培養已分離出胃癌腫瘤干細胞，并發現 CD44 和 CD54 是其特征性標志物，聯合 CD44 和 CD54 這兩種標志物可能用于表征胃癌循環腫瘤細胞[9]。因此，本研究旨在探究胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究納入 2016 年 12 月至 2017 年 9 月期間在四川大學華西醫院胃腸外科住院的胃癌患者 38 例作為研究對象，其中行根治性切除（R0）28 例，姑息性切除 2 例，剖腹探查 3 例，未手術患者 5 例。術前采集其外周靜脈血 3～5 mL 進行流式細胞術檢測。其中，有術后病理學檢測的患者采用病理分期；無術后病理學檢測患者則采用術前臨床分期或術中分期。本研究采用美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第 8 版 TNM 分期系統進行分期。胃癌患者血液采集已獲得患者知情同意以及四川大學華西醫院倫理委員會的審批。本研究中患者的隨訪方式通過電話和門診隨訪，隨訪 31 例，隨訪率為 81.6%。
1.2 方法
1.2.1 流式細胞術檢測
本研究涉及的抗 CD45、CD44 和 CD54 抗體購自 BD Bioscience 公司。于患者術前，用含 EDTA 抗凝的真空采血管采集胃癌患者外周靜脈血 3～5 mL，1 h 內送至四川大學華西醫院胃癌研究室處理。將全血按照體積比為 1∶4 加入紅細胞裂解液中，裂解 15 min。以 300 g、15 min 離心后收集沉淀，觀察裂紅效果，如果不佳，則取裂紅液 5 mL 繼續裂紅細胞沉淀 5 min，離心，收集細胞沉淀。裂紅效果滿意后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）200 μL 重懸細胞沉淀，根據抗體說明書加入熒光標記的抗體 4～10 μL，室溫孵育 30 min，300 g、10 min 離心，PBS 洗滌沉淀，最后加入 0.8 mL PBS 重懸細胞沉淀，然后應用流式細胞儀（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）檢測分析。按照公式計算得到 CD45–CD44+CD54+細胞數量（個/mL）=流式細胞儀計算所得 CD45–CD44+CD54+細胞數量/初始檢測細胞數量×白細胞數量（個/mL）。
1.2.2 CD45–CD44+CD54+細胞亞群與胃癌臨床病理學特征的關系分析
本研究納入標準包括：① 經內鏡活檢證實的胃癌患者；② 臨床病理資料完善；③ 簽署研究知情同意書。本研究的排除標準為：拒絕加入本研究。納入的臨床病理學特征包括患者性別、年齡、腫瘤縱向部位、腫瘤橫向部位、大體分型、分化程度、腫瘤大小、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期、腫瘤標志物、生存時間和生存狀態。
1.2.3 隨訪策略
患者出院后每年 2 次規律電話隨訪加定期門診復查隨訪，記錄其生存狀態、并發癥、復發轉移情況等。本研究中患者的隨訪截止時間為 2019 年 10 月 31 日，結局指標為死亡。
1.3 統計學方法
本研究采用 GraphPad prism 8 軟件進行統計分析。連續變量采用t檢驗、秩和檢驗或方差檢驗，分類變量采用卡方檢驗或秩和檢驗，生存分析采用 Kaplan-Meier 曲線分析，雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。采用受試者操作曲線（ROC 曲線）和約登指數篩選連續變量的最佳截斷值，根據 ROC 曲線下面積的大小比較判斷其對腫瘤進展情況預測的準確性。
2 結果
2.1 外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數檢測結果
本研究共納入 38 例患者，其外周血 CD45–CD44+CD54+細胞流式細胞儀檢測結果見圖 1：納入本研究的 38 例胃癌患者外周血中的 CD45–CD44+CD54+細胞中位數為 541.9 個/mL（71.7～8 057.0 個/mL），R0 組患者的 CD45–CD44+CD54+細胞中位數為 555.9 個/mL（71.7～8 057.0 個/mL）。
圖1
示外周血 CD45–CD44+CD54+細胞流式細胞儀檢測結果
a：CD45–CD44+CD54+細胞流式圖；b：總病例和 R0 組患者的CD45–CD44+CD54+細胞數
2.2 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數與其臨床病理學特征的關系
結果見表 1。由表 1 可見：CD45–CD44+CD54+細胞數量在 N0 期較 N+期高（P=0.003），在 TNM Ⅰ–Ⅱ期中較 TNM Ⅲ–Ⅳ期高（P=0.016），除此之外，CD45–CD44+CD54+細胞數量在其他臨床病理學特征中的差異均無統計學意義（P>0.05）。
表1
胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞數與其臨床病理學特征的關系
2.3 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+細胞不同數值與其臨床病理學特征的關系
根據 CD45–CD44+CD54+細胞數對胃癌 TNM 分期判斷的 ROC 曲線（圖 2）及約登指數[10]，本研究以 CD45–CD44+CD54+細胞數 300 個/mL 和 700 個/mL 為分界，將納入本研究的患者分為 3 組，即 CD45–CD44+CD54+細胞數<300 個/mL 組（低細胞量組，n=9）、300～700 個/mL 組（中細胞量組，n=16）和≥700 個/mL 組（高細胞量組，n=13）。比較 3 組患者的臨床病理學特征發現：CD45–CD44+CD54+高細胞量組中 T3–4 期（P=0.025）、N+期（P=0.009）和 TNM Ⅲ–Ⅳ期（P=0.012）胃癌患者所占的比例明顯降低；分析其與腫瘤標志物的關系發現：相比于低細胞量組和高細胞量組，中細胞量組的 CA72-4 濃度最低（P=0.012）；但 3 組間其他臨床病理學特征分析結果顯示其差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
圖2
示 CD45–CD44+CD54+細胞數對胃癌 TNM 分期判斷的 ROC 曲線
2.4 CD45–CD44+CD54+細胞數聯合腫瘤直徑對胃癌 TNM 分期和 N 分期的判斷效果
前述結果提示 CD45–CD44+CD54+細胞數與胃癌的 N 分期和 TNM 分期相關，本研究對此開展了進一步分析。除 CD45–CD44+CD54+細胞量與腫瘤 N 分期和 TNM 分期密切相關外，對其余臨床病理學特征的曲線下面積相對較小，故未納入進一步分析。對 TNM 分期的判斷而言，在總病例中，CD45–CD44+CD54+細胞數 ROC 曲線下面積（AUC）為 0.762 ［95%CI 為（0.608，0.915）］，見圖 3a，在 R0 組中AUC為 0.842 ［95%CI為（0.700，0.988）］，見圖 3b。對 N 分期而言，在總病例中，CD45–CD44+CD54+細胞數AUC為 0.768 ［95% CI為（0.608，0.928）］，見圖 3c，在 R0 組中AUC為 0.804 ［95% CI為（0.634，0.973）］，見圖 3d。對 TNM 分期的判斷而言，在總病例中，腫瘤直徑（<5 cm 和≥5 cm）的AUC為 0.790 ［95% CI為（0.638，0.941）］，見圖 3e，在 R0 組中AUC為 0.784 ［95% CI為（0.591，0.976）］，見圖 3f。對 N 分期的判斷而言，在總病例中，腫瘤直徑的 AUC為 0.726 ［95% CI為（0.557，0.895）］，見圖 3g，在 R0 組中AUC為 0.679 ［95% CI為（0.475，0.882）］，見圖 3h。
圖3
示 CD45–CD44+CD54+細胞數量和腫瘤直徑以及二者的綜合評分對胃癌 TNM 分期和 N 分期的 ROC 曲線
a：在總病例中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 TNM 分期的 ROC 曲線；b：在 R0 組中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 TNM 分期的 ROC 曲線；c：在總病例中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 N 分期的 ROC 曲線；d：在 R0 組中 CD45–CD44+CD54+細胞數對 N 分期的 ROC 曲線；e：在總病例中腫瘤直徑對 TNM 分期的 ROC 曲線；f：在 R0 組中腫瘤直徑對 TNM 分期的 ROC 曲線；g：在總病例中腫瘤直徑對 N 分期的 ROC 曲線；h：在 R0 組中腫瘤直徑對 N 分期的 ROC 曲線；i：在總病例中綜合得分對 TNM 分期的 ROC 曲線；j：在 R0 組中綜合得分對 TNM 分期的 ROC 曲線；k：在總病例中綜合得分對 N 分期的 ROC 曲線；l：在 R0 組中綜合得分對 N 分期的 ROC 曲線
進一步將 CD45–CD44+CD54+細胞的不同數量（低細胞量=2 分、中細胞量=1 分、高細胞量=0 分）和不同腫瘤直徑（<5 cm=0 分、≥5 cm=1 分）的分值相加形成綜合評分（0～3 分），利用 ROC 曲線分析此綜合評分對胃癌 TNM 分期和 N 分期的判斷效能。對胃癌 TNM 分期而言，在總病例中，綜合評分的AUC為 0.895 ［95% CI 為（0.795，0.995）］，見圖 3i；在 R0 組中，AUC為 0.930 ［95% CI 為（0.828，1.000）］，見圖 3j。對胃癌 N 分期而言，在總病例中，綜合評分的AUC為 0.857 ［95% CI 為（0.738，0.977）］，見圖 3k；在 R0 組中，AUC為 0.837 ［95% CI 為（0.685，0.988）］，見圖 3l。綜合評分的AUC均高于單獨的 CD45–CD44+CD54+細胞數和單獨的腫瘤直徑。
2.5 CD45–CD44+CD54+細胞數與胃癌患者短期預后的關系
本次研究的隨訪截止時間為 2019 年 10 月 31 日，結局指標為死亡，獲隨訪 31 例，隨訪率為 81.6%，中位隨訪時間為 26.2 個月（5.0～30 個月），隨訪結果為死亡。通過 Kaplan-Meier 曲線分析發現，CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者間的 2 年生存率差異無統計學意義（P=0.819），見圖 4a；在 R0 組中，CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者間的 2 年生存率差異也無統計學意義（P =0.942），見圖 4b。
圖4
示 CD45–CD44+CD54+細胞不同數量組的生存曲線
a：總病例 CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者的生存曲線；b：R0 組 CD45–CD44+CD54+低、中、高細胞量組患者的生存曲線
3 討論
循環腫瘤細胞被認為在腫瘤轉移中發揮了重要作用，檢測循環腫瘤細胞的目的主要是判斷是否存在腫瘤轉移，是否能預測患者預后，是否能判斷腫瘤的治療效果。多數研究[2,11-18]發現循環腫瘤細胞的有無或多少與胃癌進展關系密切，存在或高含量的循環腫瘤細胞常常與胃癌淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤復發、神經浸潤、彌漫型腫瘤、更晚分期和不良預后相關。但也有研究[18-20]發現，循環腫瘤細胞與其臨床病理學特征包括與 TNM 分期無明顯相關性；還有學者[11]發現循環腫瘤細胞陰性的患者中 TNM Ⅲ–Ⅳ期比例更大，但差異并無統計學意義；有研究[19]報道，雖然循環腫瘤細胞陽性胃癌患者預后較陰性組差，但并未達到統計學差異。本研究通過生存分析發現：CD45–CD44+CD54+細胞亞群含量亞組之間的生存差異無統計學意義，可能系樣本量較少且隨訪時間較短所致。
循環腫瘤細胞的標志物主要以上皮源性分子為特征性識別靶點，包括 pan-CK、EpCAM 等，并以循環系統特異性標志物 CD45、CD68 等作為剔除標志，通過這些標志物富集外周血中得到的上皮源性細胞，即認定為循環腫瘤細胞[13,16-18,20-24]。但有研究者[25-26]認為，外周血中的循環腫瘤細胞可能在從腫瘤實體到外周血的過程中，發生上皮間質轉化（EMT）現象，導致通過只檢測上皮源性的分子來識別循環腫瘤細胞是不嚴謹和不足夠的。因此，有研究[16,24]把間質源性標志物如 Vimentin 和 Twist 也作為識別分子，聯合上皮源性分子共同識別循環腫瘤細胞。還有學者[27-29]認為，外周血中的循環腫瘤細胞可能大部分被血流剪切力破壞或免疫細胞殺傷而死亡，只有極少部分具有腫瘤干細胞特性的循環腫瘤細胞存活，即循環腫瘤干細胞，而這些循環腫瘤干細胞可能表達腫瘤干細胞的特征性分子。因此，在胃癌循環腫瘤細胞的研究中，也有研究者[11,30-31]把腫瘤干細胞相關標志物 CD44 也作為循環腫瘤細胞的特征性識別靶點。綜上，當前人們對循環腫瘤細胞的鑒定標準一直無法達成共識，其準確檢測技術也面臨較大的困難。筆者所在團隊前期通過無血清培養和連續移植成瘤的技術，成功分選和鑒定出了胃癌腫瘤干細胞，并發現其特征性表達 CD44 和 CD54[9]，因此，我們思考胃癌患者外周血中的循環腫瘤細胞是否也可能表達 CD44 和 CD54。目前尚無專門針對 CD44 和 CD54 識別的試劑盒和儀器設備[12-18,21-24,31]。所以本研究采用流式細胞術的方式，通過負選血液系統特征性標志物 CD45，正選胃癌腫瘤干細胞標志物 CD44 和 CD54，檢測胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量。其結果顯示：CD45–CD44+CD54+細胞亞群的含量較高，平均約 1 000 個/mL，較高于既往文獻報道的平均水平。分析原因，可能是本研究并未通過廣泛報道的上皮源性標志物和間質源性標志物來篩選細胞亞群。除此之外本研究還發現 CD45–CD44+CD54+細胞亞群數量與胃癌 N 分期和 TNM 分期之間存在相關性，即 N 分期和 TNM 分期晚者其 CD45–CD44+CD54+的細胞數量則少，差異具有統計學意義。由于本研究是單純通過標志物篩選 CD45–CD44+CD54+細胞亞群，尚未經過功能學實驗驗證。因此，該亞群細胞尚不能代表是循環腫瘤干細胞，這可能導致本研究出現與既往研究[2,11-18]不同的結果。另外，該細胞亞群可能存在某種機制促進胃癌的進展，還有待進一步研究。
另外，本研究發現結合 CD45–CD44+CD54+細胞數量與腫瘤大小形成的綜合評分對判斷胃癌 TNM 分期和 N 分期的效果較好，可能作為預測腫瘤 N 分期和 TNM 分期的指標。
本研究的不足之處在于樣本量較少，隨訪時間較短，失訪患者稍多，一定程度上影響了統計學檢驗效能。另外，本研究還納入了非手術的患者，可能對腫瘤的準確分期有一定影響。
4 結論
CD45–CD44+CD54+細胞亞群的數量與腫瘤進展有相關性，可能用于判斷胃癌的 TNM 分期和 N 分期。但由于本研究納入患者數較少，仍需擴大樣本進一步論證 CD45–CD44+CD54+細胞亞群在胃癌患者中的臨床意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：張東陽、陳小龍、胡建昆、莫顯明設計研究思路；張維漢、劉凱、張世姣收集臨床資料與隨訪；宋小海、黃巧容、孟文彤完成流式細胞實驗；張東陽、陳小龍完成數據的整理及論文撰寫；陳心足、楊昆給予論文統計學分析；胡建昆、莫顯明審校論文。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院臨床試驗與生物倫理專委會審查［審批文號2014 年審（82）號］。
