引用本文： 梁立洲, 鄧振灃, 金宗睿, 吳國林, 徐邦浩, 郭雅, 王繼龍, 文張. 腫瘤相關中性粒細胞釋放 APRIL 對胰腺癌細胞增殖活性的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(8): 940-944. doi: 10.7507/1007-9424.201911060 復制
胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，胰腺癌患者的總體 5 年生存率是 8%，在所有主要的癌癥類型中是最低的[1]，因此胰腺癌病例數與死亡數幾乎一樣多[2]。預后極差的主要原因是胰腺癌對現有的多種治療方法反應較差[3]。胰腺癌豐富的間質存在明顯的纖維化-炎癥反應和多種免疫細胞。這些間質成分所構成的腫瘤微環境促進了胰腺癌的進展及治療抵抗。筆者所在團隊前期的研究結果發現，胰腺癌間質中的免疫細胞可通過釋放白介素-22[4]，促進胰腺癌進展。中性粒細胞除了具有吞噬和殺滅細菌、參與急性炎癥反應的作用外，在調節腫瘤微環境中也起到了重要作用。Oberg 等[5]報道中性粒細胞發揮促腫瘤作用，可以促進腫瘤生長、血管生成和轉移侵襲，其中腫瘤微環境中的中性粒細胞被稱為腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophil，TAN）。研究表明，腫瘤微環境中的 TAN 可通過分泌增殖誘導配體（APRIL）促進肺癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]等多種惡性腫瘤的進展，然而目前對于 TAN 在胰腺癌微環境中與胰腺癌細胞相互作用及對胰腺癌進展的影響有待進一步研究。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
人胰腺癌 PANC-1 細胞和人早幼粒白血病細胞 HL-60 購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（產品目錄號分別為 TCHu 98 和 TCHu 23）；DMEM/高糖培養基、RPMI1640 培養基和青鏈霉素混合液購自 Gibco 公司（產品目錄號分別為 C11995500BT、C11875500BT 和 15140122）；胎牛血清購自 Lonsera 公司（產品目錄號為 S711-001S）；ELISA 試劑盒購自北京博奧森公司（產品目錄號為 bsk00326）；多克隆抗兔 B 細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和跨膜激活劑及鈣調親環素配基相互作用因子（trans-membrane activator and CAML interactor，TACI）抗體購自北京博奧森公司（產品目錄號分別為 bs3850R 和 bs4841R）；人工重組 APRIL 蛋白（rAPRIL）購自 Peprotech 公司（產品目錄號為 96-310-10C-100）；APRIL 中和抗體（鼠抗人 APRIL 中和性抗體）購自 R&D 公司（產品目錄號為 MAB5860）；Transwell 小室（0.4 μm）購自 Corning 公司（產品目錄號為 3413）；CCK8 試劑盒購自美侖公司（產品目錄號為 MA0218）；DMSO 購自 Sigma 公司（產品目錄號為 D2650）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
1.2.1.1 人胰腺癌 PANC-1 細胞培養
取 7.5×105/mL 的人胰腺癌 PANC-1 細胞接種于 T75 細胞培養瓶，采用 DMEM/高糖完全培養基（添加 10% 胎牛血清+1% 青鏈霉素混合液），在 37 ℃、5% CO2 培養箱培養。每 2～3 d 換液，待細胞生長匯合至對數生長期時傳代，傳至第 3～10 代備用。
1.2.1.2 制備 PANC-1 細胞條件培養基
① 待細胞培養瓶中的胰腺癌細胞生長至匯合對數生長期，棄去舊培養基，加入 PBS 輕柔沖洗 3 次，以充分去除殘余血清對后續實驗的影響；② 向細胞培養瓶中加入不含胎牛血清的 DMEM/高糖培養基，置于細胞培養箱培養 48 h；③ 48 h 之后，吸取細胞培養基，用 Millipore 濾器（0.2 μm）過濾細胞培養基，去除懸浮細胞等顆粒，純化條件培養基，放置于 –80° 冰箱中保存。
1.2.1.3 人早幼粒白血病細胞 HL-60 培養
取 2×105/mL 的人早幼粒白血病細胞 HL-60 接種于 T75 細胞培養瓶，采用 RPMI 1640 完全培養基（添加 10% 胎牛血清+1% 青鏈霉素混合液），在 37 ℃、5% CO2 培養箱培養。每 2～3 d 換液，800 r/min 離心 5 min（r=15 cm）后重懸細胞，使細胞密度達到 1×105 個/mL 進行傳代培養，傳至第 3～10 代備用。
1.2.1.4 HL-60 細胞分化為類中性粒細胞
在 T75 培養瓶中添加 7.5 mL RPMI 1640 完全培養基，加入 130 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）至終濃度為 1.3%，充分混勻。取 2.5 mL 處于對數生長期的 HL-60 細胞加入上述培養基[9]，置于 37 ℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養，期間不換液。類中性粒細胞轉化為 TAN 用上述胰腺癌細胞 PANC-1 的條件培養基重懸類中性粒細胞，放入細胞培養箱中培養 24 h 轉化為 TAN，制備 TAN 的條件培養基（方法同 PANC-1 細胞條件培養基的制備）。
1.2.2 TAN 對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖活性影響的體外實驗
1.2.2.1 ELISA 法檢測 APRIL 的表達
用 ELISA 試劑盒檢測類中性粒細胞和 TAN 條件培養基中 APRIL 的含量，每個實驗組均設 3 個復孔，取均值。
1.2.2.2 蛋白印跡法驗證 APRIL 受體 BCMA 和 TACI 蛋白的表達
用不同時間點的 PANC-1 細胞做復孔驗證 BCMA 和 TACI 的表達。實驗分組：① PANC-1 細胞，培養 48 h；② PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 12 h；③ PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 24 h；④ PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 48 h。提取各組 PANC-1 細胞總蛋白，進行非連續性 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離蛋白后，將蛋白轉移到 PVDF 膜上，用含 5% BSA 的 TBST 緩沖液封閉，加入 BCMA 和 TACI 一抗 4 ℃ 孵育過夜，再用熒光二抗避光孵育 1 h 后，用 Odyssey 成像紅外分析系統掃膜顯影。
1.2.2.3 CCK8 檢測 TAN 對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖能力的影響
每個實驗組均設 3 個復孔，取均值。將 PANC-I 細胞與 TAN 進行共培養（下室：PANC-1 細胞，上室：TAN）。實驗分 4 組，即 PANC-1 對照組（簡稱對照組）、PANC-1+TAN 處理組（簡稱 PANC-1+TAN 組）、PANC-1+TAN+APRIL 抗體處理組（簡稱 PANC-1+TAN+APRIL 組）和 PANC-1+人工重組 APRIL 蛋白（rAPRIL）處理組（簡稱 PANC-1+rAPRIL 組）。PANC-1 細胞密度均為 5×104/孔，加入 TAN 的細胞密度均為 2×105/孔，APRIL 抗體濃度 0.5 μg/mL，rAPRIL 濃度 5 ng/mL，培養 24 h。加入 10% CCK8 后避光、37 ℃ 孵育 4 h，孵育后立即在全波長酶標儀 450 nm 和 630 nm 波長處檢測吸光度值（A 值），以該值代表 PANCI-1 細胞的活性大小。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件對數據進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，對于多組間均數的比較采用單因素方差分析，證實各組間均數有差異后，采用 Dunnett-t 檢驗比較各處理組和對照組間的關系；采用 Bonferroni 法進一步多重比較各組間的關系。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 中性粒細胞和 TAN 釋放 APRIL 的檢測結果
ELISA 檢測結果顯示：中性粒細胞組的 APRIL 含量為（377.17±57.07）pg/mL，TAN 組為（556.20±84.38） pg/mL，TAN 細胞組培養基中 APRIL 含量高于中性粒細胞組，其差異有統計學意義（P=0.038），見圖 1a。
圖1
示本實驗結果
a：示 ELISA 法檢測中性粒細胞和 TAN 培養基中釋放的 APRIL 含量；b：示不同培養時間 PANC-1 細胞中 APRIL 受體 BCMA 和 TACI 均呈陽性表達；c：示 TAN 釋放 APRIL 對 PANC1 細胞增殖活性影響的檢測結果
2.2 PANC-1 細胞表達 APRIL 受體檢測結果
蛋白印跡法檢測各組 PANC-1 細胞表面 APRIL 受體的表達，其結果顯示：各組 TACI 和 BCMA 受體蛋白表達均呈陽性，見圖 1b。
2.3 TAN 釋放 APRIL 對 PANC1 增殖活性的影響
CCK8 檢測結果顯示：PANC-1 細胞增殖活性對照組為（100±0.00）%，PANC-1+TAN 組為（126.80±1.42）%，PANC-1+TAN+APRIL 組為（86.29±12.20）%，PANC-1+rAPRIL 組為（168.95±12.54）%。單因素方差分析結果顯示各組間均數差異有統計學意義（F=51.64，P<0.001）。① 采用 Dunnett-t 檢驗進一步比較各處理組和對照組間的關系，結果顯示：PANC-1+TAN 組和 PANC-1+rAPRIL 組的 PANC-1 活性明顯高于對照組（P=0.034，P<0.001），提示在 TAN 釋放 APRIL 或添加 rAPRIL 的條件下，PANC-1 活性上升。雖然 PANC-1+TAN+APRIL 組的 PANC-1 細胞增殖活性比對照組低，但 2 組比較其差異無統計學意義（P>0.05）。② 采用 Bonferroni 法進一步多重比較各組間的關系，結果顯示：PANC-1+TAN 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著高于 PANC-1+TAN+APRIL 組（P=0.003），提示在 APRIL 抗體的作用下，減弱或阻斷了 APRIL 的刺激，PANC-1 的細胞增殖活性下降；PANC-1+rAPRIL 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著高于 PANC-1+TAN+APRIL 組（P<0.001），PANC-1+TAN 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著低于 PANC-1+rAPRIL 組（P=0.002），見圖 1c。
3 討論
胰腺癌是常見的高度惡性腫瘤，發病率和死亡率一直居高不下。當前藥物和手術治療都難以取得理想的療效。因此進一步研究胰腺癌惡性進展的機制尤為重要。PANC-1 細胞是一種惡性程度較高的人胰腺癌細胞系，侵襲和轉移能力較強，最初從 1 例 56 歲的男性胰腺癌患者的腫瘤組織中分離培養[10]。APRIL 最初由 Hahne 等[11]發現，是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員，又名腫瘤壞死因子超家族 13（tumor necrosis factor super family 13，TNFSF13），以結合 B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞的方式參與特異性和非特異性免疫應答[12-13]。BCMA 最初在人體腸道的 T 淋巴細胞瘤中被發現[14]，隨后被確定為 TNF 受體家族成員，命名為腫瘤壞死因子受體超家族 17（tumor necrosis factor receptor super family 17，TNFSF17）。TACI 主要表達在 B 淋巴細胞和活化的 T 淋巴細胞表面，有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[15]。BCMA 和 TACI 是 APRIL 的共同受體，現有研究表明它們參與自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡[16]和 IgA 腎病[17]，急性淋巴細胞白血病[18]等重大疾病的發生和發展過程。
越來越多的證據表明，中性粒細胞與胰腺癌的不良預后相關[19]。Guo 等[20]的研究結果顯示：胰腺癌患者治療前的中性粒細胞-淋巴細胞比（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）與胰腺癌的遠處轉移密切相關；Sakamoto 等[21]認為，NLR 值是胰腺癌復發的獨立預后因素。一項對 497 例局部晚期胰腺癌患者的評估結果顯示，高血小板-淋巴細胞比（platelet-lymphocyte ratio，PLR）和高 NLR 的患者 1 年總生存率（overall survival，OS）和 1 年無進展生存率（progression-free survival，PFS）均遠低于低 NLR 和低 PLR 的患者。這表明 NLR 和 PLR 都可以作為預測胰腺癌預后的指標[22]。
人體內的中性粒細胞是終末細胞，一般認為自體外分離后只能在 24 h 內處于相對穩定的狀態，不能在體外傳代培養或長時間用于體外實驗[23]。HL-60 細胞是人早幼粒白血病細胞，在 1.3% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的作用下誘導 5 d 生成的類中性粒細胞，是一種研究中性粒細胞的良好體外實驗模型[24]。然后類中性粒細胞在人胰腺癌 PANC-1 細胞條件培養基的作用下培養 24 h，將類中性粒細胞進一步轉化為胰腺癌相關的中性粒細胞。
胰腺癌微環境中的 TAN 可通過分泌 APRIL 影響胰腺癌細胞的惡性生物學行為。本實驗通過 ELISA 檢測發現 TAN 組分泌 APRIL 水平升高；蛋白印跡法驗證了 PANC-1 細胞表達 APRIL 受體 BCMA 和 TACI；CCK8 法檢測結果顯示 PANC-1 細胞在 TAN 的作用下其增殖活性明顯增強。本實驗結果初步證實胰腺癌微環境下 TAN 可通過分泌 APRIL 促進胰腺癌的進展。
當前胰腺癌治療方法中手術切除是胰腺癌患者獲得治愈機會和長期生存的唯一有效方法，然而超過 80% 的胰腺癌患者因發現較晚而失去手術機會。同時放射治療、化學治療、介入治療等方法的治療效果都是很有限的。因此，通過干預 TAN 與胰腺癌細胞的相互作用，有可能為胰腺癌惡性進展的機制研究和臨床改善胰腺癌的綜合治療效果提供新的思路和方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：文張、王繼龍、徐邦浩和郭雅負責課題設計和指導，梁立洲、鄧振灃、金宗睿和吳國林完成實驗和撰寫論文。
胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，胰腺癌患者的總體 5 年生存率是 8%，在所有主要的癌癥類型中是最低的[1]，因此胰腺癌病例數與死亡數幾乎一樣多[2]。預后極差的主要原因是胰腺癌對現有的多種治療方法反應較差[3]。胰腺癌豐富的間質存在明顯的纖維化-炎癥反應和多種免疫細胞。這些間質成分所構成的腫瘤微環境促進了胰腺癌的進展及治療抵抗。筆者所在團隊前期的研究結果發現，胰腺癌間質中的免疫細胞可通過釋放白介素-22[4]，促進胰腺癌進展。中性粒細胞除了具有吞噬和殺滅細菌、參與急性炎癥反應的作用外，在調節腫瘤微環境中也起到了重要作用。Oberg 等[5]報道中性粒細胞發揮促腫瘤作用，可以促進腫瘤生長、血管生成和轉移侵襲，其中腫瘤微環境中的中性粒細胞被稱為腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophil，TAN）。研究表明，腫瘤微環境中的 TAN 可通過分泌增殖誘導配體（APRIL）促進肺癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]等多種惡性腫瘤的進展，然而目前對于 TAN 在胰腺癌微環境中與胰腺癌細胞相互作用及對胰腺癌進展的影響有待進一步研究。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
人胰腺癌 PANC-1 細胞和人早幼粒白血病細胞 HL-60 購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（產品目錄號分別為 TCHu 98 和 TCHu 23）；DMEM/高糖培養基、RPMI1640 培養基和青鏈霉素混合液購自 Gibco 公司（產品目錄號分別為 C11995500BT、C11875500BT 和 15140122）；胎牛血清購自 Lonsera 公司（產品目錄號為 S711-001S）；ELISA 試劑盒購自北京博奧森公司（產品目錄號為 bsk00326）；多克隆抗兔 B 細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和跨膜激活劑及鈣調親環素配基相互作用因子（trans-membrane activator and CAML interactor，TACI）抗體購自北京博奧森公司（產品目錄號分別為 bs3850R 和 bs4841R）；人工重組 APRIL 蛋白（rAPRIL）購自 Peprotech 公司（產品目錄號為 96-310-10C-100）；APRIL 中和抗體（鼠抗人 APRIL 中和性抗體）購自 R&D 公司（產品目錄號為 MAB5860）；Transwell 小室（0.4 μm）購自 Corning 公司（產品目錄號為 3413）；CCK8 試劑盒購自美侖公司（產品目錄號為 MA0218）；DMSO 購自 Sigma 公司（產品目錄號為 D2650）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
1.2.1.1 人胰腺癌 PANC-1 細胞培養
取 7.5×105/mL 的人胰腺癌 PANC-1 細胞接種于 T75 細胞培養瓶，采用 DMEM/高糖完全培養基（添加 10% 胎牛血清+1% 青鏈霉素混合液），在 37 ℃、5% CO2 培養箱培養。每 2～3 d 換液，待細胞生長匯合至對數生長期時傳代，傳至第 3～10 代備用。
1.2.1.2 制備 PANC-1 細胞條件培養基
① 待細胞培養瓶中的胰腺癌細胞生長至匯合對數生長期，棄去舊培養基，加入 PBS 輕柔沖洗 3 次，以充分去除殘余血清對后續實驗的影響；② 向細胞培養瓶中加入不含胎牛血清的 DMEM/高糖培養基，置于細胞培養箱培養 48 h；③ 48 h 之后，吸取細胞培養基，用 Millipore 濾器（0.2 μm）過濾細胞培養基，去除懸浮細胞等顆粒，純化條件培養基，放置于 –80° 冰箱中保存。
1.2.1.3 人早幼粒白血病細胞 HL-60 培養
取 2×105/mL 的人早幼粒白血病細胞 HL-60 接種于 T75 細胞培養瓶，采用 RPMI 1640 完全培養基（添加 10% 胎牛血清+1% 青鏈霉素混合液），在 37 ℃、5% CO2 培養箱培養。每 2～3 d 換液，800 r/min 離心 5 min（r=15 cm）后重懸細胞，使細胞密度達到 1×105 個/mL 進行傳代培養，傳至第 3～10 代備用。
1.2.1.4 HL-60 細胞分化為類中性粒細胞
在 T75 培養瓶中添加 7.5 mL RPMI 1640 完全培養基，加入 130 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）至終濃度為 1.3%，充分混勻。取 2.5 mL 處于對數生長期的 HL-60 細胞加入上述培養基[9]，置于 37 ℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養，期間不換液。類中性粒細胞轉化為 TAN 用上述胰腺癌細胞 PANC-1 的條件培養基重懸類中性粒細胞，放入細胞培養箱中培養 24 h 轉化為 TAN，制備 TAN 的條件培養基（方法同 PANC-1 細胞條件培養基的制備）。
1.2.2 TAN 對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖活性影響的體外實驗
1.2.2.1 ELISA 法檢測 APRIL 的表達
用 ELISA 試劑盒檢測類中性粒細胞和 TAN 條件培養基中 APRIL 的含量，每個實驗組均設 3 個復孔，取均值。
1.2.2.2 蛋白印跡法驗證 APRIL 受體 BCMA 和 TACI 蛋白的表達
用不同時間點的 PANC-1 細胞做復孔驗證 BCMA 和 TACI 的表達。實驗分組：① PANC-1 細胞，培養 48 h；② PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 12 h；③ PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 24 h；④ PANC-1 細胞+rAPRIL 培養 48 h。提取各組 PANC-1 細胞總蛋白，進行非連續性 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離蛋白后，將蛋白轉移到 PVDF 膜上，用含 5% BSA 的 TBST 緩沖液封閉，加入 BCMA 和 TACI 一抗 4 ℃ 孵育過夜，再用熒光二抗避光孵育 1 h 后，用 Odyssey 成像紅外分析系統掃膜顯影。
1.2.2.3 CCK8 檢測 TAN 對胰腺癌 PANC-1 細胞增殖能力的影響
每個實驗組均設 3 個復孔，取均值。將 PANC-I 細胞與 TAN 進行共培養（下室：PANC-1 細胞，上室：TAN）。實驗分 4 組，即 PANC-1 對照組（簡稱對照組）、PANC-1+TAN 處理組（簡稱 PANC-1+TAN 組）、PANC-1+TAN+APRIL 抗體處理組（簡稱 PANC-1+TAN+APRIL 組）和 PANC-1+人工重組 APRIL 蛋白（rAPRIL）處理組（簡稱 PANC-1+rAPRIL 組）。PANC-1 細胞密度均為 5×104/孔，加入 TAN 的細胞密度均為 2×105/孔，APRIL 抗體濃度 0.5 μg/mL，rAPRIL 濃度 5 ng/mL，培養 24 h。加入 10% CCK8 后避光、37 ℃ 孵育 4 h，孵育后立即在全波長酶標儀 450 nm 和 630 nm 波長處檢測吸光度值（A 值），以該值代表 PANCI-1 細胞的活性大小。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件對數據進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，對于多組間均數的比較采用單因素方差分析，證實各組間均數有差異后，采用 Dunnett-t 檢驗比較各處理組和對照組間的關系；采用 Bonferroni 法進一步多重比較各組間的關系。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 中性粒細胞和 TAN 釋放 APRIL 的檢測結果
ELISA 檢測結果顯示：中性粒細胞組的 APRIL 含量為（377.17±57.07）pg/mL，TAN 組為（556.20±84.38） pg/mL，TAN 細胞組培養基中 APRIL 含量高于中性粒細胞組，其差異有統計學意義（P=0.038），見圖 1a。
圖1
示本實驗結果
a：示 ELISA 法檢測中性粒細胞和 TAN 培養基中釋放的 APRIL 含量；b：示不同培養時間 PANC-1 細胞中 APRIL 受體 BCMA 和 TACI 均呈陽性表達；c：示 TAN 釋放 APRIL 對 PANC1 細胞增殖活性影響的檢測結果
2.2 PANC-1 細胞表達 APRIL 受體檢測結果
蛋白印跡法檢測各組 PANC-1 細胞表面 APRIL 受體的表達，其結果顯示：各組 TACI 和 BCMA 受體蛋白表達均呈陽性，見圖 1b。
2.3 TAN 釋放 APRIL 對 PANC1 增殖活性的影響
CCK8 檢測結果顯示：PANC-1 細胞增殖活性對照組為（100±0.00）%，PANC-1+TAN 組為（126.80±1.42）%，PANC-1+TAN+APRIL 組為（86.29±12.20）%，PANC-1+rAPRIL 組為（168.95±12.54）%。單因素方差分析結果顯示各組間均數差異有統計學意義（F=51.64，P<0.001）。① 采用 Dunnett-t 檢驗進一步比較各處理組和對照組間的關系，結果顯示：PANC-1+TAN 組和 PANC-1+rAPRIL 組的 PANC-1 活性明顯高于對照組（P=0.034，P<0.001），提示在 TAN 釋放 APRIL 或添加 rAPRIL 的條件下，PANC-1 活性上升。雖然 PANC-1+TAN+APRIL 組的 PANC-1 細胞增殖活性比對照組低，但 2 組比較其差異無統計學意義（P>0.05）。② 采用 Bonferroni 法進一步多重比較各組間的關系，結果顯示：PANC-1+TAN 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著高于 PANC-1+TAN+APRIL 組（P=0.003），提示在 APRIL 抗體的作用下，減弱或阻斷了 APRIL 的刺激，PANC-1 的細胞增殖活性下降；PANC-1+rAPRIL 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著高于 PANC-1+TAN+APRIL 組（P<0.001），PANC-1+TAN 組的 PANC-1 細胞增殖活性顯著低于 PANC-1+rAPRIL 組（P=0.002），見圖 1c。
3 討論
胰腺癌是常見的高度惡性腫瘤，發病率和死亡率一直居高不下。當前藥物和手術治療都難以取得理想的療效。因此進一步研究胰腺癌惡性進展的機制尤為重要。PANC-1 細胞是一種惡性程度較高的人胰腺癌細胞系，侵襲和轉移能力較強，最初從 1 例 56 歲的男性胰腺癌患者的腫瘤組織中分離培養[10]。APRIL 最初由 Hahne 等[11]發現，是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員，又名腫瘤壞死因子超家族 13（tumor necrosis factor super family 13，TNFSF13），以結合 B 淋巴細胞和 T 淋巴細胞的方式參與特異性和非特異性免疫應答[12-13]。BCMA 最初在人體腸道的 T 淋巴細胞瘤中被發現[14]，隨后被確定為 TNF 受體家族成員，命名為腫瘤壞死因子受體超家族 17（tumor necrosis factor receptor super family 17，TNFSF17）。TACI 主要表達在 B 淋巴細胞和活化的 T 淋巴細胞表面，有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[15]。BCMA 和 TACI 是 APRIL 的共同受體，現有研究表明它們參與自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡[16]和 IgA 腎病[17]，急性淋巴細胞白血病[18]等重大疾病的發生和發展過程。
越來越多的證據表明，中性粒細胞與胰腺癌的不良預后相關[19]。Guo 等[20]的研究結果顯示：胰腺癌患者治療前的中性粒細胞-淋巴細胞比（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）與胰腺癌的遠處轉移密切相關；Sakamoto 等[21]認為，NLR 值是胰腺癌復發的獨立預后因素。一項對 497 例局部晚期胰腺癌患者的評估結果顯示，高血小板-淋巴細胞比（platelet-lymphocyte ratio，PLR）和高 NLR 的患者 1 年總生存率（overall survival，OS）和 1 年無進展生存率（progression-free survival，PFS）均遠低于低 NLR 和低 PLR 的患者。這表明 NLR 和 PLR 都可以作為預測胰腺癌預后的指標[22]。
人體內的中性粒細胞是終末細胞，一般認為自體外分離后只能在 24 h 內處于相對穩定的狀態，不能在體外傳代培養或長時間用于體外實驗[23]。HL-60 細胞是人早幼粒白血病細胞，在 1.3% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的作用下誘導 5 d 生成的類中性粒細胞，是一種研究中性粒細胞的良好體外實驗模型[24]。然后類中性粒細胞在人胰腺癌 PANC-1 細胞條件培養基的作用下培養 24 h，將類中性粒細胞進一步轉化為胰腺癌相關的中性粒細胞。
胰腺癌微環境中的 TAN 可通過分泌 APRIL 影響胰腺癌細胞的惡性生物學行為。本實驗通過 ELISA 檢測發現 TAN 組分泌 APRIL 水平升高；蛋白印跡法驗證了 PANC-1 細胞表達 APRIL 受體 BCMA 和 TACI；CCK8 法檢測結果顯示 PANC-1 細胞在 TAN 的作用下其增殖活性明顯增強。本實驗結果初步證實胰腺癌微環境下 TAN 可通過分泌 APRIL 促進胰腺癌的進展。
當前胰腺癌治療方法中手術切除是胰腺癌患者獲得治愈機會和長期生存的唯一有效方法，然而超過 80% 的胰腺癌患者因發現較晚而失去手術機會。同時放射治療、化學治療、介入治療等方法的治療效果都是很有限的。因此，通過干預 TAN 與胰腺癌細胞的相互作用，有可能為胰腺癌惡性進展的機制研究和臨床改善胰腺癌的綜合治療效果提供新的思路和方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：文張、王繼龍、徐邦浩和郭雅負責課題設計和指導，梁立洲、鄧振灃、金宗睿和吳國林完成實驗和撰寫論文。
