引用本文： 楊文鋼, 薛松, 文德重, 鄭輝, 單江桂. 上調 miRNA-21 對骨髓間充質干細胞的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(8): 940-947. doi: 10.7507/1007-4848.201909021 復制
骨髓源性間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌樣細胞等細胞[1-3]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以分泌血管內皮生長因子（VEGF）等細胞因子[4]。MSCs 不僅可以分化為心肌樣細胞，還可以提供大量血管生成所需要的微環境。因此，BMSCs 在心肌缺血損傷修復中具有心臟保護作用[5-7]。microRNAs（miRNAs）是一類非編碼小 RNA（21～25 個核苷酸），通過抑制 mRNA 翻譯或促進 mRNA 降解來調節細胞行為[8]。miRNA 在細胞的發育、增殖、分化以及基因表達的調控中起著重要作用[9-12]，在 BMSCs 分化中也起到了相關作用[9, 13-16]。miRNAs 在調節 BMSCs 快速誘導成骨過程中是有作用的[17]。上述信息表明，miRNAs 參與了干細胞特性的維持和細胞分化。miRNA-21 由單一的基因編碼，定位于染色體 17q23.2，與編碼空泡膜蛋白 1（vmp1）的基因重疊[11]。miRNA-21 在 BMSCs 分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞過程中具有重要作用。但是，miRNA-21 在 BMSCs 中的作用的相關研究數量仍然有限，特別在 BMSCs 向心肌細胞樣細胞分化的過程中缺少研究[8, 18-19]。因此，我們設想通過上調 miRNA-21 觀察其對 BMSCs 的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康 SD 大鼠，體重 250～300 g，由上海交通大學醫學院動物實驗中心提供。該研究得到上海交通大學倫理委員會的支持，倫理審查批準號：syxk（滬）2016-2019。
1.2 實驗試劑和儀器
實驗試劑和儀器包括 L-DMEM 培養基（Gibco 公司），特級胎牛血清（FBS，Gibco 公司），0.25% 胰蛋白酶和 EDTA（Gibco 公司），密度為 1.077 的 FICOLL（GE 公司），倒置熒光相差顯微鏡（Olympus 公司），FACSca 流式細胞儀（美國 Becton Dickinson 公司），噻唑藍（MTT，Sigma 公司），二甲基亞砜（DMSO，Gibco 公司），熒光標記抗鼠 CD45-F1TC、抗鼠 CD90-PE（eBioscience 公司）和抗鼠 CD29-APC（BioLegend 公司），PGMLV-MA2 表達載體試劑盒與 EMGFP 及其它相關試劑從 Qiagen 購買，Triton（AMRESCO 公司），BSA（美國 Proliant 公司），細胞分離液（cell dissociation Buffer，Gibco 公司），熒光標記山羊抗兔 LgG（abcam 公司），trizol（美國 invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（美國 promiga 公司），Taq 酶（日本 takara 公司），引物序列合成（上海生工生物公司），BCA 試劑盒（碧云天公司），BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP（Invitrogen 公司），pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR（Invitrogen 公司），Estherichia coli DH5［菌株（Invitrogen 公司）］，Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司），Opti-MEM（Invitrogen 公司），Trizol（Invitrogen 公司），pLenti6.3/Ⅴ5-DEST（Invitrogen 公司），限制性內切酶，T4 DNA 連接酶，大量質粒 DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司）。主要儀器包括垂直電泳儀（美國 GE 公司），半干轉膜儀（美國 Bio-Rad 公司），硝酸纖維素膜（美國 Bio-Rad 公司），ECL 發光劑（美國 GE 公司），柯達活體成像儀 cymentre2000（美國 Kodak 公司）。
1.3 細胞培養
引頸法處死老鼠。無菌條件下取股骨和脛骨，用 L-DMEM 反復沖洗骨髓腔；密度梯度獲取骨髓細胞，最后加入培養液（含 L-DMEM，20%FBS，100 U/mL 青鏈霉素），混勻細胞沉淀，移到 10 cm 的培養皿，在 37.0℃，5%CO2 細胞培養箱培養。24 h 后見細胞大部分已經貼壁，換液移去未貼壁的造血紅細胞，7～10 d 左右細胞形成單個集簇或者克隆，80%～90% 融合。0.25% 的胰蛋白酶和 EDTA 消化傳代（1∶3），密度為 10 000/cm2 ；3 d 換液一次，第 2 代的 BMSCs 用于各項研究。
用 10 μmol/L 5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 在培養皿上培養 24 h。然后每 2 d 更換一次培養基。
293T 細胞使用含 5%FBS 和 50 mg/mL 慶大霉素的 MEM 液培養。含 0.5 mmol/L 的 EDTA 溶液，0.05% 胰蛋白酶消化細胞。
1.4 骨髓間充質干細胞標記
在 BMSCs 培養基中，加入 50 mg/mL 濃度的 DAPI 溶液 30 min 后[20]，去除多余的未結合 DAPI。
1.5 流式細胞術
獲取 3×105 細胞/mL 用 LCB（20、40、80 μm）處理 48 h 后，冰 PBS 洗滌 2 次，分別用 5 μL CD45 單克隆抗體、CD90 單克隆抗體、CD29 單克隆抗體和 5 μL 碘化丙啶（PI）染色 10 min，用 SUM 分析軟件分析數據。
1.6 免疫熒光技術
將 BMSCs 在 4% 甲醛中進行固定培養 20 min，0.3% Triton X-100 滲透 10 min，5%BSA 室溫封閉 30 min，加用 1%BSA 稀釋的一抗，4℃ 孵育過夜。加入熒光 FITC 標記二抗（用 1%BSA 稀釋）30 min，閉光。封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.7 Western-blotting
收集誘導前后的 BMSCs，提取蛋白，BCA 法測定蛋白質含量。參照分子克隆實驗指南進行純化蛋白的 SDS-PAGE。SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉后加入 1∶1 500 稀釋的單抗（用 TBST 稀釋），4℃ 反應過夜。加入羊抗兔 IgG-HRP（TBST 稀釋 1∶5 000），室溫作用 2 h，TBST 漂洗，加入 ECL 顯色液，置于柯達活體成像儀中觀察結果，曝光 5 min，CCD 自動獲取圖片結果。相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以 β-actin（1∶1 000，43 kD）內參照校正。
1.8 miRNA-21 表達病毒載體構建
pre-miRNA-21 序列根據 miRBase accession No：MI0000850。相關 shRNA 引物序列如下：4145hsa-miR-21-F（XhoI）：CCGCTCGAG TTGTTTTGCTTGGGAGGAAAATAAACA； 4145hsa-miR-21-R（BamHI）：CCG GGATCC CAATGCAGCTTAGTTTTCCTTTATTTATTTGT。相應的限制酶消化 XhoI 和 BamHI。利用載體克隆試劑盒進行重組，將 shRNA 寡核苷酸插入 shRNA 表達載體（invitrogen），并用感染質粒的 E.coli DH5 細胞轉染 BMSCs。對寡核苷酸進行退火并克隆進 PGMLV-MA2 vector（LV-miRNA-21）。
LV-miRNA-21 轉染 293T 細胞，包裝病毒及滴度測定：細胞轉染用對數生長期的 293T 細胞，細胞數為 5×108，37℃，5% CO2 中培養，60%～70% 融合時轉染。提取 LV- miRNA-21 質粒 DNA 溶液，加入 2.5 mol/L CaCl2 200 μL、2×PBS 溶液 2 000 μL，室溫 20～30 min。將 DNA-磷酸鈣混合液轉移至含單層細胞的培養液中，12 h 后棄去培養液，加入 PBS 15 mL 清洗 3 次。每瓶細胞中加入含體積分數為 10% FBS 培養液 15 mL 培養 48 h。收集轉染 72 h 的 293T 細胞上清液。4℃，4 000 g 離心 10 min；0.45 μm 濾器過濾后置于 40 mL 超速離心管中，4℃，25 000 r/min 離心 20 min；冰 PBS 液重懸病毒沉淀，4℃ 過夜。以 10 μL 每管分裝病毒液 –80℃ 中保存。分析得到病毒滴度=5×108 TU/mL。成功地將 LV-miRNA-21 或 LV-GFP 轉染到 BMSCs。
1.9 MTT 細胞增殖檢測
用含 10% 胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔 1 000～10 000 個細胞接種到 96 孔板。細胞培養 3～5 d，每孔加 MTT 溶液 20 μL 孵育 4 h，吸棄培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min。在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。
1.10 流式細胞儀檢測細胞凋亡
5×106 個細胞 1 000 r/min 離心 5 min，移除培養基。PBS 洗滌 1 次，離心去除上清 PBS，70% 冷乙醇 4℃ 固定 1～2 h。離心除去乙醇，細胞用 3 mL PBS 重懸 5 min，濾過，1 500 r/min 離心 5 min。細胞用 1 mL PI 在 4℃ 暗環境中染色 30 min，然后進行檢測分析。
1.11 統計學分析
使用 Image programer 軟件對圖片進行分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。統計軟件采用 SPSS 20.0，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 骨髓間充質干細胞特性
在原代培養 3 d 后，BMSCs 呈現少量的單細胞群，見少許逗點狀或短棒狀細胞（圖 1a）。這些細胞類似于短梭形、多角形、單核、核圓居中，7～10 d 后開始形成菌落（圖 1b 和 1c）。表面抗原[20]如 CD90（圖 1d）和 CD29（圖 1e）在 BMSCs 中呈陽性，CD45 為陰性（圖 1f）。
圖1
體外培養骨髓間充質干細胞的特性鑒定
a：大鼠 BMSCs 培養 3 d 的形態學觀察（×100）；細胞呈紡錘形，只有一個細胞核；b：大鼠 BMSCs 培養 7 d 的形態學觀察（×100）；c：大鼠 BMSCs 培養 10 d 的形態學觀察（×100）；這些細胞看起來像長軸形的纖維增生細胞，開始形成菌落；d～f：代表表面相關抗原（CD90、CD29 和 CD45），用流式細胞儀檢測：d 為 BMSCs 表面相關抗原 CD90 陽性，e 為CD29 陽性，f 為CD45 陰性，CD90 和 CD29 的百分比約為 99%，但 CD45 的百分比只有 1% 左右
經 5-氮雜胞苷誘導的 BMSCs 形態發生了改變，細胞體積增大，數量增多，呈長紡錘形。14 d 后，細胞互相連接，排列趨于一致。miRNA-21 組 BMSCs 的特征明顯高于 NC 組和 CK 組（圖 2）。miRNA-21 組細胞體積增大，數量明顯多于正常組和對照組。與 NC 組和 CK 組相比，miRNA-21 組 BMSCs 的特征更為明顯。
圖2
5-氮雜胞苷體外誘導骨髓間充質干細胞的特性觀察
a～c： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 3 d；d～f： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 7 d；g～i： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 14 d；a、d、g 為正常（CK）組；b、e、h 為對照（NC）組；c、f、i 為 miRNA-21 組；d～f：大鼠 BMSCs 經 5-氮雜胞苷處理 7 d 的形態學觀察（×100），細胞增大，呈球形或棒狀形態；g～i：大鼠 BMSCs 經 5-氮雜胞苷處理 14 d 的形態學觀察（×100），兩周后，細胞與相鄰細胞相連；miRNA-21 組細胞體積增大，數量明顯多于 CK 組和 NC 組；與 NC 組和 CK 組相比，miRNA-21 組 BMSCs 的特征更為明顯
2.2 miRNA-21 促進骨髓間充質干細胞增殖
3 組 BMSCs 細胞（miRNA-21 組、CK 組和 NC 組）分別培養 1 周、2 周和 3 周。MTT 分析用于檢測 1 周、2 周和 3 周后細胞的增殖（圖 3）。由于 miRNA-21 過表達，BMSCs 增殖增加；然而，NC 組和 CK 組的細胞增殖相似沒有變化。3 組細胞在相同條件下培養 1 周、2 周、3 周后，miRNA-21 組細胞增殖較其它兩組增加，差異有統計學意義（P=0.025）。
圖3
MTT 檢測細胞增殖情況
2.3 miRNA-21 減慢骨髓間充質干細胞凋亡
3 組細胞分別培養 1 周、2 周和 3 周。用流式細胞儀檢測 BMSCs 的凋亡。miRNA-21 組細胞凋亡率低于 NC 組和 CK 組（圖 4）。1 周時 miRNA-21 組細胞凋亡率約為 3.283%±0.025%，2 周時為 2.278%±0.045%，3 周時為 2.125%±0.035%。1 周時 NC 組細胞凋亡率約為 4.429%±0.027%，2 周時為 2.425%±0.045%，3 周時為 3.888%±0.019%；1 周時 CK 組細胞凋亡率約為 3.094%±0.050%，2 周時為 2.295%±0.023%，3 周時為 3.133%±0.013%。miRNA-21 組與 NC 組（P=0.031）、CK 組（P=0.020）差異有統計學意義。
圖4
流式細胞術檢測 3 組（NC、CK、miRNA-21 組）骨髓間充質干細胞凋亡情況
2.4 miRNA-21 促進骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞
5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 培養 3 周后，采用免疫熒光法檢測 cTnI 和 CD90。用 10 μmol/L 5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 分化為心肌細胞樣細胞后出現 cTnI 陽性。但干細胞表面特異性抗原 CD90 的表達隨著 cTnI 的表達增多而逐漸消失。cTnI 在 miRNA-21 組的表達高于 NC 和 CK 組（圖 5）。即 miRNA-21 促進 BMSCs 向心肌細胞樣細胞的分化。BMSCs 分化為心肌樣細胞后，失去了干細胞的特性。
圖5
骨髓間充質干細胞經 5-氮雜胞苷處理后 3 周，用免疫熒光組織化學技術測定 BMSCs 表達心臟結構蛋白（cTnI）和 CD90
a、e、i：BMSCs cTnI 蛋白陽性染色（紅色熒光，×200）；b、f、j：BMSCs CD90 陽性染色（綠色熒光，×200）；c、g、k：BMSCs 的 DAPI 標記核（藍色熒光，×200）；d：合并圖 a、圖 c；h：合并圖 e、圖 g；l：合并圖 i、圖 k；a～d：CK 組；e～h：NC 組；i～l：miRNA-21 組；BMSCs：骨髓間充質干細胞；cTnI：心肌肌鈣蛋白 I
用 Western-blotting 檢測 cTnI 和 myod 的表達。miRNA-21 組的 cTnI 表達水平高于 NC 組和 CK 組（圖 6）。BMSCs 在體外誘導培養 1 周、2 周和 3 周后，miRNA-21 組的 cTnI 表達水平明顯高于 NC 組和 CK 組（圖 6），但各組中 myod 的表達量均較少，特別在 miRNA-21 組中，myod 的表達不明顯，比 NC 組和 CK 組均少。所以，BMSCs 可以分化成心肌樣細胞和肌肉細胞，但在特殊試劑誘導下大多數 BMSCs 可以分化成心肌樣細胞。兩周后，在 miRNA-21 的作用下，BMSCs 分化為心肌樣細胞為主，主要表達 cTnI。3 周后，在 miRNA-21 的作用下，cTnI 是 BMSCs 分化過程中唯一的表達。在這一過程中，miRNA-21 促進了 BMSCs 向心肌樣細胞的分化。
圖6
免疫印跡法檢測 cTnI 和 myod 蛋白的表達水平
a：1 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組； b：2 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組；c：3 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組；1～3 周 myod 蛋白表達水平越來越低，最后消失；但 cTnI 蛋白的表達水平越來越高；cTnI：心肌肌鈣蛋白 I；myod：骨骼肌相關蛋白；*：
3 討論
Friedenstein 等[21]在 1968 年對 MSCs 進行了描述。據報道， MSCs 在體外能夠增殖和分化[22-24]。而 BMSCs 的比例僅為 0.001%～0.01%。Wakitani 等[25]首次使用 Ficoll 密度梯度分離法從大鼠骨髓中獲得 BMSCs。MSCs 可以在體內外分化為心肌細胞譜系[26-28]，也可以分化成心肌細胞樣細胞[29-31]。本研究采用免疫熒光染色法和免疫印跡法檢測心肌細胞樣細胞中 cTnI 的表達。
干細胞治療的機制仍有待闡明，并且 BMSCs 的比例非常低，所以探討 BMSCs 不同分化過程中 miRNA-21 的作用有一定的必要性。
miRNA 是一類小的非編碼 RNA，其成熟產物是 22 個核苷酸長度的 miRNA，通過誘導翻譯抑制或轉錄降解負性調節基因表達。在細胞發育、增殖、分化和控制基因表達等各種生物學過程中，miRNAs 是重要的調節因子[10-12]。最近，許多研究[9, 13-16]報道了 miRNAs 在 MSCs 中的作用。眾所周知，miRNAs 在調節 MSCs 誘導成骨的過程中起到了作用[17]。研究表明，miRNAs 參與了干細胞特性的維持和分化。
miRNA-21 定位到染色體 17q23.2，與蛋白質編碼基因 VMP1（TMEM49）重疊。研究表明，其編碼多種腫瘤抑制蛋白基因的表達，如 10 號染色體上的磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）、腫瘤抑制基因原肌球蛋白 1（TPM1）、細胞程序死亡因子 4（PDCD4）、基質金屬蛋白酶抑制劑 RECK 和 TIMP3。miRNA-21 參與多種組織來源 MSCs 的分化，但對 miRNA-21 在 MSCs 中相關作用的研究非常有限[8, 18-19]。我們的研究發現 miRNA-21 在 BMSCs 向心肌細胞樣細胞分化過程中起到了作用。
miRNAs 以編碼 spryhomolog1（spry1）為靶點，負性調節 MSCs 的成骨分化。miRNA-21 促進 MSCs 向成骨細胞分化[32]。因此，miRNA-21 可作為治療骨缺損和其它骨疾病新的靶點[32]。此外，在脂肪生成和成骨的第 4 d，上調 miRNA-21 導致 ERK-MAPK 信號通路的活性增加，而下調 miRNA -21 則降低了該通路的活性。研究表明，miRNA -21 參與了多種病理和生理過程，特別在決定干細胞發育增殖分化的過程中[19]。生長分化因子 5（GDF-5）在軟骨形成調控過程中被確定為 miRNA-21 的直接靶點[33]。miRNA-21 在人脂肪源性間充質干細胞中起著重要的作用，可作為再生醫學和腫瘤生物學的治療工具[34]。證據表明，miRNA-21 是一個重要的腫瘤基因，在干細胞行為的調節中起著重要的作用。
在我們的研究中，發現 miRNA-21 加速了 BMSCs 的增殖，減緩了其凋亡，增強了 MBSCs 向心肌樣細胞的分化。研究[34]表明：在組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）中過表達 miRNA-21 抑制腫瘤的生長。相反，miRNA-21 的表達下調卻增加了相同細胞腫瘤生長。miRNA-21 在 MSCs 中發揮著新的重要作用[35]。因此，我們可以認為，miRNA-21 是一種有效的生物標志物，可以直接作為細胞治療的靶點。但是，仍然需要更深入的研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊文鋼實施研究，包括細胞培養等，撰寫文章； 薛松設計課題及相關技術指導；文德重進行細胞培養誘導及流式細胞術等；鄭輝進行 Western-blotting 及 MTT 等細胞生物學技術；單江桂收集、整理數據、圖片，進行細胞培養等。
骨髓源性間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌樣細胞等細胞[1-3]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以分泌血管內皮生長因子（VEGF）等細胞因子[4]。MSCs 不僅可以分化為心肌樣細胞，還可以提供大量血管生成所需要的微環境。因此，BMSCs 在心肌缺血損傷修復中具有心臟保護作用[5-7]。microRNAs（miRNAs）是一類非編碼小 RNA（21～25 個核苷酸），通過抑制 mRNA 翻譯或促進 mRNA 降解來調節細胞行為[8]。miRNA 在細胞的發育、增殖、分化以及基因表達的調控中起著重要作用[9-12]，在 BMSCs 分化中也起到了相關作用[9, 13-16]。miRNAs 在調節 BMSCs 快速誘導成骨過程中是有作用的[17]。上述信息表明，miRNAs 參與了干細胞特性的維持和細胞分化。miRNA-21 由單一的基因編碼，定位于染色體 17q23.2，與編碼空泡膜蛋白 1（vmp1）的基因重疊[11]。miRNA-21 在 BMSCs 分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞過程中具有重要作用。但是，miRNA-21 在 BMSCs 中的作用的相關研究數量仍然有限，特別在 BMSCs 向心肌細胞樣細胞分化的過程中缺少研究[8, 18-19]。因此，我們設想通過上調 miRNA-21 觀察其對 BMSCs 的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康 SD 大鼠，體重 250～300 g，由上海交通大學醫學院動物實驗中心提供。該研究得到上海交通大學倫理委員會的支持，倫理審查批準號：syxk（滬）2016-2019。
1.2 實驗試劑和儀器
實驗試劑和儀器包括 L-DMEM 培養基（Gibco 公司），特級胎牛血清（FBS，Gibco 公司），0.25% 胰蛋白酶和 EDTA（Gibco 公司），密度為 1.077 的 FICOLL（GE 公司），倒置熒光相差顯微鏡（Olympus 公司），FACSca 流式細胞儀（美國 Becton Dickinson 公司），噻唑藍（MTT，Sigma 公司），二甲基亞砜（DMSO，Gibco 公司），熒光標記抗鼠 CD45-F1TC、抗鼠 CD90-PE（eBioscience 公司）和抗鼠 CD29-APC（BioLegend 公司），PGMLV-MA2 表達載體試劑盒與 EMGFP 及其它相關試劑從 Qiagen 購買，Triton（AMRESCO 公司），BSA（美國 Proliant 公司），細胞分離液（cell dissociation Buffer，Gibco 公司），熒光標記山羊抗兔 LgG（abcam 公司），trizol（美國 invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（美國 promiga 公司），Taq 酶（日本 takara 公司），引物序列合成（上海生工生物公司），BCA 試劑盒（碧云天公司），BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP（Invitrogen 公司），pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR（Invitrogen 公司），Estherichia coli DH5［菌株（Invitrogen 公司）］，Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司），Opti-MEM（Invitrogen 公司），Trizol（Invitrogen 公司），pLenti6.3/Ⅴ5-DEST（Invitrogen 公司），限制性內切酶，T4 DNA 連接酶，大量質粒 DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司）。主要儀器包括垂直電泳儀（美國 GE 公司），半干轉膜儀（美國 Bio-Rad 公司），硝酸纖維素膜（美國 Bio-Rad 公司），ECL 發光劑（美國 GE 公司），柯達活體成像儀 cymentre2000（美國 Kodak 公司）。
1.3 細胞培養
引頸法處死老鼠。無菌條件下取股骨和脛骨，用 L-DMEM 反復沖洗骨髓腔；密度梯度獲取骨髓細胞，最后加入培養液（含 L-DMEM，20%FBS，100 U/mL 青鏈霉素），混勻細胞沉淀，移到 10 cm 的培養皿，在 37.0℃，5%CO2 細胞培養箱培養。24 h 后見細胞大部分已經貼壁，換液移去未貼壁的造血紅細胞，7～10 d 左右細胞形成單個集簇或者克隆，80%～90% 融合。0.25% 的胰蛋白酶和 EDTA 消化傳代（1∶3），密度為 10 000/cm2 ；3 d 換液一次，第 2 代的 BMSCs 用于各項研究。
用 10 μmol/L 5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 在培養皿上培養 24 h。然后每 2 d 更換一次培養基。
293T 細胞使用含 5%FBS 和 50 mg/mL 慶大霉素的 MEM 液培養。含 0.5 mmol/L 的 EDTA 溶液，0.05% 胰蛋白酶消化細胞。
1.4 骨髓間充質干細胞標記
在 BMSCs 培養基中，加入 50 mg/mL 濃度的 DAPI 溶液 30 min 后[20]，去除多余的未結合 DAPI。
1.5 流式細胞術
獲取 3×105 細胞/mL 用 LCB（20、40、80 μm）處理 48 h 后，冰 PBS 洗滌 2 次，分別用 5 μL CD45 單克隆抗體、CD90 單克隆抗體、CD29 單克隆抗體和 5 μL 碘化丙啶（PI）染色 10 min，用 SUM 分析軟件分析數據。
1.6 免疫熒光技術
將 BMSCs 在 4% 甲醛中進行固定培養 20 min，0.3% Triton X-100 滲透 10 min，5%BSA 室溫封閉 30 min，加用 1%BSA 稀釋的一抗，4℃ 孵育過夜。加入熒光 FITC 標記二抗（用 1%BSA 稀釋）30 min，閉光。封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.7 Western-blotting
收集誘導前后的 BMSCs，提取蛋白，BCA 法測定蛋白質含量。參照分子克隆實驗指南進行純化蛋白的 SDS-PAGE。SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉后加入 1∶1 500 稀釋的單抗（用 TBST 稀釋），4℃ 反應過夜。加入羊抗兔 IgG-HRP（TBST 稀釋 1∶5 000），室溫作用 2 h，TBST 漂洗，加入 ECL 顯色液，置于柯達活體成像儀中觀察結果，曝光 5 min，CCD 自動獲取圖片結果。相應蛋白表達值為條帶的灰度值除以 β-actin（1∶1 000，43 kD）內參照校正。
1.8 miRNA-21 表達病毒載體構建
pre-miRNA-21 序列根據 miRBase accession No：MI0000850。相關 shRNA 引物序列如下：4145hsa-miR-21-F（XhoI）：CCGCTCGAG TTGTTTTGCTTGGGAGGAAAATAAACA； 4145hsa-miR-21-R（BamHI）：CCG GGATCC CAATGCAGCTTAGTTTTCCTTTATTTATTTGT。相應的限制酶消化 XhoI 和 BamHI。利用載體克隆試劑盒進行重組，將 shRNA 寡核苷酸插入 shRNA 表達載體（invitrogen），并用感染質粒的 E.coli DH5 細胞轉染 BMSCs。對寡核苷酸進行退火并克隆進 PGMLV-MA2 vector（LV-miRNA-21）。
LV-miRNA-21 轉染 293T 細胞，包裝病毒及滴度測定：細胞轉染用對數生長期的 293T 細胞，細胞數為 5×108，37℃，5% CO2 中培養，60%～70% 融合時轉染。提取 LV- miRNA-21 質粒 DNA 溶液，加入 2.5 mol/L CaCl2 200 μL、2×PBS 溶液 2 000 μL，室溫 20～30 min。將 DNA-磷酸鈣混合液轉移至含單層細胞的培養液中，12 h 后棄去培養液，加入 PBS 15 mL 清洗 3 次。每瓶細胞中加入含體積分數為 10% FBS 培養液 15 mL 培養 48 h。收集轉染 72 h 的 293T 細胞上清液。4℃，4 000 g 離心 10 min；0.45 μm 濾器過濾后置于 40 mL 超速離心管中，4℃，25 000 r/min 離心 20 min；冰 PBS 液重懸病毒沉淀，4℃ 過夜。以 10 μL 每管分裝病毒液 –80℃ 中保存。分析得到病毒滴度=5×108 TU/mL。成功地將 LV-miRNA-21 或 LV-GFP 轉染到 BMSCs。
1.9 MTT 細胞增殖檢測
用含 10% 胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔 1 000～10 000 個細胞接種到 96 孔板。細胞培養 3～5 d，每孔加 MTT 溶液 20 μL 孵育 4 h，吸棄培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min。在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。
1.10 流式細胞儀檢測細胞凋亡
5×106 個細胞 1 000 r/min 離心 5 min，移除培養基。PBS 洗滌 1 次，離心去除上清 PBS，70% 冷乙醇 4℃ 固定 1～2 h。離心除去乙醇，細胞用 3 mL PBS 重懸 5 min，濾過，1 500 r/min 離心 5 min。細胞用 1 mL PI 在 4℃ 暗環境中染色 30 min，然后進行檢測分析。
1.11 統計學分析
使用 Image programer 軟件對圖片進行分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。統計軟件采用 SPSS 20.0，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 骨髓間充質干細胞特性
在原代培養 3 d 后，BMSCs 呈現少量的單細胞群，見少許逗點狀或短棒狀細胞（圖 1a）。這些細胞類似于短梭形、多角形、單核、核圓居中，7～10 d 后開始形成菌落（圖 1b 和 1c）。表面抗原[20]如 CD90（圖 1d）和 CD29（圖 1e）在 BMSCs 中呈陽性，CD45 為陰性（圖 1f）。
圖1
體外培養骨髓間充質干細胞的特性鑒定
a：大鼠 BMSCs 培養 3 d 的形態學觀察（×100）；細胞呈紡錘形，只有一個細胞核；b：大鼠 BMSCs 培養 7 d 的形態學觀察（×100）；c：大鼠 BMSCs 培養 10 d 的形態學觀察（×100）；這些細胞看起來像長軸形的纖維增生細胞，開始形成菌落；d～f：代表表面相關抗原（CD90、CD29 和 CD45），用流式細胞儀檢測：d 為 BMSCs 表面相關抗原 CD90 陽性，e 為CD29 陽性，f 為CD45 陰性，CD90 和 CD29 的百分比約為 99%，但 CD45 的百分比只有 1% 左右
經 5-氮雜胞苷誘導的 BMSCs 形態發生了改變，細胞體積增大，數量增多，呈長紡錘形。14 d 后，細胞互相連接，排列趨于一致。miRNA-21 組 BMSCs 的特征明顯高于 NC 組和 CK 組（圖 2）。miRNA-21 組細胞體積增大，數量明顯多于正常組和對照組。與 NC 組和 CK 組相比，miRNA-21 組 BMSCs 的特征更為明顯。
圖2
5-氮雜胞苷體外誘導骨髓間充質干細胞的特性觀察
a～c： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 3 d；d～f： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 7 d；g～i： BMSCs 經 5-氮雜胞苷誘導培養 14 d；a、d、g 為正常（CK）組；b、e、h 為對照（NC）組；c、f、i 為 miRNA-21 組；d～f：大鼠 BMSCs 經 5-氮雜胞苷處理 7 d 的形態學觀察（×100），細胞增大，呈球形或棒狀形態；g～i：大鼠 BMSCs 經 5-氮雜胞苷處理 14 d 的形態學觀察（×100），兩周后，細胞與相鄰細胞相連；miRNA-21 組細胞體積增大，數量明顯多于 CK 組和 NC 組；與 NC 組和 CK 組相比，miRNA-21 組 BMSCs 的特征更為明顯
2.2 miRNA-21 促進骨髓間充質干細胞增殖
3 組 BMSCs 細胞（miRNA-21 組、CK 組和 NC 組）分別培養 1 周、2 周和 3 周。MTT 分析用于檢測 1 周、2 周和 3 周后細胞的增殖（圖 3）。由于 miRNA-21 過表達，BMSCs 增殖增加；然而，NC 組和 CK 組的細胞增殖相似沒有變化。3 組細胞在相同條件下培養 1 周、2 周、3 周后，miRNA-21 組細胞增殖較其它兩組增加，差異有統計學意義（P=0.025）。
圖3
MTT 檢測細胞增殖情況
2.3 miRNA-21 減慢骨髓間充質干細胞凋亡
3 組細胞分別培養 1 周、2 周和 3 周。用流式細胞儀檢測 BMSCs 的凋亡。miRNA-21 組細胞凋亡率低于 NC 組和 CK 組（圖 4）。1 周時 miRNA-21 組細胞凋亡率約為 3.283%±0.025%，2 周時為 2.278%±0.045%，3 周時為 2.125%±0.035%。1 周時 NC 組細胞凋亡率約為 4.429%±0.027%，2 周時為 2.425%±0.045%，3 周時為 3.888%±0.019%；1 周時 CK 組細胞凋亡率約為 3.094%±0.050%，2 周時為 2.295%±0.023%，3 周時為 3.133%±0.013%。miRNA-21 組與 NC 組（P=0.031）、CK 組（P=0.020）差異有統計學意義。
圖4
流式細胞術檢測 3 組（NC、CK、miRNA-21 組）骨髓間充質干細胞凋亡情況
2.4 miRNA-21 促進骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞
5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 培養 3 周后，采用免疫熒光法檢測 cTnI 和 CD90。用 10 μmol/L 5-氮雜胞苷誘導 BMSCs 分化為心肌細胞樣細胞后出現 cTnI 陽性。但干細胞表面特異性抗原 CD90 的表達隨著 cTnI 的表達增多而逐漸消失。cTnI 在 miRNA-21 組的表達高于 NC 和 CK 組（圖 5）。即 miRNA-21 促進 BMSCs 向心肌細胞樣細胞的分化。BMSCs 分化為心肌樣細胞后，失去了干細胞的特性。
圖5
骨髓間充質干細胞經 5-氮雜胞苷處理后 3 周，用免疫熒光組織化學技術測定 BMSCs 表達心臟結構蛋白（cTnI）和 CD90
a、e、i：BMSCs cTnI 蛋白陽性染色（紅色熒光，×200）；b、f、j：BMSCs CD90 陽性染色（綠色熒光，×200）；c、g、k：BMSCs 的 DAPI 標記核（藍色熒光，×200）；d：合并圖 a、圖 c；h：合并圖 e、圖 g；l：合并圖 i、圖 k；a～d：CK 組；e～h：NC 組；i～l：miRNA-21 組；BMSCs：骨髓間充質干細胞；cTnI：心肌肌鈣蛋白 I
用 Western-blotting 檢測 cTnI 和 myod 的表達。miRNA-21 組的 cTnI 表達水平高于 NC 組和 CK 組（圖 6）。BMSCs 在體外誘導培養 1 周、2 周和 3 周后，miRNA-21 組的 cTnI 表達水平明顯高于 NC 組和 CK 組（圖 6），但各組中 myod 的表達量均較少，特別在 miRNA-21 組中，myod 的表達不明顯，比 NC 組和 CK 組均少。所以，BMSCs 可以分化成心肌樣細胞和肌肉細胞，但在特殊試劑誘導下大多數 BMSCs 可以分化成心肌樣細胞。兩周后，在 miRNA-21 的作用下，BMSCs 分化為心肌樣細胞為主，主要表達 cTnI。3 周后，在 miRNA-21 的作用下，cTnI 是 BMSCs 分化過程中唯一的表達。在這一過程中，miRNA-21 促進了 BMSCs 向心肌樣細胞的分化。
圖6
免疫印跡法檢測 cTnI 和 myod 蛋白的表達水平
a：1 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組； b：2 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組；c：3 周后，miRNA-21 組的 cTnI 蛋白表達水平高于 NC 組和 CK 組，但 myod 蛋白表達水平低于 NC 組和 CK 組；1～3 周 myod 蛋白表達水平越來越低，最后消失；但 cTnI 蛋白的表達水平越來越高；cTnI：心肌肌鈣蛋白 I；myod：骨骼肌相關蛋白；*：
3 討論
Friedenstein 等[21]在 1968 年對 MSCs 進行了描述。據報道， MSCs 在體外能夠增殖和分化[22-24]。而 BMSCs 的比例僅為 0.001%～0.01%。Wakitani 等[25]首次使用 Ficoll 密度梯度分離法從大鼠骨髓中獲得 BMSCs。MSCs 可以在體內外分化為心肌細胞譜系[26-28]，也可以分化成心肌細胞樣細胞[29-31]。本研究采用免疫熒光染色法和免疫印跡法檢測心肌細胞樣細胞中 cTnI 的表達。
干細胞治療的機制仍有待闡明，并且 BMSCs 的比例非常低，所以探討 BMSCs 不同分化過程中 miRNA-21 的作用有一定的必要性。
miRNA 是一類小的非編碼 RNA，其成熟產物是 22 個核苷酸長度的 miRNA，通過誘導翻譯抑制或轉錄降解負性調節基因表達。在細胞發育、增殖、分化和控制基因表達等各種生物學過程中，miRNAs 是重要的調節因子[10-12]。最近，許多研究[9, 13-16]報道了 miRNAs 在 MSCs 中的作用。眾所周知，miRNAs 在調節 MSCs 誘導成骨的過程中起到了作用[17]。研究表明，miRNAs 參與了干細胞特性的維持和分化。
miRNA-21 定位到染色體 17q23.2，與蛋白質編碼基因 VMP1（TMEM49）重疊。研究表明，其編碼多種腫瘤抑制蛋白基因的表達，如 10 號染色體上的磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）、腫瘤抑制基因原肌球蛋白 1（TPM1）、細胞程序死亡因子 4（PDCD4）、基質金屬蛋白酶抑制劑 RECK 和 TIMP3。miRNA-21 參與多種組織來源 MSCs 的分化，但對 miRNA-21 在 MSCs 中相關作用的研究非常有限[8, 18-19]。我們的研究發現 miRNA-21 在 BMSCs 向心肌細胞樣細胞分化過程中起到了作用。
miRNAs 以編碼 spryhomolog1（spry1）為靶點，負性調節 MSCs 的成骨分化。miRNA-21 促進 MSCs 向成骨細胞分化[32]。因此，miRNA-21 可作為治療骨缺損和其它骨疾病新的靶點[32]。此外，在脂肪生成和成骨的第 4 d，上調 miRNA-21 導致 ERK-MAPK 信號通路的活性增加，而下調 miRNA -21 則降低了該通路的活性。研究表明，miRNA -21 參與了多種病理和生理過程，特別在決定干細胞發育增殖分化的過程中[19]。生長分化因子 5（GDF-5）在軟骨形成調控過程中被確定為 miRNA-21 的直接靶點[33]。miRNA-21 在人脂肪源性間充質干細胞中起著重要的作用，可作為再生醫學和腫瘤生物學的治療工具[34]。證據表明，miRNA-21 是一個重要的腫瘤基因，在干細胞行為的調節中起著重要的作用。
在我們的研究中，發現 miRNA-21 加速了 BMSCs 的增殖，減緩了其凋亡，增強了 MBSCs 向心肌樣細胞的分化。研究[34]表明：在組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）中過表達 miRNA-21 抑制腫瘤的生長。相反，miRNA-21 的表達下調卻增加了相同細胞腫瘤生長。miRNA-21 在 MSCs 中發揮著新的重要作用[35]。因此，我們可以認為，miRNA-21 是一種有效的生物標志物，可以直接作為細胞治療的靶點。但是，仍然需要更深入的研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊文鋼實施研究，包括細胞培養等，撰寫文章； 薛松設計課題及相關技術指導；文德重進行細胞培養誘導及流式細胞術等；鄭輝進行 Western-blotting 及 MTT 等細胞生物學技術；單江桂收集、整理數據、圖片，進行細胞培養等。
