引用本文： 馮寧, 林峰, 張旭, 薛帆, 崔佑剛, 馬洋, 劉文志. Lgr5 蛋白和 E-鈣黏蛋白在胃癌組織中表達的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(3): 309-314. doi: 10.7507/1007-9424.201909064 復制
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其預后差，患者早期發現率低，出現癥狀時發現多為中晚期，其傳統治療方式多采用以手術為主輔以化療，但其效果仍然較差，腫瘤惡性侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移是其預后不良的主要原因，因此，近年來針對胃癌細胞的侵襲及轉移相關機制的探索成為研究的熱點。目前隨著胃癌研究的不斷深入，認為與腫瘤發生、發展密切相關的一個假說是癌干細胞（也稱腫瘤干細胞），其具有自我更新、抗化療藥物治療及耐放射線治療特性，其持續生長、復制能夠導致術后腫瘤的復發、化療后腫瘤再進展以及患者最終死亡。因此，研究的重點已不僅僅是殺死已增殖成熟的腫瘤細胞，還要通過其特定標志物早期檢測及特異性靶向治療消滅腫瘤干細胞。富含亮氨酸重復序列的 G 蛋白偶聯受體 5（leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5，Lgr5）作為已知直腸癌腫瘤干細胞的標志物目前在胃癌中被廣泛關注[1-4]；同時在建立并維持細胞間連接、細胞極性及組織構架方面起重要作用的E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）在胃癌研究中被認為是關鍵的腫瘤抑制基因。Lgr5 和 E-cad 被許多研究發現其存在基因甲基化而失活現象，可能與腫瘤發生及發展有密切關系。本研究著眼于探索胃癌可能的腫瘤干細胞標志物及可能用于胃癌術后風險評估的標志物，因此，檢測腫瘤干細胞標志物 Lgr5 及腫瘤抑制基因 E-cad 蛋白在胃癌組織的表達情況，并分析其與胃癌患者的臨床病理特征和生存的關系，同時分析其二者在胃癌發展中是否存在協同作用。
1 資料與方法
1.1 組織標本的收集
收集 2011–2013 年期間大連大學附屬中山醫院胃腸外科手術切除的胃腺癌標本（69 例）及距離癌組織 5 cm 以遠的正常胃黏膜組織（30 例）；同時收集這些患者的性別、年齡、分化程度、浸潤深度[5]、淋巴結轉移、遠處轉移及幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染情況。所有患者均為首次手術，術前未經過放、化療，手術切除組織均有病理報告。69 例胃腺癌患者中男 49 例，女 20 例；年齡 36～90 歲、（66±10）歲。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
一抗：鼠抗人單克隆抗 Lgr5 抗體（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）和兔抗人單克隆抗 E-cad 抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）試劑盒和 DAB 顯色劑（均購自武漢博士德生物技術有限公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、培養基等實驗耗材等（大連大學附屬中山醫院中心實驗室）。
1.2.2 檢測方法
手術標本常規經 4% 甲醛溶液固定，行石蠟包埋后連續切片 4 μm，再采用免疫組織化學 SABC 法染色以檢測 Lgr5 及 E-cad 蛋白表達情況。嚴格按照說明書進行操作：脫蠟、脫水、滅活、抗原修復、封閉工作液、加一抗、二抗、DAB 顯色、封片等步驟。陽性對照用已知的陽性組織，用 PBS 代替一抗作為陰性對照。采用快速尿素酶法檢測HP感染情況。
1.2.3 結果判斷
參照抗體說明書，Lgr5 蛋白表達以細胞漿和（或）細胞膜出現黃色和（或）棕黃色顆粒判斷為陽性，根據細胞著色程度和陽性細胞百分比進行半定量評分，按細胞著色程度計分：無色為 0 分、淺黃色為 1 分、黃色為 2 分、棕黃色為 3 分；按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數>75% 為 4 分、50%～75% 為 3 分、25%～50% 為 2 分、5%～25% 為 1 分、<5% 為 0 分進行判斷賦值。通過細胞著色程度與陽性細胞百分比分值進行相乘為最終表達計分，總分為 0～12 分，其中 0 分為不表達（–）、1～4 分為弱陽性表達（+）、5～8 分為中等陽性表達（++）、9～12 分為強陽性表達（+++）。E-cad 蛋白表達以細胞漿或細胞膜內存在棕黃色顆粒作為陽性標志，陽性細胞數>75% 為強陽性表達（+++）、50%～75% 為中等陽性表達（++）、10%～50% 為弱陽性表達（+）、<10% 為不表達（–）。最終陽性表達結果包括“（+）～（+++）”。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計分析。計數資料及四格表資料比較采用卡方（χ2）檢驗。兩等級變量相關性分析采用 Spearman 等級相關進行分析。術后 5 年生存分析采用 Kaplan-Meier 分析，采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者不同組織中的表達情況
Lgr5 蛋白在 60 例（87.0%）胃癌患者的胃癌組織中呈陽性表達，主要表達于細胞質和細胞膜中，呈黃色或棕黃色顆粒彌漫性表達（圖 1a），其在 5 例（16.7%）癌旁正常胃黏膜組織中也呈陽性表達（圖 1b）；E-cad 蛋白在 30 例（43.5%）胃癌患者的胃癌組織中呈陽性表達，主要表達于細胞膜及細胞漿中，呈棕黃色（圖 1c），其在 30 例（100%）癌旁正常胃黏膜組織中均呈陽性表達（圖 1d），主要表達于細胞膜及細胞漿中，呈棕黃色。Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者的胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的蛋白表達具體情況見表 1。Lgr5 蛋白表達陽性率在胃癌組織中明顯高于癌旁正常胃黏膜組織（χ2=45.814，P<0.001）；E-cad 蛋白表達陽性率在胃癌組織中明顯低于癌旁正常胃黏膜組織（χ2=11.249，P=0.001）。
圖1
免疫組織化學方法檢測 Lgr5 和 E-cad 蛋白表達情況（SABC 法 ×400）
a、b：Lgr5 蛋白在胃癌組織（a）及癌旁正常胃黏膜組織（b）中的表達；c、d：E-cad 蛋白在胃癌組織（c）及癌旁正常胃黏膜組織（d）中的表達
表1
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況（例）
2.2 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者臨床病理特征的關系以及其與患者 5 年生存率的關系
結果見表 2。Lgr5 和 E-cad 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率均與胃癌患者的性別和遠處轉移無關（P>0.05），二者的蛋白表達陽性率均與分化程度和浸潤深度有關，即 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌組織中明顯高于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌組織中（P<0.05），在有淋巴結轉移和 HP 感染陽性患者中明顯高于無淋巴結轉移及 HP 感染陰性患者（P<0.05）；E-cad 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌組織中明顯低于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌組織中（P<0.05），其與淋巴結轉移和 HP 感染無關（P<0.05）。Lgr5 蛋白表達陽性患者 5 年生存率為 28.33%（17/60），陰性患者的 5 年生存率為 66.67%（6/9），二者的 5 年總生存時間曲線比較差異無統計學意義（χ2=1.819，P=0.177）；E-cad 蛋白表達陽性患者 5 年生存率為 43.33%（13/30），陰性患者的 5 年生存率為 20.51%（8/39），陽性胃癌患者的 5 年總生存時間明顯優于陰性胃癌患者（χ2=5.814，P=0.016），見圖 2。
表2
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系［例（%）］
圖2
Lgr5（a）和 E-cad（b）蛋白在胃癌組織中表達陽性和陰性患者的總生存曲線比較
2.3 胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 E-cad 蛋白表達的相關性
經 Spearman 相關性分析顯示，Lgr5 蛋白表達與 E-cad 表達呈明顯的負相關（rs=–0.355，P=0.003），見表 3。
表3
胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 E-cad 蛋白表達的相關性分析結果（例）
3 討論
目前 Lgr5 蛋白在胃癌中被廣泛關注，同時作為抑癌基因的 E-cad 蛋白表達在胃癌發生及發展中的作用機制目前尚不明確。本研究對此進行了探索，并且探討了二者在胃癌發生及發展中是否具有協同作用。
3.1 Lgr5 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
Lgr5 蛋白是 G 蛋白偶聯受體家族的成員之一，其廣泛分布于人體各種組織中，如在毛囊、大腦、胃腸道、乳腺、生殖器官等均有表達，它的結構特點為其多肽鏈的細胞外區有 17 個富含亮氨酸的重復序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜區。Lgr5 蛋白廣泛表達于結直腸癌小腸和結腸黏膜的腺隱窩基底部的柱狀細胞中[1-8]，還發現下調其 mRNA 水平成功誘導了結直腸癌細胞的凋亡現象，因此認為其在惡性腫瘤的發生過程中可能起著潛在的促進作用；Lgr5 作為 Wnt 信號通路下游的靶向基因，其能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路的作用[9-16]。Lgr5 作為結腸癌腫瘤干細胞標志物在結腸癌組織中大量表達且與結腸癌的發生、復發、轉移、患者的生存預后等指標密切相關。目前也有研究者發現 Lgr5 在胃癌組織中呈高表達并懷疑其與胃癌的增殖、侵襲和轉移有關。本研究中結果發現，Lgr5 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率較癌旁正常胃黏膜組織中明顯升高，并且發現 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌組織中均較 T1+T2、N0 和高-中分化胃癌中明顯升高（P<0.05），結果提示，Lgr5 蛋白表達可能參與了腫瘤組織局部浸潤、淋巴轉移過程并與腫瘤分化程度較低密切相關，具有在結腸癌中類似的促腫瘤作用，但其具體機制仍需進一步的研究揭示；本研究中未發現 Lgr5 蛋白表達陽性率與腫瘤遠處轉移有關（P=0.486），分析其原因可能與納入樣本量有關，M1 期病例數僅有 5 例，客觀上可能會造成統計學上的偏差，后期的研究還需增大 M1 期患者的樣本量以明確 Lgr5 蛋白表達與腫瘤遠處轉移的確切相關性；本研究進一步分析了 Lgr5 蛋白陽性和陰性表達胃癌患者的術后 5 年生存情況，其結果未發現二者的術后 5 年生存率比較差異有統計學意義（P=0.117），還需增加樣本量及延長隨訪時間進一步分析才能得出明確結論。本實驗中還發現 HP 感染陽性患者具有較高的 Lgr5 蛋白表達陽性率，尚不明確二者是否具有協同作用，還需進一步的大樣本分析明確 HP 感染與 Lgr5 蛋白在胃癌進展中的聯系及具體機制。
3.2 E-cad 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
E-cad 是一種由染色體 16q22.1 上的 CDH1 基因編碼的嗜同種跨膜細胞黏附蛋白，其主要表達于上皮細胞內，該蛋白在建立并維持細胞間連接、細胞極性以及組織構架方面均起重要作用。CDH1 基因被認為在人類腫瘤中是關鍵的腫瘤抑制基因。E-cad 的異常表達已經被發現存在于多種腫瘤如結直腸癌、胃腺癌、乳腺癌及婦科腫瘤組織中。有研究[17-20]發現，CDH1 基因表達下調或失活與腫瘤的浸潤和遠處轉移有關，同時由于 E-cad 是一種位于上皮細胞內的鈣依賴性細胞黏附分子，其表達程度的改變可能造成腫瘤結構的改變。同時已有研究[1-4]證實其在結腸癌中失活或下調與腫瘤的浸潤生長和轉移潛能有關。本研究中發現，E-cad 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率較癌旁正常胃黏膜組織中明顯下調，并且發現 E-cad 表達在 T3+T4 期及低-未分化胃癌組織的表達陽性率均較 T1+T2 和高中分化明顯降低（P<0.05），結果提示，E-cad 蛋白表達陽性率低可能與腫瘤浸潤、組織分化較低等生物學特性有關，分析其機理可能是由于 E-cad 與細胞膜細胞骨架的良好錨合及其維持正常生物屏障功能密切相關，因此，E-cad 的表達異常、功能缺失或其細胞膜錨合結構中某些分子的缺損，都可能導致癌細胞脫離腫瘤組織而向周圍侵犯[20-25]；此外，本研究結果未發現胃癌組織中 E-cad 蛋白表達陽性率與患者性別、淋巴結轉移、遠處轉移及 HP 感染情況有關（P>0.05），還需要進一步探索；本研究進一步分析了 E-cad 蛋白陽性和陰性表達胃癌患者的術后 5 年生存情況，其結果顯示，E-cad 陽性表達患者的術后生存情況明顯優于陰性表達患者（P=0.016），結果提示，E-cad 不僅在腫瘤的浸潤及分化過程中發揮著重要作用，還與預后有關，未來 E-cad 檢測可作為判斷胃癌患者預后的重要指標之一。
3.3 Lgr5 蛋白與 E-cad 蛋白的關聯
Lgr5 作為腫瘤干細胞標志物在腫瘤發生及進展中起到重要作用，在胃癌中其表達上調是否會被其他抑癌基因所抑制目前尚不明確，如作為抑癌因子的 E-cad 蛋白是否對 Lgr5 有一定影響成為關注焦點。在本研究中發現，Lgr5 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，而 E-cad 蛋白表達陽性率情況與此相反且呈明顯的負相關關系（rs=–0.355，P=0.003），并且發現 E-cad 蛋白和 Lgr5 蛋白表達均與胃癌的局部浸潤和分化程度有關，結果提示，二者可能在胃癌的發生及發展過程中起到某種協同作用，但其具體機制還不清楚，需要進一步探索。
總之，從本研究初步結果提示，Lgr5 蛋白和E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率相對于癌旁正常胃黏膜組織分別上升和下降，且二者與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移有密切的關系，二者可能共同參與了胃癌的發生、發展及轉移過程；同時還發現 Lgr5 蛋白可能與 HP 感染具有協同作用，但其具體機制尚不清楚。本研究結論仍需大樣本的隨機對照研究證實并進一步發掘其在胃癌中的相互關系和作用機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮寧完成課題設計、課題實施及論文撰寫工作；劉文志、林峰完成論文設計、實驗指導；張旭、薛帆、崔佑剛、馬洋參與病例收集、部分免疫組化實驗、術后隨訪等工作。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬中山醫院倫理委員會審批（倫理編號：2016004）。
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其預后差，患者早期發現率低，出現癥狀時發現多為中晚期，其傳統治療方式多采用以手術為主輔以化療，但其效果仍然較差，腫瘤惡性侵襲、淋巴結轉移和遠處轉移是其預后不良的主要原因，因此，近年來針對胃癌細胞的侵襲及轉移相關機制的探索成為研究的熱點。目前隨著胃癌研究的不斷深入，認為與腫瘤發生、發展密切相關的一個假說是癌干細胞（也稱腫瘤干細胞），其具有自我更新、抗化療藥物治療及耐放射線治療特性，其持續生長、復制能夠導致術后腫瘤的復發、化療后腫瘤再進展以及患者最終死亡。因此，研究的重點已不僅僅是殺死已增殖成熟的腫瘤細胞，還要通過其特定標志物早期檢測及特異性靶向治療消滅腫瘤干細胞。富含亮氨酸重復序列的 G 蛋白偶聯受體 5（leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5，Lgr5）作為已知直腸癌腫瘤干細胞的標志物目前在胃癌中被廣泛關注[1-4]；同時在建立并維持細胞間連接、細胞極性及組織構架方面起重要作用的E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）在胃癌研究中被認為是關鍵的腫瘤抑制基因。Lgr5 和 E-cad 被許多研究發現其存在基因甲基化而失活現象，可能與腫瘤發生及發展有密切關系。本研究著眼于探索胃癌可能的腫瘤干細胞標志物及可能用于胃癌術后風險評估的標志物，因此，檢測腫瘤干細胞標志物 Lgr5 及腫瘤抑制基因 E-cad 蛋白在胃癌組織的表達情況，并分析其與胃癌患者的臨床病理特征和生存的關系，同時分析其二者在胃癌發展中是否存在協同作用。
1 資料與方法
1.1 組織標本的收集
收集 2011–2013 年期間大連大學附屬中山醫院胃腸外科手術切除的胃腺癌標本（69 例）及距離癌組織 5 cm 以遠的正常胃黏膜組織（30 例）；同時收集這些患者的性別、年齡、分化程度、浸潤深度[5]、淋巴結轉移、遠處轉移及幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染情況。所有患者均為首次手術，術前未經過放、化療，手術切除組織均有病理報告。69 例胃腺癌患者中男 49 例，女 20 例；年齡 36～90 歲、（66±10）歲。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
一抗：鼠抗人單克隆抗 Lgr5 抗體（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）和兔抗人單克隆抗 E-cad 抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）試劑盒和 DAB 顯色劑（均購自武漢博士德生物技術有限公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、培養基等實驗耗材等（大連大學附屬中山醫院中心實驗室）。
1.2.2 檢測方法
手術標本常規經 4% 甲醛溶液固定，行石蠟包埋后連續切片 4 μm，再采用免疫組織化學 SABC 法染色以檢測 Lgr5 及 E-cad 蛋白表達情況。嚴格按照說明書進行操作：脫蠟、脫水、滅活、抗原修復、封閉工作液、加一抗、二抗、DAB 顯色、封片等步驟。陽性對照用已知的陽性組織，用 PBS 代替一抗作為陰性對照。采用快速尿素酶法檢測HP感染情況。
1.2.3 結果判斷
參照抗體說明書，Lgr5 蛋白表達以細胞漿和（或）細胞膜出現黃色和（或）棕黃色顆粒判斷為陽性，根據細胞著色程度和陽性細胞百分比進行半定量評分，按細胞著色程度計分：無色為 0 分、淺黃色為 1 分、黃色為 2 分、棕黃色為 3 分；按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數>75% 為 4 分、50%～75% 為 3 分、25%～50% 為 2 分、5%～25% 為 1 分、<5% 為 0 分進行判斷賦值。通過細胞著色程度與陽性細胞百分比分值進行相乘為最終表達計分，總分為 0～12 分，其中 0 分為不表達（–）、1～4 分為弱陽性表達（+）、5～8 分為中等陽性表達（++）、9～12 分為強陽性表達（+++）。E-cad 蛋白表達以細胞漿或細胞膜內存在棕黃色顆粒作為陽性標志，陽性細胞數>75% 為強陽性表達（+++）、50%～75% 為中等陽性表達（++）、10%～50% 為弱陽性表達（+）、<10% 為不表達（–）。最終陽性表達結果包括“（+）～（+++）”。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計分析。計數資料及四格表資料比較采用卡方（χ2）檢驗。兩等級變量相關性分析采用 Spearman 等級相關進行分析。術后 5 年生存分析采用 Kaplan-Meier 分析，采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者不同組織中的表達情況
Lgr5 蛋白在 60 例（87.0%）胃癌患者的胃癌組織中呈陽性表達，主要表達于細胞質和細胞膜中，呈黃色或棕黃色顆粒彌漫性表達（圖 1a），其在 5 例（16.7%）癌旁正常胃黏膜組織中也呈陽性表達（圖 1b）；E-cad 蛋白在 30 例（43.5%）胃癌患者的胃癌組織中呈陽性表達，主要表達于細胞膜及細胞漿中，呈棕黃色（圖 1c），其在 30 例（100%）癌旁正常胃黏膜組織中均呈陽性表達（圖 1d），主要表達于細胞膜及細胞漿中，呈棕黃色。Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌患者的胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的蛋白表達具體情況見表 1。Lgr5 蛋白表達陽性率在胃癌組織中明顯高于癌旁正常胃黏膜組織（χ2=45.814，P<0.001）；E-cad 蛋白表達陽性率在胃癌組織中明顯低于癌旁正常胃黏膜組織（χ2=11.249，P=0.001）。
圖1
免疫組織化學方法檢測 Lgr5 和 E-cad 蛋白表達情況（SABC 法 ×400）
a、b：Lgr5 蛋白在胃癌組織（a）及癌旁正常胃黏膜組織（b）中的表達；c、d：E-cad 蛋白在胃癌組織（c）及癌旁正常胃黏膜組織（d）中的表達
表1
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況（例）
2.2 Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者臨床病理特征的關系以及其與患者 5 年生存率的關系
結果見表 2。Lgr5 和 E-cad 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率均與胃癌患者的性別和遠處轉移無關（P>0.05），二者的蛋白表達陽性率均與分化程度和浸潤深度有關，即 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌組織中明顯高于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌組織中（P<0.05），在有淋巴結轉移和 HP 感染陽性患者中明顯高于無淋巴結轉移及 HP 感染陰性患者（P<0.05）；E-cad 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期和低-未分化胃癌組織中明顯低于在 T1+T2 期和高-中分化胃癌組織中（P<0.05），其與淋巴結轉移和 HP 感染無關（P<0.05）。Lgr5 蛋白表達陽性患者 5 年生存率為 28.33%（17/60），陰性患者的 5 年生存率為 66.67%（6/9），二者的 5 年總生存時間曲線比較差異無統計學意義（χ2=1.819，P=0.177）；E-cad 蛋白表達陽性患者 5 年生存率為 43.33%（13/30），陰性患者的 5 年生存率為 20.51%（8/39），陽性胃癌患者的 5 年總生存時間明顯優于陰性胃癌患者（χ2=5.814，P=0.016），見圖 2。
表2
Lgr5 和 E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系［例（%）］
圖2
Lgr5（a）和 E-cad（b）蛋白在胃癌組織中表達陽性和陰性患者的總生存曲線比較
2.3 胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 E-cad 蛋白表達的相關性
經 Spearman 相關性分析顯示，Lgr5 蛋白表達與 E-cad 表達呈明顯的負相關（rs=–0.355，P=0.003），見表 3。
表3
胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 E-cad 蛋白表達的相關性分析結果（例）
3 討論
目前 Lgr5 蛋白在胃癌中被廣泛關注，同時作為抑癌基因的 E-cad 蛋白表達在胃癌發生及發展中的作用機制目前尚不明確。本研究對此進行了探索，并且探討了二者在胃癌發生及發展中是否具有協同作用。
3.1 Lgr5 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
Lgr5 蛋白是 G 蛋白偶聯受體家族的成員之一，其廣泛分布于人體各種組織中，如在毛囊、大腦、胃腸道、乳腺、生殖器官等均有表達，它的結構特點為其多肽鏈的細胞外區有 17 個富含亮氨酸的重復序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜區。Lgr5 蛋白廣泛表達于結直腸癌小腸和結腸黏膜的腺隱窩基底部的柱狀細胞中[1-8]，還發現下調其 mRNA 水平成功誘導了結直腸癌細胞的凋亡現象，因此認為其在惡性腫瘤的發生過程中可能起著潛在的促進作用；Lgr5 作為 Wnt 信號通路下游的靶向基因，其能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路的作用[9-16]。Lgr5 作為結腸癌腫瘤干細胞標志物在結腸癌組織中大量表達且與結腸癌的發生、復發、轉移、患者的生存預后等指標密切相關。目前也有研究者發現 Lgr5 在胃癌組織中呈高表達并懷疑其與胃癌的增殖、侵襲和轉移有關。本研究中結果發現，Lgr5 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率較癌旁正常胃黏膜組織中明顯升高，并且發現 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌組織中均較 T1+T2、N0 和高-中分化胃癌中明顯升高（P<0.05），結果提示，Lgr5 蛋白表達可能參與了腫瘤組織局部浸潤、淋巴轉移過程并與腫瘤分化程度較低密切相關，具有在結腸癌中類似的促腫瘤作用，但其具體機制仍需進一步的研究揭示；本研究中未發現 Lgr5 蛋白表達陽性率與腫瘤遠處轉移有關（P=0.486），分析其原因可能與納入樣本量有關，M1 期病例數僅有 5 例，客觀上可能會造成統計學上的偏差，后期的研究還需增大 M1 期患者的樣本量以明確 Lgr5 蛋白表達與腫瘤遠處轉移的確切相關性；本研究進一步分析了 Lgr5 蛋白陽性和陰性表達胃癌患者的術后 5 年生存情況，其結果未發現二者的術后 5 年生存率比較差異有統計學意義（P=0.117），還需增加樣本量及延長隨訪時間進一步分析才能得出明確結論。本實驗中還發現 HP 感染陽性患者具有較高的 Lgr5 蛋白表達陽性率，尚不明確二者是否具有協同作用，還需進一步的大樣本分析明確 HP 感染與 Lgr5 蛋白在胃癌進展中的聯系及具體機制。
3.2 E-cad 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系
E-cad 是一種由染色體 16q22.1 上的 CDH1 基因編碼的嗜同種跨膜細胞黏附蛋白，其主要表達于上皮細胞內，該蛋白在建立并維持細胞間連接、細胞極性以及組織構架方面均起重要作用。CDH1 基因被認為在人類腫瘤中是關鍵的腫瘤抑制基因。E-cad 的異常表達已經被發現存在于多種腫瘤如結直腸癌、胃腺癌、乳腺癌及婦科腫瘤組織中。有研究[17-20]發現，CDH1 基因表達下調或失活與腫瘤的浸潤和遠處轉移有關，同時由于 E-cad 是一種位于上皮細胞內的鈣依賴性細胞黏附分子，其表達程度的改變可能造成腫瘤結構的改變。同時已有研究[1-4]證實其在結腸癌中失活或下調與腫瘤的浸潤生長和轉移潛能有關。本研究中發現，E-cad 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率較癌旁正常胃黏膜組織中明顯下調，并且發現 E-cad 表達在 T3+T4 期及低-未分化胃癌組織的表達陽性率均較 T1+T2 和高中分化明顯降低（P<0.05），結果提示，E-cad 蛋白表達陽性率低可能與腫瘤浸潤、組織分化較低等生物學特性有關，分析其機理可能是由于 E-cad 與細胞膜細胞骨架的良好錨合及其維持正常生物屏障功能密切相關，因此，E-cad 的表達異常、功能缺失或其細胞膜錨合結構中某些分子的缺損，都可能導致癌細胞脫離腫瘤組織而向周圍侵犯[20-25]；此外，本研究結果未發現胃癌組織中 E-cad 蛋白表達陽性率與患者性別、淋巴結轉移、遠處轉移及 HP 感染情況有關（P>0.05），還需要進一步探索；本研究進一步分析了 E-cad 蛋白陽性和陰性表達胃癌患者的術后 5 年生存情況，其結果顯示，E-cad 陽性表達患者的術后生存情況明顯優于陰性表達患者（P=0.016），結果提示，E-cad 不僅在腫瘤的浸潤及分化過程中發揮著重要作用，還與預后有關，未來 E-cad 檢測可作為判斷胃癌患者預后的重要指標之一。
3.3 Lgr5 蛋白與 E-cad 蛋白的關聯
Lgr5 作為腫瘤干細胞標志物在腫瘤發生及進展中起到重要作用，在胃癌中其表達上調是否會被其他抑癌基因所抑制目前尚不明確，如作為抑癌因子的 E-cad 蛋白是否對 Lgr5 有一定影響成為關注焦點。在本研究中發現，Lgr5 在胃癌組織中的蛋白表達陽性率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，而 E-cad 蛋白表達陽性率情況與此相反且呈明顯的負相關關系（rs=–0.355，P=0.003），并且發現 E-cad 蛋白和 Lgr5 蛋白表達均與胃癌的局部浸潤和分化程度有關，結果提示，二者可能在胃癌的發生及發展過程中起到某種協同作用，但其具體機制還不清楚，需要進一步探索。
總之，從本研究初步結果提示，Lgr5 蛋白和E-cad 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率相對于癌旁正常胃黏膜組織分別上升和下降，且二者與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移有密切的關系，二者可能共同參與了胃癌的發生、發展及轉移過程；同時還發現 Lgr5 蛋白可能與 HP 感染具有協同作用，但其具體機制尚不清楚。本研究結論仍需大樣本的隨機對照研究證實并進一步發掘其在胃癌中的相互關系和作用機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮寧完成課題設計、課題實施及論文撰寫工作；劉文志、林峰完成論文設計、實驗指導；張旭、薛帆、崔佑剛、馬洋參與病例收集、部分免疫組化實驗、術后隨訪等工作。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬中山醫院倫理委員會審批（倫理編號：2016004）。
