引用本文： 姚丹, 張蓬波, 龔帥, 劉利, 王吉科, 任澤強. 胃轉流術對非肥胖型 GK 大鼠脂肪組織中SPARC 蛋白和 GLUT-4 蛋白表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(6): 685-690. doi: 10.7507/1007-9424.201908091 復制
胃轉流術（GBP）治療 2 型糖尿病（T2DM）是源于 1995 年，Pories 教授等[1]在實施 GBP 治療病態肥胖時偶然發現，合并 T2DM 的肥胖癥患者在術后數天、體質量顯著下降之前，患者的血糖和血漿胰島素水平即可恢復正常。目前 GBP 治療 T2DM 的效果獲得國內外認可，但其具體機制不明。筆者所在團隊的前期研究[2-5]證實了，GBP 可以改善肥胖型 T2DM 大鼠的肝臟、脂肪組織和骨骼肌組織的胰島素抵抗（IR）。目前越來越多的研究認為，脂肪組織是 IR 發生的始發部位[6]，脂肪組織作為重要的能量儲存來源，在 IR 的發生和發展過程中起到重要作用，而胰島素信號傳導通路障礙是導致 IR 的重要原因[7]。本研究旨在觀察 GBP 對 GK 大鼠脂肪組織中葡萄糖轉運體 4（GLUT-4）和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）表達的影響，探討 GBP 改善 IR 的可能機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑和設備
健康 Goto-Kakizaki (GK) 大鼠 40 只，SPF 級，鼠齡 8～12 周，體質量 290～350 g，由上海 Slac 公司提供；健康雄性 Wister 大鼠 10 只，SPF 級，鼠齡 8～12 周，體質量 290～340 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。
主要試劑和設備：大鼠胰島素酶聯免疫吸附試驗（ELISA）以及糖化血紅蛋白 ELISA 試劑盒（美國 Sigma 公司），GLUT-4 一抗、SPARC 一抗和 GAPDH 一抗（美國 abcam 公司），穩步血糖儀（OneTouch SureStep，美國強生公司），電泳儀（TANON 公司）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒以及聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（南京碧云天公司）。
1.2 動物分組
所有 GK 大鼠適應環境 1 周，禁食 12～14 h 后經內眥靜脈采血測空腹血糖（FPG）水平，篩除血糖低于 7.1 mmol/L 的 7 只大鼠，從剩下的 33 只大鼠中隨機（隨機數字表法，后同）挑選 30 只進行隨機分組：糖尿病手術組（DO 組）、糖尿病假手術組（DS 組）和糖尿病對照組（DC 組）各 10 只。
1.3 手術方法
DO 組大鼠行 GBS：術前禁食 12～14 h，不限飲水，給予 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，取上腹正中切口長 3 cm 進腹，切斷幽門，閉合十二指腸殘端；距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合，近端空腸與距此吻合口以遠 12 cm 處空腸行端側吻合。術后用慶大霉素（80 萬 U/L）2 mL 沖洗腹腔后關腹。具體手術方法及過程見圖 1。DS 組在與 DO 組相同部位分別切斷十二指腸和空腸，再原位端端吻合，不改變胃腸道正常解剖結構，保持與 DO 組相似的手術時間。術后用慶大霉素（80 萬 U/L） 2 mL 沖洗腹腔后關腹。
圖1
示 DO 組的手術步驟
a：顯露正常的胃腸結構，圖示胃十二指腸交界處；b：切斷幽門；c：距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合；d：近端空腸與距胃腸吻合口約 12 cm 處空腸行端側吻合
結果 DO 組術后存活 8 只，均入組；DS 組術后存活 9 只，隨機剔除 1 只，其余入組；DC 組隨機挑選 8 只入組，其余 GK 大鼠備用。Wister 大鼠適應環境 1 周后隨機選擇 8 只作為正常對照組（NC 組）。DC 組和 NC 組無特殊處理，每日給予同手術組同等量的食物，自由飲水，以排除進食量等因素的影響。
1.4 檢測指標及方法
術前及術后第 1、2、4 和 8 周時記錄 4 組大鼠的體質量，并用快速血糖儀檢測單次隨機 FPG；同時點經內眥靜脈采血 1 mL，離心后取血清–80 ℃ 保存，統一用 ELISA 法檢測空腹血清胰島素（Fins）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，樣本及標準品均設復孔。于術前與術后第 8 周時測定胰島素敏感指數（QUICKI），計算公式為：QUICKI=l/（logFINS+logFPG）。術后 8 周時以鍘刀斷頭法處死大鼠，剪取大鼠網膜脂肪組織并提取蛋白，以 BCA 法測定蛋白濃度，經 10% SDS-PAGE 電泳分離、濕轉膜后用 5% 脫脂奶粉封閉 2 h。以 1∶1 000 的比例稀釋一抗，4 ℃ 孵育過夜；1∶5 000 比例稀釋二抗，室溫孵育 1 h，同時用 GAPDH 作為內參照。通過電化學發光（ECL）系統顯色特異性反應條帶，包括 SPARC 條帶、GLUT-4 條帶和 GAPDH 條帶。反應條帶經成像儀拍照后，以 Smart View 分析圖像，得出亮度掃描比值。4 組大鼠所有樣本分別用 Western Blot 法重復檢測 3 次以上（取均值）。
1.5 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用成組 t 檢驗、配對 t 檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA，兩兩比較采用 LSD 法），統計方法根據研究目的進行調整。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
術后 1 周因受手術及飲食各方面因素影響，該時點本研究均不做比較分析。
2.1 4 組大鼠的體質量比較
與術前比較，DO 組大鼠的體質量在術后第2 周和第 4 周時維持在較低水平，與術前相比差異均有統計學意義（P<0.05），而術后第 8 周時體質量逐漸上升至正常水平，與術前比較差異無統計學意義（P>0.05）。與術前相比，其余 3 組大鼠的體質量呈上升趨勢。術前 4 組大鼠的體質量比較差異無統計學意義（P>0.05）；術后各時點 DO 組大鼠的體質量明顯低于同時間點的 DS、DC 和 NC 組大鼠（P<0.05）。具體見表 1。
表1
4 組大鼠的體質量比較（
，g，n=8）
2.2 4 組大鼠的 FPG 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠行 GBP 后第 1 周的 FPG 水平即開始下降，術后第 2、4 和 8 周持續降低，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。DS 組、DC 組及 NC 組術后各時間點的 FPG 水平與術前相比差異均無統計學意義（P>0.05）。
術前 NC 組大鼠的 FPG 水平低于其余 3 組，差異有統計學意義（P>0.05）；術后第 2、4 和 8 周時，同時點 DO 組和 NC 組的 FPG 水平均低于 DS 組和 DC 組（P<0.05），但同時點 DO 組和 NC 組比較、DS 組和 DC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 2。
表2
4 組大鼠的 FPG 水平比較（
，mmol/L，n=8）
2.3 4 組大鼠的 Fins 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠行 GBP 后第 1 周的 Fins 水平已經開始升高，術后第 2 周時 Fins 水平繼續升高，與術前相比差異有統計學意義（P<0.05），第 4 周和第 8 周逐漸下降至正常水平，與同時間點 NC 組相比差異不大。DS 組、DC 組及 NC 組術后各時間點的 Fins 水平與術前相比差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
表3
4 組大鼠的 Fins 水平比較（
，mU/L，n=8）
由于只為證明手術組的手術效果，本研究僅比較了 4 組大鼠術后第 2 周的 Fins 水平，術后其余時間點無比較價值，而且無需與 NC 組比較。結果 4 組大鼠術前的 Fins 水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 2 周時，DO 組大鼠的 Fins 水平高于 DS 組和 DC 組大鼠（P<0.05），而 DS 組和 DC 組大鼠的 Fins 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
2.4 4 組大鼠的 HbA1c 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠自術后 2 周開始 HbA1c 水平有逐漸下降趨勢，術后第 8 周降至（6.53±0.91）ng/mL，但與術前比較差異仍無統計學意義（P>0.05）。
由于 HbA1c 水平反映一段時間的變化，故本研究只關注術后第 8 周這一時點。術前 NC 組大鼠的 HbA1c 水平低于其余 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后第 8 周時，4 組大鼠的 HbA1c 水平比較差異無統計學意義（P>0.05），DO 組已接近 NC 組水平。具體見表 4。
表4
4 組大鼠的 HbA1c 水平比較（
，ng/mL，n=8）
2.5 4 組大鼠的 QUICKI 值比較
與術前比較，術后 8 周時 DO 組大鼠的 QUICKI 值上升，差異有統計學意義（P<0.05）；其余 3 組術后 8 周的 QUICKI 值與術前比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
術前 4 組大鼠的 QUICKI 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 8 周時，DO 組和 NC 組大鼠的 QUICKI 值較 DS 組和 DC 組大鼠高，差異有統計學意義（P<0.05），但 DO 組和 NC 組、DS 組和 DC 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 5。
表5
4 組大鼠的 QUICKI 值比較（
，n=8）
2.6 4 組大鼠術后 8 周時 GLUT-4 蛋白和 SPARC 蛋白的表達水平比較
術后 8 周時，DO 組大鼠 GLUT-4 蛋白的相對表達水平比 DC 組、DS 組和 NC 組升高（P<0.05），但 DC 組、DS 組和 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2a 和圖 2b。
圖2
示 4 組大鼠術后 8 周時 GLUT-4 和 SPARC 蛋白表達的電泳結果和半定量結果
a：GLUT-4 蛋白表達的電泳結果；b：GLUT-4 蛋白表達的半定量結果；c：SPARC 蛋白表達的電泳結果；d：SPARC 蛋白表達的半定量結果；與 DO 組比較，*
術后 8 周時，DO 組大鼠 SPARC 蛋白的相對表達水平比 DC 組、DS 組和 NC 組下降（P<0.05），但 DC 組、DS 組和 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2c 和圖 2d。
3 討論
本研究結果顯示：DO 組大鼠的體質量自術后 1 周開始下降，至術后 4 周時 DO 組大鼠的體質量從術前的（323.8±16.2）g 降低到（278.6±25.3）g，DO 組的 FPG 也由術前的（9.10±0.98）mmol/L 降到術后 4 周的（5.74±1.32）mmol/L，而術后 8 周時血糖已趨于正常水平，體質量卻開始上升，因此筆者認為，GBP 后血糖下降與體質量下降無關，這與 Yu 等[8]和李晗等[9]的研究結論一致。GBP 后 GK 大鼠 Fins 水平和 FPG 隨時間推移一樣趨于正常，并沒有持續升高，且術后 8 周時 QUICKI 值明顯提高，與筆者團隊前期研究證實的 GBP 對 T2DM 具有良好安全的降糖效果[3-5]，并能改善肝臟 IR[3]的結論一致，但 GBP 通過改善 IR 治療 T2DM 的具體機制尚不清楚，這也是當下一直在研究的熱點。
目前越來越多的研究認為，脂肪組織作為重要的能量儲備，同時也是 IR 發生的始發部位[6]，在 IR 的發生和發展過程中至關重要，而胰島素信號傳導通路障礙是導致 IR 的重要原因[7]。胰島素代謝信號通路中，胰島素與胰島素受體結合后經胰島素底物受體（IRS）/磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）通路和（或）Cap-CbI-Crk2 通路，或 JNK 通路[10]來調節糖代謝，其中血糖調節主要受 PI3K 通路的影響[6]。
SPARC 蛋白作為一種脂肪細胞因子，主要由脂肪細胞分泌，具有調節細胞增殖、分化以及抗黏附的作用。已有文獻報道，SPARC 蛋白在肺鱗狀細胞癌[11]、食管癌[12]、結腸癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]等腫瘤的發生和發展過程中可能發揮重要作用，甚至可能是室間隔缺損（VSD）的潛在血清標志物[16]。還有研究者[17]認為，SPARC 蛋白對青光眼濾泡瘢痕化有一定的影響。
近來國內外均有文獻報道[18-20]，SPARC 蛋白可能與肥胖、IR 和 T2DM 的發生密切相關。但目前研究對 SPARC 蛋白在 GBP 改善 IR 機制中發揮的作用并未作明確闡述。研究[19-20]顯示，脂肪細胞分化時雙向調節 SPARC 蛋白的表達和分泌，SPARC 蛋白調節異常易導致肥胖相關的一系列疾病，包括 T2DM 及其并發癥、心血管疾病等。所謂“雙向調節”體現在，SPARC 蛋白在脂肪細胞中能調節纖溶酶原激活物抑制劑 1（PAI-1）的表達，尤其是肥胖患者的脂肪細胞產生過多 SPARC 蛋白時會導致 PAI-1 的表達水平增高；高水平 SPARC 蛋白能調節細胞外基質蛋白的表達及其活性，對脂肪細胞進行重塑，促進脂肪組織血管重構及脂肪組織增生[21]；此外，SPARC 蛋白還可能通過增強 Wnt/β 連環蛋白信號通路，抑制脂肪細胞轉錄因子 CCAAT 增強子結合蛋白（C/EBP）α、C/EBPp、過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPARγ）等的表達，并使胞外纖連蛋白表達上調、層黏連蛋白表達下調，最終抑制脂肪形成[22]。另外，SPARC 蛋白過度表達也能導致胰島素分泌增加，在高血糖條件下高水平的胰島素會刺激脂肪組織分泌 SPARC 蛋白[23]。有研究[18]證實，SPARC 蛋白在 T2DM 患者的脂肪組織中高度表達，本實驗中 DS 組和 DC 組的實驗結果與其一致。Song 等[24]和 Jing 等[25]的研究證實，SPARC 蛋白可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），并促使 AKT 和 PI3K 磷酸化，進而上調 AMPK 調節的 GLUT-4 蛋白的表達，提高機體對胰島素的敏感性。而 GLUT-4 蛋白又是 PI3K 通路中的重要靶蛋白，可見 SPARC 蛋白參與 IR 的發生，并且對 PI3K/AKT/GLUT-4 信號通路可能有負反饋作用，而 GBP 能明顯改善 IR，并使 SPARC 蛋白的作用減弱。
本研究選取先天性糖尿病模型大鼠—GK 大鼠，隨機分組后 DO 組實施 GBP，以觀察 GBP 對 GK 大鼠脂肪組織中 GLUT-4 蛋白和 SPARC 蛋白表達的影響，探討 SPARC 蛋白在 GBP 改善 IR 中可能發揮的作用。本研究結果顯示：GBP 后 GK 大鼠的血糖逐漸降至正常并保持穩定，胰島素水平恢復正常，術后 8 周時脂肪組織中 GLUT-4 蛋白的表達水平明顯升高，SPARC 蛋白的表達水平顯著下降。本實驗結果表明，GBP 可以確切持續地降低血糖，其降低血糖的機制可能是通過減弱 SPARC 蛋白的表達，從而調節 PI3K/AKT 信號通路中的 GLUT-4 蛋白向細胞膜轉位，增加組織和細胞對葡萄糖的攝取和利用，進而改善脂肪組織的 IR。由此可見，SPARC 蛋白在 IR 的發生和發展過程中發揮了重要作用。本實驗為課題的前期研究，后期系列研究將著重于探索 PI3K/AKT/GLUT-4 信號通路與 IR 的聯系，有望為 IR 的可能機制尋找到一個新的突破口。
本實驗基于糖尿病模型—GK 大鼠開展，尚未擺脫物種的局限性。近年來臨床上已逐漸開展針對伴有肥胖或并發癥的 T2DM 患者進行 GBP，由于手術創傷大、合適患者少、理念落后、涉及倫理等問題，導致 GBP 很難大范圍開展，臨床病例不足，有待進一步積累病例數并檢測 T2DM 患者各相關指標的變化，以進一步探討 GBP 改善 IR 的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：姚丹和龔帥主要負責手術操作及動物護理；張蓬波負責手術技術指導；劉利和王吉科協助動物護理，仁澤強主要負責數據審核及論文指導。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會審批（倫理批文編號：XYFY2018-KL113）。
胃轉流術（GBP）治療 2 型糖尿病（T2DM）是源于 1995 年，Pories 教授等[1]在實施 GBP 治療病態肥胖時偶然發現，合并 T2DM 的肥胖癥患者在術后數天、體質量顯著下降之前，患者的血糖和血漿胰島素水平即可恢復正常。目前 GBP 治療 T2DM 的效果獲得國內外認可，但其具體機制不明。筆者所在團隊的前期研究[2-5]證實了，GBP 可以改善肥胖型 T2DM 大鼠的肝臟、脂肪組織和骨骼肌組織的胰島素抵抗（IR）。目前越來越多的研究認為，脂肪組織是 IR 發生的始發部位[6]，脂肪組織作為重要的能量儲存來源，在 IR 的發生和發展過程中起到重要作用，而胰島素信號傳導通路障礙是導致 IR 的重要原因[7]。本研究旨在觀察 GBP 對 GK 大鼠脂肪組織中葡萄糖轉運體 4（GLUT-4）和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）表達的影響，探討 GBP 改善 IR 的可能機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要試劑和設備
健康 Goto-Kakizaki (GK) 大鼠 40 只，SPF 級，鼠齡 8～12 周，體質量 290～350 g，由上海 Slac 公司提供；健康雄性 Wister 大鼠 10 只，SPF 級，鼠齡 8～12 周，體質量 290～340 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。
主要試劑和設備：大鼠胰島素酶聯免疫吸附試驗（ELISA）以及糖化血紅蛋白 ELISA 試劑盒（美國 Sigma 公司），GLUT-4 一抗、SPARC 一抗和 GAPDH 一抗（美國 abcam 公司），穩步血糖儀（OneTouch SureStep，美國強生公司），電泳儀（TANON 公司）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒以及聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（南京碧云天公司）。
1.2 動物分組
所有 GK 大鼠適應環境 1 周，禁食 12～14 h 后經內眥靜脈采血測空腹血糖（FPG）水平，篩除血糖低于 7.1 mmol/L 的 7 只大鼠，從剩下的 33 只大鼠中隨機（隨機數字表法，后同）挑選 30 只進行隨機分組：糖尿病手術組（DO 組）、糖尿病假手術組（DS 組）和糖尿病對照組（DC 組）各 10 只。
1.3 手術方法
DO 組大鼠行 GBS：術前禁食 12～14 h，不限飲水，給予 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，取上腹正中切口長 3 cm 進腹，切斷幽門，閉合十二指腸殘端；距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合，近端空腸與距此吻合口以遠 12 cm 處空腸行端側吻合。術后用慶大霉素（80 萬 U/L）2 mL 沖洗腹腔后關腹。具體手術方法及過程見圖 1。DS 組在與 DO 組相同部位分別切斷十二指腸和空腸，再原位端端吻合，不改變胃腸道正常解剖結構，保持與 DO 組相似的手術時間。術后用慶大霉素（80 萬 U/L） 2 mL 沖洗腹腔后關腹。
圖1
示 DO 組的手術步驟
a：顯露正常的胃腸結構，圖示胃十二指腸交界處；b：切斷幽門；c：距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸，遠端空腸與幽門行端端吻合；d：近端空腸與距胃腸吻合口約 12 cm 處空腸行端側吻合
結果 DO 組術后存活 8 只，均入組；DS 組術后存活 9 只，隨機剔除 1 只，其余入組；DC 組隨機挑選 8 只入組，其余 GK 大鼠備用。Wister 大鼠適應環境 1 周后隨機選擇 8 只作為正常對照組（NC 組）。DC 組和 NC 組無特殊處理，每日給予同手術組同等量的食物，自由飲水，以排除進食量等因素的影響。
1.4 檢測指標及方法
術前及術后第 1、2、4 和 8 周時記錄 4 組大鼠的體質量，并用快速血糖儀檢測單次隨機 FPG；同時點經內眥靜脈采血 1 mL，離心后取血清–80 ℃ 保存，統一用 ELISA 法檢測空腹血清胰島素（Fins）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，樣本及標準品均設復孔。于術前與術后第 8 周時測定胰島素敏感指數（QUICKI），計算公式為：QUICKI=l/（logFINS+logFPG）。術后 8 周時以鍘刀斷頭法處死大鼠，剪取大鼠網膜脂肪組織并提取蛋白，以 BCA 法測定蛋白濃度，經 10% SDS-PAGE 電泳分離、濕轉膜后用 5% 脫脂奶粉封閉 2 h。以 1∶1 000 的比例稀釋一抗，4 ℃ 孵育過夜；1∶5 000 比例稀釋二抗，室溫孵育 1 h，同時用 GAPDH 作為內參照。通過電化學發光（ECL）系統顯色特異性反應條帶，包括 SPARC 條帶、GLUT-4 條帶和 GAPDH 條帶。反應條帶經成像儀拍照后，以 Smart View 分析圖像，得出亮度掃描比值。4 組大鼠所有樣本分別用 Western Blot 法重復檢測 3 次以上（取均值）。
1.5 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用成組 t 檢驗、配對 t 檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA，兩兩比較采用 LSD 法），統計方法根據研究目的進行調整。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
術后 1 周因受手術及飲食各方面因素影響，該時點本研究均不做比較分析。
2.1 4 組大鼠的體質量比較
與術前比較，DO 組大鼠的體質量在術后第2 周和第 4 周時維持在較低水平，與術前相比差異均有統計學意義（P<0.05），而術后第 8 周時體質量逐漸上升至正常水平，與術前比較差異無統計學意義（P>0.05）。與術前相比，其余 3 組大鼠的體質量呈上升趨勢。術前 4 組大鼠的體質量比較差異無統計學意義（P>0.05）；術后各時點 DO 組大鼠的體質量明顯低于同時間點的 DS、DC 和 NC 組大鼠（P<0.05）。具體見表 1。
表1
4 組大鼠的體質量比較（，g，n=8）
2.2 4 組大鼠的 FPG 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠行 GBP 后第 1 周的 FPG 水平即開始下降，術后第 2、4 和 8 周持續降低，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。DS 組、DC 組及 NC 組術后各時間點的 FPG 水平與術前相比差異均無統計學意義（P>0.05）。
術前 NC 組大鼠的 FPG 水平低于其余 3 組，差異有統計學意義（P>0.05）；術后第 2、4 和 8 周時，同時點 DO 組和 NC 組的 FPG 水平均低于 DS 組和 DC 組（P<0.05），但同時點 DO 組和 NC 組比較、DS 組和 DC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 2。
表2
4 組大鼠的 FPG 水平比較（，mmol/L，n=8）
2.3 4 組大鼠的 Fins 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠行 GBP 后第 1 周的 Fins 水平已經開始升高，術后第 2 周時 Fins 水平繼續升高，與術前相比差異有統計學意義（P<0.05），第 4 周和第 8 周逐漸下降至正常水平，與同時間點 NC 組相比差異不大。DS 組、DC 組及 NC 組術后各時間點的 Fins 水平與術前相比差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
表3
4 組大鼠的 Fins 水平比較（，mU/L，n=8）
由于只為證明手術組的手術效果，本研究僅比較了 4 組大鼠術后第 2 周的 Fins 水平，術后其余時間點無比較價值，而且無需與 NC 組比較。結果 4 組大鼠術前的 Fins 水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 2 周時，DO 組大鼠的 Fins 水平高于 DS 組和 DC 組大鼠（P<0.05），而 DS 組和 DC 組大鼠的 Fins 水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
2.4 4 組大鼠的 HbA1c 水平比較
與術前比較，DO 組大鼠自術后 2 周開始 HbA1c 水平有逐漸下降趨勢，術后第 8 周降至（6.53±0.91）ng/mL，但與術前比較差異仍無統計學意義（P>0.05）。
由于 HbA1c 水平反映一段時間的變化，故本研究只關注術后第 8 周這一時點。術前 NC 組大鼠的 HbA1c 水平低于其余 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后第 8 周時，4 組大鼠的 HbA1c 水平比較差異無統計學意義（P>0.05），DO 組已接近 NC 組水平。具體見表 4。
表4
4 組大鼠的 HbA1c 水平比較（，ng/mL，n=8）
2.5 4 組大鼠的 QUICKI 值比較
與術前比較，術后 8 周時 DO 組大鼠的 QUICKI 值上升，差異有統計學意義（P<0.05）；其余 3 組術后 8 周的 QUICKI 值與術前比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
術前 4 組大鼠的 QUICKI 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 8 周時，DO 組和 NC 組大鼠的 QUICKI 值較 DS 組和 DC 組大鼠高，差異有統計學意義（P<0.05），但 DO 組和 NC 組、DS 組和 DC 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 5。
表5
4 組大鼠的 QUICKI 值比較（，n=8）
2.6 4 組大鼠術后 8 周時 GLUT-4 蛋白和 SPARC 蛋白的表達水平比較
術后 8 周時，DO 組大鼠 GLUT-4 蛋白的相對表達水平比 DC 組、DS 組和 NC 組升高（P<0.05），但 DC 組、DS 組和 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2a 和圖 2b。
圖2
示 4 組大鼠術后 8 周時 GLUT-4 和 SPARC 蛋白表達的電泳結果和半定量結果
a：GLUT-4 蛋白表達的電泳結果；b：GLUT-4 蛋白表達的半定量結果；c：SPARC 蛋白表達的電泳結果；d：SPARC 蛋白表達的半定量結果；與 DO 組比較，*
術后 8 周時，DO 組大鼠 SPARC 蛋白的相對表達水平比 DC 組、DS 組和 NC 組下降（P<0.05），但 DC 組、DS 組和 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2c 和圖 2d。
3 討論
本研究結果顯示：DO 組大鼠的體質量自術后 1 周開始下降，至術后 4 周時 DO 組大鼠的體質量從術前的（323.8±16.2）g 降低到（278.6±25.3）g，DO 組的 FPG 也由術前的（9.10±0.98）mmol/L 降到術后 4 周的（5.74±1.32）mmol/L，而術后 8 周時血糖已趨于正常水平，體質量卻開始上升，因此筆者認為，GBP 后血糖下降與體質量下降無關，這與 Yu 等[8]和李晗等[9]的研究結論一致。GBP 后 GK 大鼠 Fins 水平和 FPG 隨時間推移一樣趨于正常，并沒有持續升高，且術后 8 周時 QUICKI 值明顯提高，與筆者團隊前期研究證實的 GBP 對 T2DM 具有良好安全的降糖效果[3-5]，并能改善肝臟 IR[3]的結論一致，但 GBP 通過改善 IR 治療 T2DM 的具體機制尚不清楚，這也是當下一直在研究的熱點。
目前越來越多的研究認為，脂肪組織作為重要的能量儲備，同時也是 IR 發生的始發部位[6]，在 IR 的發生和發展過程中至關重要，而胰島素信號傳導通路障礙是導致 IR 的重要原因[7]。胰島素代謝信號通路中，胰島素與胰島素受體結合后經胰島素底物受體（IRS）/磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）通路和（或）Cap-CbI-Crk2 通路，或 JNK 通路[10]來調節糖代謝，其中血糖調節主要受 PI3K 通路的影響[6]。
SPARC 蛋白作為一種脂肪細胞因子，主要由脂肪細胞分泌，具有調節細胞增殖、分化以及抗黏附的作用。已有文獻報道，SPARC 蛋白在肺鱗狀細胞癌[11]、食管癌[12]、結腸癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]等腫瘤的發生和發展過程中可能發揮重要作用，甚至可能是室間隔缺損（VSD）的潛在血清標志物[16]。還有研究者[17]認為，SPARC 蛋白對青光眼濾泡瘢痕化有一定的影響。
近來國內外均有文獻報道[18-20]，SPARC 蛋白可能與肥胖、IR 和 T2DM 的發生密切相關。但目前研究對 SPARC 蛋白在 GBP 改善 IR 機制中發揮的作用并未作明確闡述。研究[19-20]顯示，脂肪細胞分化時雙向調節 SPARC 蛋白的表達和分泌，SPARC 蛋白調節異常易導致肥胖相關的一系列疾病，包括 T2DM 及其并發癥、心血管疾病等。所謂“雙向調節”體現在，SPARC 蛋白在脂肪細胞中能調節纖溶酶原激活物抑制劑 1（PAI-1）的表達，尤其是肥胖患者的脂肪細胞產生過多 SPARC 蛋白時會導致 PAI-1 的表達水平增高；高水平 SPARC 蛋白能調節細胞外基質蛋白的表達及其活性，對脂肪細胞進行重塑，促進脂肪組織血管重構及脂肪組織增生[21]；此外，SPARC 蛋白還可能通過增強 Wnt/β 連環蛋白信號通路，抑制脂肪細胞轉錄因子 CCAAT 增強子結合蛋白（C/EBP）α、C/EBPp、過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（PPARγ）等的表達，并使胞外纖連蛋白表達上調、層黏連蛋白表達下調，最終抑制脂肪形成[22]。另外，SPARC 蛋白過度表達也能導致胰島素分泌增加，在高血糖條件下高水平的胰島素會刺激脂肪組織分泌 SPARC 蛋白[23]。有研究[18]證實，SPARC 蛋白在 T2DM 患者的脂肪組織中高度表達，本實驗中 DS 組和 DC 組的實驗結果與其一致。Song 等[24]和 Jing 等[25]的研究證實，SPARC 蛋白可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），并促使 AKT 和 PI3K 磷酸化，進而上調 AMPK 調節的 GLUT-4 蛋白的表達，提高機體對胰島素的敏感性。而 GLUT-4 蛋白又是 PI3K 通路中的重要靶蛋白，可見 SPARC 蛋白參與 IR 的發生，并且對 PI3K/AKT/GLUT-4 信號通路可能有負反饋作用，而 GBP 能明顯改善 IR，并使 SPARC 蛋白的作用減弱。
本研究選取先天性糖尿病模型大鼠—GK 大鼠，隨機分組后 DO 組實施 GBP，以觀察 GBP 對 GK 大鼠脂肪組織中 GLUT-4 蛋白和 SPARC 蛋白表達的影響，探討 SPARC 蛋白在 GBP 改善 IR 中可能發揮的作用。本研究結果顯示：GBP 后 GK 大鼠的血糖逐漸降至正常并保持穩定，胰島素水平恢復正常，術后 8 周時脂肪組織中 GLUT-4 蛋白的表達水平明顯升高，SPARC 蛋白的表達水平顯著下降。本實驗結果表明，GBP 可以確切持續地降低血糖，其降低血糖的機制可能是通過減弱 SPARC 蛋白的表達，從而調節 PI3K/AKT 信號通路中的 GLUT-4 蛋白向細胞膜轉位，增加組織和細胞對葡萄糖的攝取和利用，進而改善脂肪組織的 IR。由此可見，SPARC 蛋白在 IR 的發生和發展過程中發揮了重要作用。本實驗為課題的前期研究，后期系列研究將著重于探索 PI3K/AKT/GLUT-4 信號通路與 IR 的聯系，有望為 IR 的可能機制尋找到一個新的突破口。
本實驗基于糖尿病模型—GK 大鼠開展，尚未擺脫物種的局限性。近年來臨床上已逐漸開展針對伴有肥胖或并發癥的 T2DM 患者進行 GBP，由于手術創傷大、合適患者少、理念落后、涉及倫理等問題，導致 GBP 很難大范圍開展，臨床病例不足，有待進一步積累病例數并檢測 T2DM 患者各相關指標的變化，以進一步探討 GBP 改善 IR 的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：姚丹和龔帥主要負責手術操作及動物護理；張蓬波負責手術技術指導；劉利和王吉科協助動物護理，仁澤強主要負責數據審核及論文指導。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會審批（倫理批文編號：XYFY2018-KL113）。
