引用本文： 秦臻, 汪勃, 譚趙霞, 羅書畫. 姜黃素抑制 TLR4/HMGB1 通路保護脂多糖誘導急性肺損傷的作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(6): 685-688. doi: 10.7507/1007-4848.202002050 復制
急性肺損傷是指機體受到各種致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮損傷，進而引起彌漫性肺間質及肺泡水腫，引起進行性低氧血癥和呼吸窘迫等臨床表現，影像學提示肺非均一性滲出，嚴重可引起急性呼吸窘迫綜合征危及生命，臨床常見致傷因素包括創傷、休克、感染等[1]。雖然目前有關抗感染、抗休克和支持治療方法取得了重大進展，但急性肺損傷的死亡率仍較高，臨床仍需要更多有效的藥物。炎癥反應是急性肺損傷中重要的因素之一，圍繞抗炎作用開發新的保護或治療急性肺損傷藥物具有重要意義[2]。
姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的酚類化合物，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[3]。研究[4]發現姜黃素可通過抑制炎癥反應發揮組織功能保護作用。目前關于姜黃素在急性肺損傷中的作用及機制研究較少。本研究擬通過腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立經典肺損傷動物模型，探討姜黃素對急性肺損傷的保護作用及相關機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
無特定病原體（SPF）級大鼠購自四川大學華西實驗動物中心；LPS、二甲基亞砜（DMSO）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1、ELISA 試劑盒、高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）、Toll 樣受體 4 （TLR4）蛋白抗體、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自北京索萊寶公司；iSTAT 血氣分析儀購自美國 Abbot 公司。
1.2 動物模型建立及分組
SPF 級 SD 大鼠 24 只，體重 220～250 g。通過隨機數字表法分至 3 組，每組 8 只。對照組：腹腔注射 3 mL/kg 生理鹽水+2 mL DMSO；LPS 組：5 mg/kg LPS 溶于 3 mL 生理鹽水腹腔注射，注射后 30 min 接受 2 mL DMSO 腹腔注射；LPS+姜黃素組：5 mg/kg LPS 溶于 3 mL 生理鹽水腹腔注射，注射后 30 min 接受 200 mg/kg 姜黃素溶于 2 mL DMSO 腹腔注射。
1.3 肺損傷指標檢測
實驗開始后 24 h，通過大鼠尾動脈抽取 2 mL 肝素化動脈血進行血氣分析，檢測動脈血氧分壓（PaO2）。
動脈血采集完畢后處死實驗動物，取右肺上葉稱重后置 80℃ 烤箱中烘烤 48 h，干燥至恒重，計算肺干濕重比（W/D）=濕重/干重。
取右肺下葉置于福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理改變，并計算肺損傷病理評分。評分標準：顯微鏡下對肺泡腔壁水腫增厚、肺泡內出血、中性粒細胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成這 5 種病理改變進行觀察，以是否出現上述病理改變評分（0 分為未出現，1 分為出現），累加后得出肺組織病理評分[5]。
1.4 肺組織炎癥水平檢測
取實驗動物左肺上葉 100 mg 肺組織進行勻漿，離心后取上清液進行檢測。分別采用 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 ELISA 試劑盒按照標準試劑盒步驟檢測各上清液中炎癥因子水平。
1.5 肺組織中 HMGB1 及 TLR4 蛋白表達水平檢測
取實驗動物左肺下葉 100 mg 組織，冰面上剪碎后液氮冷凍，研磨成勻漿，加入 RIPA 裂解液后 12 000 g 4 ℃ 離心 15 min，取上清液采用 BCA 試劑盒進行蛋白定量，配制上樣液。取 50 μg 總蛋白按照標準 Western blotting 步驟檢測 HMGB1 及 TLR4 蛋白水平。蛋白電泳結束后加入化學發光劑，于暗室中曝光、顯影和定影，利用凝膠成像系統采集和分析圖像，結果以目的蛋白條帶灰度值/β-actin 灰度值表示。
1.6 統計學分析
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（
±s）表示，三組數據兩兩比較采用單因素方差分析，后采用 LSD 法進行檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺損傷水平比較
LPS 組實驗動物 PaO2 低于對照組，LPS+姜黃素組 PaO2 高于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；LPS 組實驗動物肺干濕重比高于對照組，LPS+姜黃素組肺干濕重比低于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；LPS 組實驗動物病理評分高于對照組，LPS+姜黃素組病理評分低于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05，表1）。與對照組（圖1a）相比，LPS 組（圖1b）肺組織出現肺泡壁組織水腫、肺間質出血以及中性粒細胞浸潤等典型肺損傷的病理結構改變，LPS+姜黃素組（圖1c）肺組織病理損傷程度較 LPS 組（圖1b）顯著改善。
表1
各組大鼠肺損傷指標比較（
）
圖1
各組實驗動物肺病理損傷情況（×200）
a：對照組；b：LPS 組；c：LPS+姜黃素組
2.2 肺組織中炎癥因子水平比較
LPS 組實驗動物肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 水平較對照組均出現升高，LPS+姜黃素組肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 水平較 LPS 組均出現下降，差異具有統計學意義（P<0.05，表2）。
表2
各組大鼠肺組織中炎癥因子水平比較（
）
2.3 肺組織中 HMGB1 及 TLR4 水平比較
通過蛋白免疫印跡法檢測肺組織中 HMGB1 和 TLR4 蛋白表達水平發現，LPS 組 HMGB1、TLR4 蛋白表達水平顯著高于對照組，LPS+姜黃素組 HMGB1、TLR4 蛋白水平顯著低于 LPS 組，差異具有統計學意義（P<0.05，圖2）。
圖2
各組實驗動物肺組織中 TLR4、HMGB1 表達情況
*與對照組比較，
3 討論
從本研究結果來看，姜黃素可提高實驗動物動脈血 PaO2、降低肺干濕重比和病理評分。通過病理分析也發現姜黃素改善實驗動物肺病理損傷，發揮了保護急性肺損傷的作用。通過對肺組織中的炎癥因子進行測定，發現姜黃素降低了肺組織中炎癥因子水平。進一步蛋白水平分析發現姜黃素降低了肺組織中 HMGB1 和 TLR4 蛋白水平。
姜黃素是從植物姜黃根莖中提取的中藥單體，為二苯基庚烴類化合物。現有的研究[3]發現姜黃素在抗氧化、抗病毒、抗炎和抗腫瘤方面發揮廣泛作用，逐漸成為藥物研究的熱點。目前國內外關于姜黃素保護急性肺損傷的研究較少。最新研究[6]顯示，姜黃素可通過調節 RAGE 通路發揮急性肺損傷保護作用；也有學者[7]發現姜黃素可通過激活 AMPK 信號通路保護 LPS 誘導的急性肺損傷。上述研究中均提到姜黃素是通過調節炎癥信號通路蛋白，降低實驗動物炎癥反應水平，從而發揮保護作用。本研究發現，姜黃素可以降低 LPS 誘導急性肺損傷實驗動物肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 的表達水平，同樣提示姜黃素的肺保護作用與抑制炎癥反應相關，這與既往研究報道類似。
TLR4 是第一個被認為識別病原相關分子模式的受體，其可識別包括 LPS 在內的病原相關分子模式，引起機體免疫炎性反應，發揮損傷細胞及組織的作用[8]。HMGB1 是細胞核內的非組蛋白核蛋白，其以高度保守的序列存在于所有真核細胞中；HMGB1 由三個區域構成，其中 B 盒為 DNA 結合區，具有誘導巨噬細胞、激活釋放炎癥因子的作用[9]。HMGB1 在組織損傷后釋放，又可與 TLR4 受體結合，繼而通過 MyD88 依賴途徑激活 NF-κB[10]，引起炎癥反應[11]。所以，LPS 可能是先通過 TLR4 引起炎性細胞損傷，釋放 HMGB1 后再通過 TLR4 通路加重炎癥反應程度，形成惡性循環后導致急性肺損傷。從本研究結果來看，姜黃素不僅抑制了實驗動物肺組織中 TLR4 的表達，也抑制了 HMGB1 的表達，這可能是姜黃素打破 LPS 誘導急性肺損傷惡性循環的機制。
目前國內外陸續發表關于姜黃素發揮肺保護作用的文獻[6, 12-13]，其中有文獻[14]發現 TLR4、NF-κB 誘導的炎癥反應是姜黃素發揮肺保護作用的機制，本研究也發現 TLR4 在姜黃素肺保護作用中發揮關鍵作用，與既往文獻一致；此外，本研究發現 HMGB1 這一損傷相關分子模式也參與姜黃素肺保護過程，并提出 LPS 先通過 TLR4 這一經典途徑誘導肺組織炎癥反應，上調的炎癥因子損傷肺組織，釋放組織中的 HMGB1，再刺激 TLR4 和炎癥因子，形成惡性循環，為探討姜黃素的肺保護作用提供新的機制。本研究尚存不足，實驗未涉及 LPS-TLR4-HMGB1 三者惡性循環的驗證，未來可設計細胞實驗，探討三者之間惡性循環這一理論的可能性。
綜上，本研究發現姜黃素可能通過 TLR4-HMGB1 通路抑制 LPS 引起的肺炎癥反應，繼而發揮保護肺功能的作用。本研究為姜黃素應用于急性肺損傷治療提供了理論依據，提示姜黃素可作為急性肺損傷的保護藥物應用于臨床。
利益沖突：無。
作者貢獻：秦臻負責實驗設計及完成，論文撰寫；汪勃負責動物模型建立；譚趙霞負責分子生物學檢測；羅書畫負責實驗設計和論文審校。
急性肺損傷是指機體受到各種致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮損傷，進而引起彌漫性肺間質及肺泡水腫，引起進行性低氧血癥和呼吸窘迫等臨床表現，影像學提示肺非均一性滲出，嚴重可引起急性呼吸窘迫綜合征危及生命，臨床常見致傷因素包括創傷、休克、感染等[1]。雖然目前有關抗感染、抗休克和支持治療方法取得了重大進展，但急性肺損傷的死亡率仍較高，臨床仍需要更多有效的藥物。炎癥反應是急性肺損傷中重要的因素之一，圍繞抗炎作用開發新的保護或治療急性肺損傷藥物具有重要意義[2]。
姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的酚類化合物，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[3]。研究[4]發現姜黃素可通過抑制炎癥反應發揮組織功能保護作用。目前關于姜黃素在急性肺損傷中的作用及機制研究較少。本研究擬通過腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立經典肺損傷動物模型，探討姜黃素對急性肺損傷的保護作用及相關機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
無特定病原體（SPF）級大鼠購自四川大學華西實驗動物中心；LPS、二甲基亞砜（DMSO）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1、ELISA 試劑盒、高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）、Toll 樣受體 4 （TLR4）蛋白抗體、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自北京索萊寶公司；iSTAT 血氣分析儀購自美國 Abbot 公司。
1.2 動物模型建立及分組
SPF 級 SD 大鼠 24 只，體重 220～250 g。通過隨機數字表法分至 3 組，每組 8 只。對照組：腹腔注射 3 mL/kg 生理鹽水+2 mL DMSO；LPS 組：5 mg/kg LPS 溶于 3 mL 生理鹽水腹腔注射，注射后 30 min 接受 2 mL DMSO 腹腔注射；LPS+姜黃素組：5 mg/kg LPS 溶于 3 mL 生理鹽水腹腔注射，注射后 30 min 接受 200 mg/kg 姜黃素溶于 2 mL DMSO 腹腔注射。
1.3 肺損傷指標檢測
實驗開始后 24 h，通過大鼠尾動脈抽取 2 mL 肝素化動脈血進行血氣分析，檢測動脈血氧分壓（PaO2）。
動脈血采集完畢后處死實驗動物，取右肺上葉稱重后置 80℃ 烤箱中烘烤 48 h，干燥至恒重，計算肺干濕重比（W/D）=濕重/干重。
取右肺下葉置于福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理改變，并計算肺損傷病理評分。評分標準：顯微鏡下對肺泡腔壁水腫增厚、肺泡內出血、中性粒細胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成這 5 種病理改變進行觀察，以是否出現上述病理改變評分（0 分為未出現，1 分為出現），累加后得出肺組織病理評分[5]。
1.4 肺組織炎癥水平檢測
取實驗動物左肺上葉 100 mg 肺組織進行勻漿，離心后取上清液進行檢測。分別采用 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 ELISA 試劑盒按照標準試劑盒步驟檢測各上清液中炎癥因子水平。
1.5 肺組織中 HMGB1 及 TLR4 蛋白表達水平檢測
取實驗動物左肺下葉 100 mg 組織，冰面上剪碎后液氮冷凍，研磨成勻漿，加入 RIPA 裂解液后 12 000 g 4 ℃ 離心 15 min，取上清液采用 BCA 試劑盒進行蛋白定量，配制上樣液。取 50 μg 總蛋白按照標準 Western blotting 步驟檢測 HMGB1 及 TLR4 蛋白水平。蛋白電泳結束后加入化學發光劑，于暗室中曝光、顯影和定影，利用凝膠成像系統采集和分析圖像，結果以目的蛋白條帶灰度值/β-actin 灰度值表示。
1.6 統計學分析
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，三組數據兩兩比較采用單因素方差分析，后采用 LSD 法進行檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺損傷水平比較
LPS 組實驗動物 PaO2 低于對照組，LPS+姜黃素組 PaO2 高于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；LPS 組實驗動物肺干濕重比高于對照組，LPS+姜黃素組肺干濕重比低于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；LPS 組實驗動物病理評分高于對照組，LPS+姜黃素組病理評分低于 LPS 組，差異均具有統計學意義（P<0.05，表1）。與對照組（圖1a）相比，LPS 組（圖1b）肺組織出現肺泡壁組織水腫、肺間質出血以及中性粒細胞浸潤等典型肺損傷的病理結構改變，LPS+姜黃素組（圖1c）肺組織病理損傷程度較 LPS 組（圖1b）顯著改善。
表1
各組大鼠肺損傷指標比較（）
圖1
各組實驗動物肺病理損傷情況（×200）
a：對照組；b：LPS 組；c：LPS+姜黃素組
2.2 肺組織中炎癥因子水平比較
LPS 組實驗動物肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 水平較對照組均出現升高，LPS+姜黃素組肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 水平較 LPS 組均出現下降，差異具有統計學意義（P<0.05，表2）。
表2
各組大鼠肺組織中炎癥因子水平比較（）
2.3 肺組織中 HMGB1 及 TLR4 水平比較
通過蛋白免疫印跡法檢測肺組織中 HMGB1 和 TLR4 蛋白表達水平發現，LPS 組 HMGB1、TLR4 蛋白表達水平顯著高于對照組，LPS+姜黃素組 HMGB1、TLR4 蛋白水平顯著低于 LPS 組，差異具有統計學意義（P<0.05，圖2）。
圖2
各組實驗動物肺組織中 TLR4、HMGB1 表達情況
*與對照組比較，
3 討論
從本研究結果來看，姜黃素可提高實驗動物動脈血 PaO2、降低肺干濕重比和病理評分。通過病理分析也發現姜黃素改善實驗動物肺病理損傷，發揮了保護急性肺損傷的作用。通過對肺組織中的炎癥因子進行測定，發現姜黃素降低了肺組織中炎癥因子水平。進一步蛋白水平分析發現姜黃素降低了肺組織中 HMGB1 和 TLR4 蛋白水平。
姜黃素是從植物姜黃根莖中提取的中藥單體，為二苯基庚烴類化合物。現有的研究[3]發現姜黃素在抗氧化、抗病毒、抗炎和抗腫瘤方面發揮廣泛作用，逐漸成為藥物研究的熱點。目前國內外關于姜黃素保護急性肺損傷的研究較少。最新研究[6]顯示，姜黃素可通過調節 RAGE 通路發揮急性肺損傷保護作用；也有學者[7]發現姜黃素可通過激活 AMPK 信號通路保護 LPS 誘導的急性肺損傷。上述研究中均提到姜黃素是通過調節炎癥信號通路蛋白，降低實驗動物炎癥反應水平，從而發揮保護作用。本研究發現，姜黃素可以降低 LPS 誘導急性肺損傷實驗動物肺組織中 TNF-α、IL-6 及 MCP-1 的表達水平，同樣提示姜黃素的肺保護作用與抑制炎癥反應相關，這與既往研究報道類似。
TLR4 是第一個被認為識別病原相關分子模式的受體，其可識別包括 LPS 在內的病原相關分子模式，引起機體免疫炎性反應，發揮損傷細胞及組織的作用[8]。HMGB1 是細胞核內的非組蛋白核蛋白，其以高度保守的序列存在于所有真核細胞中；HMGB1 由三個區域構成，其中 B 盒為 DNA 結合區，具有誘導巨噬細胞、激活釋放炎癥因子的作用[9]。HMGB1 在組織損傷后釋放，又可與 TLR4 受體結合，繼而通過 MyD88 依賴途徑激活 NF-κB[10]，引起炎癥反應[11]。所以，LPS 可能是先通過 TLR4 引起炎性細胞損傷，釋放 HMGB1 后再通過 TLR4 通路加重炎癥反應程度，形成惡性循環后導致急性肺損傷。從本研究結果來看，姜黃素不僅抑制了實驗動物肺組織中 TLR4 的表達，也抑制了 HMGB1 的表達，這可能是姜黃素打破 LPS 誘導急性肺損傷惡性循環的機制。
目前國內外陸續發表關于姜黃素發揮肺保護作用的文獻[6, 12-13]，其中有文獻[14]發現 TLR4、NF-κB 誘導的炎癥反應是姜黃素發揮肺保護作用的機制，本研究也發現 TLR4 在姜黃素肺保護作用中發揮關鍵作用，與既往文獻一致；此外，本研究發現 HMGB1 這一損傷相關分子模式也參與姜黃素肺保護過程，并提出 LPS 先通過 TLR4 這一經典途徑誘導肺組織炎癥反應，上調的炎癥因子損傷肺組織，釋放組織中的 HMGB1，再刺激 TLR4 和炎癥因子，形成惡性循環，為探討姜黃素的肺保護作用提供新的機制。本研究尚存不足，實驗未涉及 LPS-TLR4-HMGB1 三者惡性循環的驗證，未來可設計細胞實驗，探討三者之間惡性循環這一理論的可能性。
綜上，本研究發現姜黃素可能通過 TLR4-HMGB1 通路抑制 LPS 引起的肺炎癥反應，繼而發揮保護肺功能的作用。本研究為姜黃素應用于急性肺損傷治療提供了理論依據，提示姜黃素可作為急性肺損傷的保護藥物應用于臨床。
利益沖突：無。
作者貢獻：秦臻負責實驗設計及完成，論文撰寫；汪勃負責動物模型建立；譚趙霞負責分子生物學檢測；羅書畫負責實驗設計和論文審校。
