引用本文： 劉希, 楊文生, 康政宇, 陳詣佳, 胡笑宇, 黃偉, 何升東, 張林. 可視化人結直腸癌細胞裸鼠直腸原位移植淋巴轉移模型的建立. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(6): 679-684. doi: 10.7507/1007-9424.201908074 復制
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大發病率和第二大死亡率的惡性腫瘤[1]。我國 CRC 5 年生存率為 57%[2]。很明顯，仍需要新療法來改善晚期 CRC 的生存率。結直腸癌動物模型是新藥和新技術臨床前研究的主要支撐，因此，迫切需要盡可能模擬結直腸癌生物學的動物模型。在以往的研究中，皮下異位移植瘤在研究藥物和靶向治療效果的小鼠腫瘤模型中占主導地位，其操作簡單，又方便觀察和測量腫瘤大小。但是，結直腸癌皮下種植形成的是異位腫瘤微環境，且不易發生轉移，缺乏原位移植瘤發展、侵襲、轉移的過程。而原位腫瘤細胞移植則很好地彌補了這一點。活體熒光成像技術采用熒光報告基團（熒光蛋白、熒光染料、熒光探針等）標記細胞、核酸、蛋白質等，通過采集活體成像系統中激發熒光報告基團發出熒光信號，完成實時示蹤靶細胞，觀察分析基因及蛋白表達。在動物模型中，熒光蛋白成像已經廣泛用于無創觀察腫瘤[3-4]、基因表達[5]、移植物抗宿主病[6]和傳染病[7]。目前，國內未見有關于建立可視化直腸癌細胞原位移植淋巴轉移模型的報道。本研究旨在建立一種無創又易于實時監測直腸癌生物學行為和評估新療法療效的原位模型。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
IMDM 培養基、胎牛血清和 0.25% 胰酶-0.02% EDTA 均購自美國 HyClone 公司。兔抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）單克隆抗體購自美國 Abcam 公司，兔二步法試劑盒購自北京中杉金橋公司。小動物活體成像系統為法國 Vilber 公司產品，眼科顯微鏡為德國 ZEISS 公司產品。
1.2 實驗動物
SPF 級 BALB/C nu/nu 雄性裸鼠 50 只，鼠齡 4～6 周，體質量 18～23 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于陸軍特色醫學中心實驗動物中心的獨立通氣籠盒內，實驗動物許可證號：SYXK（渝）2017-0005。
1.3 腫瘤細胞
紅色熒光蛋白標記的人結直腸腺癌細胞 HCT 116，購自北京協和細胞資源中心。用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培養基作為培養用液，于 37 ℃、5% CO2 細胞培養箱內培養，每 3 天傳代 1 次，按 1∶4 傳代 2 次可收獲足夠的細胞。
1.4 原位移植細胞懸液的制備
每瓶對數生長期的 HCT 116 細胞，加入 1 mL 胰酶/EDTA 混合液消化 20 s，于倒置顯微鏡下觀察到多角形細胞變為卵圓形后，加入等體積培養基終止消化，輕輕吹打瓶壁促使細胞脫落。800 r/min 離心 5 min 后棄上清，加入 PBS 制成細胞懸液，計數后調整細胞濃度為 1×108/mL，臺盼藍染色后，將細胞存活率>90% 的細胞懸液置于冰盒中待用，于 30 min 內注射。
1.5 直腸原位移植瘤模型的建立
將 50 只裸鼠按隨機數字表法分為 8 組，第 1～7 組每組 6 只，第 8 組 8 只，適應性喂養 7 d 后建立模型。以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，仰臥位固定，碘伏消毒肛周皮膚。鑷子擴肛后，用 5 mL PBS 液清潔直腸，置入 3/4 周 7 mm 長的硅膠管（外徑 5 mm，內徑 3 mm）擴張直腸[8]。水平持握 100 μL 微量進液器，在 ZEISS 眼科顯微鏡直視下，距肛緣 1 mm 處針尖下壓，刺破直腸黏膜后壁，水平進針 3 mm，于直腸黏膜下緩慢注射 40 μL HCT 116 細胞懸液（4×106個）。退針后立即用棉簽壓迫，盡量減少細胞懸液外溢。注射完畢后將裸鼠放回籠中飼養。
1.6 直腸原位移植瘤模型的動態觀測
裸鼠直腸黏膜下注射 HCT 116 細胞后，每周觀察其精神、活動情況以及體質量的變化，并觸診肛周有無隆起的腫塊。每周用活體成像系統監測直腸原位移植瘤的生長和轉移情況。應用 Image J 軟件測算腫瘤熒光積分光密度值。每周取材后用游標卡尺測量瘤塊長度 a 和寬度 b，按公式計算腫瘤體積：V=a×b2/2，并繪制腫瘤生長曲線。
1.7 組織學檢查
在原位移植后 1～7 周每周處死 6 只裸鼠，顯露直腸腫瘤、腹膜后淋巴結和腹腔臟器，肉眼觀察其大小形態、浸潤轉移情況，然后取材，用 4% 多聚甲醛固定，30% 蔗糖脫水，制作冷凍切片，進行 HE 染色和免疫組織化學染色標記觀察。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（
±s）表示。裸鼠體質量、腫瘤體積和腫瘤積分光密度比較采用方差分析，多重比較采用 Bonferroni 法。腫瘤積分光密度與腫瘤體積之間的關系采用直線回歸分析，并用方差分析對回歸方程作假設檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 直腸原位移植后腫瘤生長轉移和裸鼠一般情況的動態觀察結果
直腸原位移植后 1 周時對裸鼠肛周皮下觸診，未發現包塊；2 周時所有裸鼠肛周皮下可捫及小硬結；3～7 周時肉眼和皮下觸診均發現原位移植部位的腫塊。
直腸原位移植后 1 周時對裸鼠活體成像未發現原位移植部位熒光蛋白表達，但取材后探測到所有裸鼠直腸原位移植瘤形成和 1 只裸鼠腸系膜根部淋巴結[9]有熒光蛋白表達。2～7 周時通過活體成像系統觀察到所有裸鼠原位移植部位的熒光蛋白表達（圖1a-1f），取材后還可見腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺及腎有熒光蛋白表達（圖1g-1l）。隨著原位移植后時間的延長，腫瘤體積和積分光密度值（表1）逐漸增大，裸鼠表達熒光蛋白的腸系膜根部淋巴結逐漸增多（圖1m）。腫瘤積分光密度值與腫瘤體積有良好的線性關系（F=427.0，P<0.000 1，R2=0.931 4），見圖1n，可間接反映其變化。
圖1
活體成像系統監測原位移植后 2～7 周直腸原位移植瘤生長和轉移情況以及直腸原位移植瘤動態觀測結果
a–f：隨著原位移植時間的延長，移植瘤體積的增大，發光面積逐漸增大；g、h：原位移植后 2～3 周見腸系膜根部淋巴結有熒光蛋白表達；i–l：原位移植后 4～7 周見腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺、腎均有熒光蛋白表達；g–l 圖中的數字 1～7 所指分別為腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺、腎、脾及原位移植腫瘤；m：直腸腫瘤體積與腫瘤熒光積分光密度值的動態變化；n：線性回歸分析結果
表1
荷瘤鼠體質量變化和原位移植瘤生長轉移情況
與原位移植前的體質量相比，4 周時裸鼠開始明顯消瘦（表1）。6 周時裸鼠精神萎靡，活動少，2 只裸鼠因癌性腸梗阻而死亡。10 周時所有裸鼠出現衰竭死亡。荷瘤鼠生存時間為 6～10 周，平均 9 周。
2.2 組織學檢查結果
裸鼠原位移植模型成瘤率為 100%。移植瘤肉眼觀呈不規則結節狀，與周圍組織分界不清，質地較硬，切面灰白色。腫瘤表面可見潰爛、出血和液化壞死灶。光鏡下見為低分化癌，呈條索狀排列，異型性明顯，核大小不一，核分裂象常見，黏膜層明顯增厚，腺體增生（圖2a、2b）。癌細胞逐漸向黏膜層及肌層侵襲，并圍繞腸壁呈環形浸潤性生長，免疫組化染色見癌細胞表達上皮標記 CEA（圖2c、2d）。
圖2
示原位移植瘤及其轉移情況的組織學檢查結果
a、b：原位移植后 4 周，見癌細胞在腸腺周圍浸潤性生長和黏膜下層呈條索狀排列 (HE ×200)；c、d：原位移植后 4 周，見腸腺細胞內有從周圍攝取的人 CEA，黏膜層的癌細胞在腸腺周圍彌漫分布，癌細胞改變形狀并侵入直腸黏膜層、黏膜下層和肌層（IHC ×200）；e–h：分別為原位移植后 5 周（e）、6 周（f）和 7 周（g、h），見腸系膜根部淋巴結（黑箭）和主動脈旁淋巴結腫大，肝臟表面顆粒狀灰白色癌結節（黑三角）；i：原位移植后 5 周見腸系膜根部淋巴結內形成轉移性癌結節 (HE ×200)；j：原位移植后 7 周見癌細胞侵占大部分腸系膜根部淋巴結，破壞其結構，結節內可見液化性壞死區 (HE ×200)；k：原位移植后 5 周，見主動脈旁淋巴結被膜下淋巴竇轉移灶（IHC ×200）；l：原位移植后 4 周見肺轉移灶 (HE ×200)
腸系膜和主動脈旁淋巴結腫大，質地變硬，切面呈灰白色。腎和脾臟腫大，肝臟表面見顆粒狀灰白色癌結節（圖2e-2h）。癌細胞先聚集于腸系膜根部淋巴結的邊緣竇，繼續增殖而累及整個淋巴結，破壞其結構，部分癌結節內見液化性壞死區，可繼續轉移至主動脈旁淋巴結（圖2i–2k）。淋巴結轉移規律：原位移植后 1 周時腸系膜根部淋巴結發生轉移（1/6），4 周時出現主動脈旁淋巴結轉移（3/6），6 周時腸系膜根部和主動脈旁淋巴結均發生轉移。遠處轉移情況：原位移植后 4 周時裸鼠出現肝轉移（2/6）和肺轉移（3/6，圖2l），雙腎未見轉移灶。腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺轉移隨時間變化情況見表1。以表達熒光蛋白來判斷淋巴結轉移情況與組織學檢查結果是一致的，而肝、肺轉移情況不完全一致。
3 討論
常用的結直腸癌動物模型包括：化學誘導成瘤模型[10-11]，原位或異位移植成瘤模型[12-13]和基因工程動物模型[14-15]。化學誘導劑破壞直腸黏膜屏障后經肛門滴入結直腸癌細胞建立的原位移植模型模擬了腫瘤從黏膜層開始浸潤的過程，貼近臨床腫瘤的發生，不過致瘤率不穩定，成瘤部位不確定，造模周期較長，損傷面積較大[16]。基因工程動物模型對研究腫瘤基因的表達和功能有著重要的作用，但靶基因重組效率存在差異，有胚胎致死可能性，腫瘤很少同步生長，成瘤部位也不確定，同樣需要較長建模周期。皮下移植瘤沒有原位移植瘤生長和轉移的過程，而且皮下組織與直腸組織的微環境明顯不同[17]。Onogawa 等[18]發現，在體外培養的人 KM12 細胞中未檢測到血管內皮生長因子 C（VEGF-C）mRNA 表達；然而，將 KM12 細胞植入裸鼠后卻檢測到 VEGF-C 表達。VEGF-C 和 VEGF-D 在原位盲腸腫瘤中表達量高于異位皮下腫瘤和肝轉移瘤。這表明 VEGF-C 和 VEGF-D 表達與組織的微環境有關，應該使用原位移植模型研究結腸癌淋巴管生成。腫瘤微環境對癌生物學特性至關重要，將癌細胞植入不同的微環境可以改變腫瘤特征和基因表達。Rashid 等[19]發現，乳腺癌皮下移植瘤與原位移植瘤、原位移植瘤與原位移植肺轉移瘤的基因表達譜不同，尾靜脈注射肺轉移瘤與原位移植肺轉移瘤的基因表達譜沒有差異。因此，CRC 需要在原位建模，以便最好地代表腫瘤微環境和生物學行為[20]。本研究在裸鼠直腸黏膜下注射 4×106個 HCT116 細胞后，所有裸鼠均長出腫瘤，隨后發生后腹膜淋巴結、肝、肺等轉移，這與臨床上直腸癌的生物學行為相似，表明該模型可高度模擬人 CRC 的生長、侵襲及轉移過程。并且本模型具有造模穩定、可重復、短周期等優點。然而，現有的動物模型都無法完全模擬人類 CRC 特征，因此選擇最佳模型以解決特定的問題至關重要[20]。
影像學檢查在直腸癌分期診斷中相當重要。MRI 可以清晰的顯示裸鼠直腸原位腫瘤和淋巴結的大小、形態、位置以及腫瘤內部信號及其向周圍生長情況[21-22]，但并不能準確判斷淋巴結轉移情況。理想的直腸癌動物模型要滿足兩個要求：一方面通過特異性示蹤癌細胞進而動態觀察腫瘤的發生、轉移全過程，另一方面可對癌組織反復取材。而傳統的直腸原位移植模型的癌細胞株未被報告基團標記，難以實現對移植瘤生長和轉移進行實時觀察。本研究中，在直腸原位注射紅色熒光蛋白標記的 HCT116 細胞后成功建立了直腸癌原位移植及淋巴轉移模型，并用活體成像系統對腫瘤的生長與轉移情況進行長期的動態觀察。與傳統模型相比，本研究建立的模型具有以下優點：① 早期敏感。直腸原位移植瘤模型在第 2 周時就可通過活體成像系統監測到腫瘤生長并且可測量腫瘤光密度值，能間接反映腫瘤的生長情況，而此時肉眼還不能直接看到腫塊。② 無創觀察。本模型可以在不處死動物的情況下連續觀察原位移植瘤的生長轉移情況，大幅度減少實驗所需的動物。③ 準確可靠。活體成像系統監測到原位腫瘤和淋巴結熒光信號，取材后組織學檢查陽性，兩者結果完全一致，說明了活體成像系統對原位腫瘤和淋巴轉移灶的判斷準確可靠。Metildi 等[23]發現，熒光引導下可實現所有裸鼠 2～4 mm 結腸原位腫瘤 R0 切除，而明視下 R0 切除僅占 58%，而且熒光引導切除術降低了腫瘤復發率，延長了中位生存期。這說明熒光通過增強研究人員識別腫瘤邊緣的能力，進而改善裸鼠結腸癌原位移植瘤手術切除的療效。這也為以后臨床應用，特別是腹腔鏡術中對于原發病灶和轉移病灶范圍的判斷，奠定了研究基礎。
本研究結果顯示，以表達熒光蛋白來判斷淋巴結轉移與病理學檢查結果一致，而對于判斷肝、肺等實質臟器的轉移，兩者卻不完全一致。部分肝、肺轉移灶探測不到的原因可能與遠處轉移灶位置深，紅色熒光組織穿透力稍差，以及成像系統靈敏度限制有關。表達熒光蛋白的雙腎免疫組織化學染色發現腎小管上皮細胞被 CEA 標記，但未見轉移灶，可能與腎小管對熒光蛋白和 CEA 的重吸收有關。原位移植 6 周時 2 只裸鼠因腫瘤生長導致的腸梗阻而死亡。我們嘗試切開裸鼠直腸前壁[24]，術后發現裸鼠排便量大，腸梗阻明顯好轉，進食增加，延長了裸鼠生存期。原位移植 7 周活體成像系統采集到雙腎發熒光，但之前均未探測到。這是因為裸鼠消瘦后雙腎位置變淺，熒光更易于被系統探測到。預實驗在 10 只裸鼠直腸黏膜下注射 1×106 個 HCT116 細胞，成瘤率僅為 60%。本研究改為 4×106 個 HCT116 細胞黏膜下注射，50 只裸鼠均長出腫瘤，造模成功率為 100%。
綜上所述，本實驗成功建立了一種可視、無創、穩定和可連續觀察的裸鼠直腸癌原位移植及淋巴轉移模型。該模型是研究直腸癌生物學[25]、耐藥機制、光動力治療及放化療的可靠模型，也可用于腹腔鏡術中對于原發病灶和轉移病灶范圍的判斷，應用前景廣闊。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉希負責實施研究，起草文章；楊文生、康政宇和陳詣佳負責實施研究，采集和分析數據；胡笑宇、黃偉和何升東負責指導試驗，對文章知識性內容進行審閱；張林負責參與實驗設計和論文審校。
倫理聲明：本研究已通過西部戰區總醫院的倫理審核批準［批準文號：2019 科研 75（2019ky75）］。
結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大發病率和第二大死亡率的惡性腫瘤[1]。我國 CRC 5 年生存率為 57%[2]。很明顯，仍需要新療法來改善晚期 CRC 的生存率。結直腸癌動物模型是新藥和新技術臨床前研究的主要支撐，因此，迫切需要盡可能模擬結直腸癌生物學的動物模型。在以往的研究中，皮下異位移植瘤在研究藥物和靶向治療效果的小鼠腫瘤模型中占主導地位，其操作簡單，又方便觀察和測量腫瘤大小。但是，結直腸癌皮下種植形成的是異位腫瘤微環境，且不易發生轉移，缺乏原位移植瘤發展、侵襲、轉移的過程。而原位腫瘤細胞移植則很好地彌補了這一點。活體熒光成像技術采用熒光報告基團（熒光蛋白、熒光染料、熒光探針等）標記細胞、核酸、蛋白質等，通過采集活體成像系統中激發熒光報告基團發出熒光信號，完成實時示蹤靶細胞，觀察分析基因及蛋白表達。在動物模型中，熒光蛋白成像已經廣泛用于無創觀察腫瘤[3-4]、基因表達[5]、移植物抗宿主病[6]和傳染病[7]。目前，國內未見有關于建立可視化直腸癌細胞原位移植淋巴轉移模型的報道。本研究旨在建立一種無創又易于實時監測直腸癌生物學行為和評估新療法療效的原位模型。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
IMDM 培養基、胎牛血清和 0.25% 胰酶-0.02% EDTA 均購自美國 HyClone 公司。兔抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）單克隆抗體購自美國 Abcam 公司，兔二步法試劑盒購自北京中杉金橋公司。小動物活體成像系統為法國 Vilber 公司產品，眼科顯微鏡為德國 ZEISS 公司產品。
1.2 實驗動物
SPF 級 BALB/C nu/nu 雄性裸鼠 50 只，鼠齡 4～6 周，體質量 18～23 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于陸軍特色醫學中心實驗動物中心的獨立通氣籠盒內，實驗動物許可證號：SYXK（渝）2017-0005。
1.3 腫瘤細胞
紅色熒光蛋白標記的人結直腸腺癌細胞 HCT 116，購自北京協和細胞資源中心。用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培養基作為培養用液，于 37 ℃、5% CO2 細胞培養箱內培養，每 3 天傳代 1 次，按 1∶4 傳代 2 次可收獲足夠的細胞。
1.4 原位移植細胞懸液的制備
每瓶對數生長期的 HCT 116 細胞，加入 1 mL 胰酶/EDTA 混合液消化 20 s，于倒置顯微鏡下觀察到多角形細胞變為卵圓形后，加入等體積培養基終止消化，輕輕吹打瓶壁促使細胞脫落。800 r/min 離心 5 min 后棄上清，加入 PBS 制成細胞懸液，計數后調整細胞濃度為 1×108/mL，臺盼藍染色后，將細胞存活率>90% 的細胞懸液置于冰盒中待用，于 30 min 內注射。
1.5 直腸原位移植瘤模型的建立
將 50 只裸鼠按隨機數字表法分為 8 組，第 1～7 組每組 6 只，第 8 組 8 只，適應性喂養 7 d 后建立模型。以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，仰臥位固定，碘伏消毒肛周皮膚。鑷子擴肛后，用 5 mL PBS 液清潔直腸，置入 3/4 周 7 mm 長的硅膠管（外徑 5 mm，內徑 3 mm）擴張直腸[8]。水平持握 100 μL 微量進液器，在 ZEISS 眼科顯微鏡直視下，距肛緣 1 mm 處針尖下壓，刺破直腸黏膜后壁，水平進針 3 mm，于直腸黏膜下緩慢注射 40 μL HCT 116 細胞懸液（4×106個）。退針后立即用棉簽壓迫，盡量減少細胞懸液外溢。注射完畢后將裸鼠放回籠中飼養。
1.6 直腸原位移植瘤模型的動態觀測
裸鼠直腸黏膜下注射 HCT 116 細胞后，每周觀察其精神、活動情況以及體質量的變化，并觸診肛周有無隆起的腫塊。每周用活體成像系統監測直腸原位移植瘤的生長和轉移情況。應用 Image J 軟件測算腫瘤熒光積分光密度值。每周取材后用游標卡尺測量瘤塊長度 a 和寬度 b，按公式計算腫瘤體積：V=a×b2/2，并繪制腫瘤生長曲線。
1.7 組織學檢查
在原位移植后 1～7 周每周處死 6 只裸鼠，顯露直腸腫瘤、腹膜后淋巴結和腹腔臟器，肉眼觀察其大小形態、浸潤轉移情況，然后取材，用 4% 多聚甲醛固定，30% 蔗糖脫水，制作冷凍切片，進行 HE 染色和免疫組織化學染色標記觀察。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示。裸鼠體質量、腫瘤體積和腫瘤積分光密度比較采用方差分析，多重比較采用 Bonferroni 法。腫瘤積分光密度與腫瘤體積之間的關系采用直線回歸分析，并用方差分析對回歸方程作假設檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 直腸原位移植后腫瘤生長轉移和裸鼠一般情況的動態觀察結果
直腸原位移植后 1 周時對裸鼠肛周皮下觸診，未發現包塊；2 周時所有裸鼠肛周皮下可捫及小硬結；3～7 周時肉眼和皮下觸診均發現原位移植部位的腫塊。
直腸原位移植后 1 周時對裸鼠活體成像未發現原位移植部位熒光蛋白表達，但取材后探測到所有裸鼠直腸原位移植瘤形成和 1 只裸鼠腸系膜根部淋巴結[9]有熒光蛋白表達。2～7 周時通過活體成像系統觀察到所有裸鼠原位移植部位的熒光蛋白表達（圖1a-1f），取材后還可見腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺及腎有熒光蛋白表達（圖1g-1l）。隨著原位移植后時間的延長，腫瘤體積和積分光密度值（表1）逐漸增大，裸鼠表達熒光蛋白的腸系膜根部淋巴結逐漸增多（圖1m）。腫瘤積分光密度值與腫瘤體積有良好的線性關系（F=427.0，P<0.000 1，R2=0.931 4），見圖1n，可間接反映其變化。
圖1
活體成像系統監測原位移植后 2～7 周直腸原位移植瘤生長和轉移情況以及直腸原位移植瘤動態觀測結果
a–f：隨著原位移植時間的延長，移植瘤體積的增大，發光面積逐漸增大；g、h：原位移植后 2～3 周見腸系膜根部淋巴結有熒光蛋白表達；i–l：原位移植后 4～7 周見腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺、腎均有熒光蛋白表達；g–l 圖中的數字 1～7 所指分別為腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺、腎、脾及原位移植腫瘤；m：直腸腫瘤體積與腫瘤熒光積分光密度值的動態變化；n：線性回歸分析結果
表1
荷瘤鼠體質量變化和原位移植瘤生長轉移情況
與原位移植前的體質量相比，4 周時裸鼠開始明顯消瘦（表1）。6 周時裸鼠精神萎靡，活動少，2 只裸鼠因癌性腸梗阻而死亡。10 周時所有裸鼠出現衰竭死亡。荷瘤鼠生存時間為 6～10 周，平均 9 周。
2.2 組織學檢查結果
裸鼠原位移植模型成瘤率為 100%。移植瘤肉眼觀呈不規則結節狀，與周圍組織分界不清，質地較硬，切面灰白色。腫瘤表面可見潰爛、出血和液化壞死灶。光鏡下見為低分化癌，呈條索狀排列，異型性明顯，核大小不一，核分裂象常見，黏膜層明顯增厚，腺體增生（圖2a、2b）。癌細胞逐漸向黏膜層及肌層侵襲，并圍繞腸壁呈環形浸潤性生長，免疫組化染色見癌細胞表達上皮標記 CEA（圖2c、2d）。
圖2
示原位移植瘤及其轉移情況的組織學檢查結果
a、b：原位移植后 4 周，見癌細胞在腸腺周圍浸潤性生長和黏膜下層呈條索狀排列 (HE ×200)；c、d：原位移植后 4 周，見腸腺細胞內有從周圍攝取的人 CEA，黏膜層的癌細胞在腸腺周圍彌漫分布，癌細胞改變形狀并侵入直腸黏膜層、黏膜下層和肌層（IHC ×200）；e–h：分別為原位移植后 5 周（e）、6 周（f）和 7 周（g、h），見腸系膜根部淋巴結（黑箭）和主動脈旁淋巴結腫大，肝臟表面顆粒狀灰白色癌結節（黑三角）；i：原位移植后 5 周見腸系膜根部淋巴結內形成轉移性癌結節 (HE ×200)；j：原位移植后 7 周見癌細胞侵占大部分腸系膜根部淋巴結，破壞其結構，結節內可見液化性壞死區 (HE ×200)；k：原位移植后 5 周，見主動脈旁淋巴結被膜下淋巴竇轉移灶（IHC ×200）；l：原位移植后 4 周見肺轉移灶 (HE ×200)
腸系膜和主動脈旁淋巴結腫大，質地變硬，切面呈灰白色。腎和脾臟腫大，肝臟表面見顆粒狀灰白色癌結節（圖2e-2h）。癌細胞先聚集于腸系膜根部淋巴結的邊緣竇，繼續增殖而累及整個淋巴結，破壞其結構，部分癌結節內見液化性壞死區，可繼續轉移至主動脈旁淋巴結（圖2i–2k）。淋巴結轉移規律：原位移植后 1 周時腸系膜根部淋巴結發生轉移（1/6），4 周時出現主動脈旁淋巴結轉移（3/6），6 周時腸系膜根部和主動脈旁淋巴結均發生轉移。遠處轉移情況：原位移植后 4 周時裸鼠出現肝轉移（2/6）和肺轉移（3/6，圖2l），雙腎未見轉移灶。腸系膜根部淋巴結、主動脈旁淋巴結、肝、肺轉移隨時間變化情況見表1。以表達熒光蛋白來判斷淋巴結轉移情況與組織學檢查結果是一致的，而肝、肺轉移情況不完全一致。
3 討論
常用的結直腸癌動物模型包括：化學誘導成瘤模型[10-11]，原位或異位移植成瘤模型[12-13]和基因工程動物模型[14-15]。化學誘導劑破壞直腸黏膜屏障后經肛門滴入結直腸癌細胞建立的原位移植模型模擬了腫瘤從黏膜層開始浸潤的過程，貼近臨床腫瘤的發生，不過致瘤率不穩定，成瘤部位不確定，造模周期較長，損傷面積較大[16]。基因工程動物模型對研究腫瘤基因的表達和功能有著重要的作用，但靶基因重組效率存在差異，有胚胎致死可能性，腫瘤很少同步生長，成瘤部位也不確定，同樣需要較長建模周期。皮下移植瘤沒有原位移植瘤生長和轉移的過程，而且皮下組織與直腸組織的微環境明顯不同[17]。Onogawa 等[18]發現，在體外培養的人 KM12 細胞中未檢測到血管內皮生長因子 C（VEGF-C）mRNA 表達；然而，將 KM12 細胞植入裸鼠后卻檢測到 VEGF-C 表達。VEGF-C 和 VEGF-D 在原位盲腸腫瘤中表達量高于異位皮下腫瘤和肝轉移瘤。這表明 VEGF-C 和 VEGF-D 表達與組織的微環境有關，應該使用原位移植模型研究結腸癌淋巴管生成。腫瘤微環境對癌生物學特性至關重要，將癌細胞植入不同的微環境可以改變腫瘤特征和基因表達。Rashid 等[19]發現，乳腺癌皮下移植瘤與原位移植瘤、原位移植瘤與原位移植肺轉移瘤的基因表達譜不同，尾靜脈注射肺轉移瘤與原位移植肺轉移瘤的基因表達譜沒有差異。因此，CRC 需要在原位建模，以便最好地代表腫瘤微環境和生物學行為[20]。本研究在裸鼠直腸黏膜下注射 4×106個 HCT116 細胞后，所有裸鼠均長出腫瘤，隨后發生后腹膜淋巴結、肝、肺等轉移，這與臨床上直腸癌的生物學行為相似，表明該模型可高度模擬人 CRC 的生長、侵襲及轉移過程。并且本模型具有造模穩定、可重復、短周期等優點。然而，現有的動物模型都無法完全模擬人類 CRC 特征，因此選擇最佳模型以解決特定的問題至關重要[20]。
影像學檢查在直腸癌分期診斷中相當重要。MRI 可以清晰的顯示裸鼠直腸原位腫瘤和淋巴結的大小、形態、位置以及腫瘤內部信號及其向周圍生長情況[21-22]，但并不能準確判斷淋巴結轉移情況。理想的直腸癌動物模型要滿足兩個要求：一方面通過特異性示蹤癌細胞進而動態觀察腫瘤的發生、轉移全過程，另一方面可對癌組織反復取材。而傳統的直腸原位移植模型的癌細胞株未被報告基團標記，難以實現對移植瘤生長和轉移進行實時觀察。本研究中，在直腸原位注射紅色熒光蛋白標記的 HCT116 細胞后成功建立了直腸癌原位移植及淋巴轉移模型，并用活體成像系統對腫瘤的生長與轉移情況進行長期的動態觀察。與傳統模型相比，本研究建立的模型具有以下優點：① 早期敏感。直腸原位移植瘤模型在第 2 周時就可通過活體成像系統監測到腫瘤生長并且可測量腫瘤光密度值，能間接反映腫瘤的生長情況，而此時肉眼還不能直接看到腫塊。② 無創觀察。本模型可以在不處死動物的情況下連續觀察原位移植瘤的生長轉移情況，大幅度減少實驗所需的動物。③ 準確可靠。活體成像系統監測到原位腫瘤和淋巴結熒光信號，取材后組織學檢查陽性，兩者結果完全一致，說明了活體成像系統對原位腫瘤和淋巴轉移灶的判斷準確可靠。Metildi 等[23]發現，熒光引導下可實現所有裸鼠 2～4 mm 結腸原位腫瘤 R0 切除，而明視下 R0 切除僅占 58%，而且熒光引導切除術降低了腫瘤復發率，延長了中位生存期。這說明熒光通過增強研究人員識別腫瘤邊緣的能力，進而改善裸鼠結腸癌原位移植瘤手術切除的療效。這也為以后臨床應用，特別是腹腔鏡術中對于原發病灶和轉移病灶范圍的判斷，奠定了研究基礎。
本研究結果顯示，以表達熒光蛋白來判斷淋巴結轉移與病理學檢查結果一致，而對于判斷肝、肺等實質臟器的轉移，兩者卻不完全一致。部分肝、肺轉移灶探測不到的原因可能與遠處轉移灶位置深，紅色熒光組織穿透力稍差，以及成像系統靈敏度限制有關。表達熒光蛋白的雙腎免疫組織化學染色發現腎小管上皮細胞被 CEA 標記，但未見轉移灶，可能與腎小管對熒光蛋白和 CEA 的重吸收有關。原位移植 6 周時 2 只裸鼠因腫瘤生長導致的腸梗阻而死亡。我們嘗試切開裸鼠直腸前壁[24]，術后發現裸鼠排便量大，腸梗阻明顯好轉，進食增加，延長了裸鼠生存期。原位移植 7 周活體成像系統采集到雙腎發熒光，但之前均未探測到。這是因為裸鼠消瘦后雙腎位置變淺，熒光更易于被系統探測到。預實驗在 10 只裸鼠直腸黏膜下注射 1×106 個 HCT116 細胞，成瘤率僅為 60%。本研究改為 4×106 個 HCT116 細胞黏膜下注射，50 只裸鼠均長出腫瘤，造模成功率為 100%。
綜上所述，本實驗成功建立了一種可視、無創、穩定和可連續觀察的裸鼠直腸癌原位移植及淋巴轉移模型。該模型是研究直腸癌生物學[25]、耐藥機制、光動力治療及放化療的可靠模型，也可用于腹腔鏡術中對于原發病灶和轉移病灶范圍的判斷，應用前景廣闊。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉希負責實施研究，起草文章；楊文生、康政宇和陳詣佳負責實施研究，采集和分析數據；胡笑宇、黃偉和何升東負責指導試驗，對文章知識性內容進行審閱；張林負責參與實驗設計和論文審校。
倫理聲明：本研究已通過西部戰區總醫院的倫理審核批準［批準文號：2019 科研 75（2019ky75）］。
