引用本文： 謝少華, 戴維, 劉明心, 向潤, 謝天鵬, 楊曉軍, 胡彬, 莊翔, 楊曉樽, 田博, 李雯雯, 段憶翔, 李強. 呼出氣中揮發性有機化合物對<50歲人群肺結節良惡性的預測價值. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(6): 675-680. doi: 10.7507/1007-4848.202002125 復制
2018 年全球癌癥統計數據顯示，肺癌的發病率及死亡率居所有惡性腫瘤之首[1]。早期確診肺癌患者的 5 年生存率可達到 70%～90%，而晚期確診肺癌患者的 5 年生存率下降至 12%[2-3]。因此，肺癌的早期診斷對降低死亡率、提高生存率至關重要。目前臨床常用的早期肺癌篩查方式為低劑量螺旋 CT（low-dose CT，LDCT），其提高了早期肺癌的診斷率并在一定程度上降低了肺癌的死亡率。在我國，LDCT 逐漸用于>50 歲高危人群的肺癌篩查[4]。隨著 LDCT 的廣泛使用，越來越多的肺結節在中青年人群中被發現。在肺結節的后續隨訪中，LDCT 可帶來輻射傷害，反復 LDCT 檢查可加重患者的心理負擔，同時增加了患者及社會的經濟負擔。目前急需一種快速、靈敏、無創的方法輔助中青年人群肺結節的良惡性診斷。
人體內的代謝產物，如可揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs），通過血液到達肺部，在肺部進行物質交換并通過呼吸道排出體外，因此呼出氣中 VOCs 可反映機體的疾病狀態。呼出氣中 VOCs 的檢測及分析具有無創、快速、可重復等特點，有望成為輔助肺癌早期診斷的有力手段。呼出氣中 VOCs 用于肺癌診斷相關研究已有 30 余年，大量研究結果均表明，VOCs 在肺癌的早期診斷上擁有巨大潛力[5]。但目前已發表的研究中肺癌組與對照組的年齡并不匹配，肺癌組患者的年齡通常明顯大于對照組，且平均年齡多>50 歲[6]。同時，大多數研究的對照組選擇為健康人群，少數研究將不同程度的慢性阻塞性肺疾病伴肺氣腫[7-10]、慢性支氣管炎[11]、肺炎[12]、肺結核[12]、哮喘[9, 12]患者同時作為對照組。目前尚缺乏針對中青年人群以及肺部有明確占位性病變的專門研究。本前瞻性研究將<50 歲且有肺結節的患者作為研究對象，旨在探討 VOCs 對中青年人群肺結節良惡性的預測能力。
1 資料與方法
1.1 試劑和材料
試劑：異戊二烯、丙酮、環戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、鄰二甲苯、β-蒎烯、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷的標準樣品購自上海阿拉丁試劑有限公司。研究中 VOCs 的定性采用標準樣品標定結合 NIST08 數據庫檢索的方式進行。
材料與設備：500 mL-Tedlar 采氣袋，購自大連德霖氣體包裝有限公司；Bio-VOC 采氣筒購自英國 Markes 公司；固相微萃取手柄（57330-U）和 DVB/CAR/PDMS 萃取纖維針購于美國 Sigma-Aldrich 公司；TRACE 1300 氣相色譜聯合 TSQ8000 三重四級桿質譜儀為美國賽默飛世爾科技有限公司產品。
1.2 臨床資料和分組
將 2019 年 8 月 1 日至 2020 年 1 月 15 日于四川省腫瘤醫院胸外科中心就診的、胸部 CT 顯示有肺部占位性病變的患者作為研究對象。
入組標準：（1）年齡<50 歲，性別不限；（2）胸部 CT 測量肺部病變最大直徑≤3 cm；（3）經臨床評估高度懷疑為肺癌并擬行穿刺活檢或手術切除；（4）獲得知情同意。
排除標準：（1）既往有惡性腫瘤病史；（2）同時伴有以下系統性疾病：慢性支氣管肺炎伴肺氣腫、支氣管哮喘、糖尿病、自身免疫性疾病、重度肝功能損害、終末期腎病、炎癥急性期；（3）不能配合呼出氣采集。
根據病理診斷結果，將入組的 147 例患者分為肺癌組和肺良性疾病組。肺癌組 104 例，其中男 36 例、女 68 例，年齡 27～49（43.54±5.73）歲。肺良性疾病組 43 例，其中男 23 例、女 20 例，年齡 22～49（42.49±6.83）歲。收集兩組患者的臨床資料（年齡、性別、吸煙史、飲酒史、病理類型、病理分期等）及呼出氣。研究過程中出現以下情況需出組：（1）放棄穿刺或手術、未獲得病理結果；（2）病理性質不明；（3）無論何種原因要求出組的患者。
1.3 呼出氣采集流程
在穿刺或手術前 1 d，將患者安置于固定場所（通風室內），靜坐 10 min 以上。用軟管將采氣筒、三通閥門和 Tedlar 袋連接，反復 3 次排除 Tedlar 袋內空氣。患者通過吹嘴向氣筒正常呼氣，直到感覺到輕微的阻力。將吹氣筒內的 150 mL 呼氣末的氣體推入 Tedlar 袋中，重復 3 次，共收集 450 mL 氣體。患者被要求禁食至少 8 h，同時禁煙酒。在采集氣體前不允許深吸氣，采集時不允許鼻腔通氣及二次呼吸。采集呼出氣結束時，采集環境氣體用于背景矯正及內源性 VOCs 的篩選。內源性 VOCs 具有正肺泡濃度梯度，即患者呼出氣中濃度大于背景空氣中濃度。裝有呼出氣的 Tedlar 袋馬上放入有冰袋的保溫箱中，溫度計實時監測，確保在 2℃～8℃ 的環境中運輸。若不能及時分析檢測，應保存于–40℃ 冰箱中，檢測要在一周內進行。
1.4 采用氣相色譜質譜技術（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）對 VOCs 進行分析
固相微萃取：選擇應用涂覆 50/30 μm 的混合型纖維頭 DVB/CAR/PDMS 進行預富集。采用直接萃取法，萃取溫度為 37℃，萃取時間為 30 min。
GC-MS：上述樣品在進樣口解析 5 min 后進入 GC-MS，使用儀器為 TRACE 1300 氣相色譜聯合 TSQ8000 三重四級桿質譜儀，采用色譜柱 DB-624（60 m×0.25 mm×1.4 μm）進行化合物分離。條件與參數：（1）流量控制，采用高純氦氣（99.9%）作為載氣，流速控制在 1.0 mL/min；（2）分流比為 5∶1，質譜質量掃描范圍為 35～200 m/z；（3）進樣口、傳輸線、MS 離子源溫度分別為 270℃、250℃、250℃；（4）柱溫箱升溫程序為：40℃ 保持 5 min，先以 10℃/min 的速度升至 160℃，再以 5℃/min 上升到 200℃，最后在 200℃ 保持 5 min。
1.5 統計學分析
計量資料以均數±標準差（
±s）表示。單因素分析時，符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合的采用 Mann-Whitney U檢驗；性別、吸煙狀態、飲酒狀態和 VOCs 檢出率的比較采用卡方檢驗，當不滿足卡方檢驗條件時選用 Fisher 確切概率法。將P<0.10 的變量納入條件二元 logistic 回歸分析（為避免遺漏掉重要影響因素，將P值上限放寬至 0.10），并建立預測模型，計算模型的敏感度和特異度。構建預測模型的受試者工作特征（ROC）曲線，并計算 ROC 曲線下面積。所有分析使用 SPSS 24.0 軟件進行，檢驗水準為α=0.05。
1.6 倫理審查
本研究已通過四川省腫瘤醫院倫理委員會審批，倫理審批號：SCCHEC-02-2017-011。
2 結果
2.1 臨床特征
肺癌組中浸潤性腺癌 68 例（65.4%），原位腺癌 2 例（1.9%），微浸潤腺癌 29 例（27.9%），鱗狀細胞癌 2 例（1.9%），小細胞癌 1 例（1.0%），非小細胞癌 1 例（1.0%），不明類型癌 1 例（1.0%）。根據國際抗癌聯盟（UICC）2018 年第 8 版 TNM 標準分期，0 期 2 例（1.9%），ⅠA1 期 39 例（37.5%），ⅠA2 期 16 例（15.4%），ⅠA3 期 4 例（3.9%），ⅠB 期 15 例（14.4%），ⅡA 期 1 例（1.0%），ⅡB 期 6 例（5.8%），ⅢA 期 7 例（6.7%），ⅢB 期 3 例（2.9%），ⅣA 期 4 例（3.9%），ⅣB 期 7 例（6.7%）。肺良性疾病組 43 例患者中，肺炎性假瘤 27 例（62.8%），肺良性腫瘤 8 例（18.6%），肺結核 8 例（18.6%）。
兩組年齡（P=0.376）、飲酒史（P=0.304）差異均無統計學意義，而性別（P=0.034）、吸煙史（P=0.047）差異具有統計學意義；見表 1。
表1
兩組患者的一般臨床特征［
/例（%）］
2.2 肺癌組與肺良性疾病組的 VOCs 對比
按照設定的 GC-MS 條件對所有呼出氣樣本進行檢測分析，在患者的呼出氣中可檢出 30～40 種 VOCs，排除外源性 VOCs、柱流失、環境物質干擾后，共有 16 種 VOCs 納入研究，這些物質分別為異戊二烯、丙酮、環戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、鄰二甲苯、β-蒎烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷。對兩組 VOCs 的檢出率和含量進行對比，結果顯示環戊烷（P=0.002）、3-甲基戊烷（P=0.043）、乙苯（P=0.009）三種物質的檢出率差異具有統計學意義，其中肺癌組中 3-甲基戊烷和乙苯的檢出率高于肺良性疾病組，環戊烷的檢出率低于肺良性疾病組。肺癌組中環戊烷的含量低于肺良性疾病組，差異具有統計學意義（P=0.009）；見表 2。
表2
兩組患者 VOCs 對比
2.3 預測模型的建立及評價
將性別、吸煙史、環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺、鄰二甲苯納入多因素條件回歸分析，篩選出有意義的變量。性別、環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺作為變量納入模型，建立二元 logistic 回歸預測模型，預測模型回歸方程：logit（p）=0.912+1.237X1–1.084X2–1.353X3+1.283X4–0.790X5，該模型具體參數見表 3。構建預測模型的 ROC 曲線，經計算 ROC 曲線下面積為 0.781；見圖 1。以 0.7 作為分類分界值，利用該診斷模型預測患者的患病情況與金標準（病理診斷）對比，從而計算出該模型的敏感度為 80.8%，特異度為 60.5%。
圖1
回歸模型的 ROC 曲線
表3
logistic 回歸分析方程中的變量
3 討論
本研究得到了 3 種肺癌與肺良性疾病具有明顯差異的 VOCs，即環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯。該 3 種物質屬于烷類及其化合物和苯類，與部分學者研究得到的化合物類型一致。Phillips 等[13-14]在多次研究中均發現與肺癌相關的 VOCs 主要是烷烴類及其衍生物和苯的衍生物。Gaspar 等[15]研究發現，乙苯可作為癌癥標志物之一。雖然關于肺癌 VOCs 標志物的研究很多，但大家的結果差異卻很大，重復性差。1985～2016 年報道的肺癌呼出氣標志物 VOCs，其中重復 5 次的只有 2 種，為 2 丁酮和丙醇，出現 4 次的只有異戊二烯、苯乙烷和苯乙烯，出現 3 次的有 9 種[16]。目前認為肺癌最常見的生物標志物包括丙醇、異戊二烯、丙酮、戊烷、己醛、甲苯、苯和乙苯[6]。造成這種差異的原因很多，如采樣技術、預濃縮技術、分析技術和腫瘤異質性等。總的來說，目前尚未有關于呼出氣中 VOCs 采集、檢測、分析、數據處理等標準化操作流程。此外，關于 VOCs 產生機制的代謝組學研究較少。目前認為烷烴類 VOCs 的產生可能與氧化應激反應密切相關，是由不飽和脂肪酸的過氧化損傷導致，而癌癥的發生發展過程中往往伴隨著異常的氧化應激反應[17]。芳香族化合物則多被認為是外源性污染物在機體內的長期積累再釋放于呼吸道中，因其高度反應性且部分芳香族化合物本身為致癌物，所以其與癌癥的發生發展密切相關[17-18]。遺憾的是目前的研究并不能明確 VOCs 的產生機制，因此需要后續更多的深入代謝機制的研究[19]。
隨著影像技術的飛速發展，早期肺癌的診斷率也逐年增高[20]。但因為 LDCT 的假陽性率高[21-22]，越來越多的肺結節篩查出來，這些結節的良惡性判斷直接影響后續干預。單純影像學結合臨床經驗的判斷是不夠的，據報道在手術切除的肺小結節中良性結節的比例達到了 30%[23]。因此，目前呼出氣診斷肺癌的重點應是對肺結節病變的良惡性鑒別上。Peled 等[24]在其研究中，納入了 53 例肺癌患者和 19 例肺良性結節患者，發現 1-辛烯在兩者間具有明顯差異。本研究發現環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯在肺癌與肺良性疾病間存在明顯差異，其中環戊烷和乙苯可對肺結節良惡性的鑒別產生影響。本研究與 Peled 等[24]的研究有所不同，后者的研究對象平均年齡在 60 歲以上，且 50% 患者同時患有慢性阻塞性肺疾病。本研究納入的患者年齡均為 50 歲以下，同時排除了慢性阻塞性肺疾病的干擾。后者研究中良性結節部分未經病理診斷，而本研究肺良性疾病組病例均經病理學診斷明確。因此，兩項研究差別較大，參考價值小。
本研究所建立的預測模型雖可對<50 歲人群的肺結節的良惡性進行預測，但其敏感度、特異度和準確度均不高，預測能力有限。究其原因可能與以下因素有關：（1）總體樣本量少，肺良性疾病例數少，兩組間病例數不匹配，研究結果可能缺乏代表性；（2）納入臨床特征少，本研究僅納入了性別、年齡、吸煙史及飲酒史；（3）肺癌患者中早期患者多，比例達到 73%，0 期與ⅠA 期患者的比例達到 39%。早期肺癌處于癌癥發展的初步階段，對局部微環境及機體代謝的影響尚小，可能對 VOCs 的影響尚不足以與肺良性結節區分；（4）雖然 GC-MS 是檢測呼出氣的經典方法，但是其檢測種類和精度仍有限[25]，可能有更多的 VOCs 未被發現。
本研究的主要局限性為：僅完成了預測模型的初步建立，而未進行進一步的驗證。后續需要增加更多的樣本，特別是肺良性結節的樣本量，對預測模型進行完善及驗證。本研究結果提示在中青年肺結節的性質判別上，單純依靠 VOCs 和部分臨床特征可能達不到良好的效果。因此，在后續的研究中可將 VOCs、更多臨床特征與影像學等相結合，以建立更強健的預測模型，或許可達到良好的預測效果。
利益沖突：無。
作者貢獻：李強負責研究方案的構思和完整方案的審查；謝少華負責研究設計和實施；戴維負責研究設計和數據統計分析；劉明心、向潤、楊曉樽、田博負責呼出氣的采集、運輸；謝天鵬、楊曉軍、胡彬、莊翔負責患者的入組、臨床資料的收集；劉明心、李雯雯負責呼出氣體的分析；段憶翔負責研究方案的構思和呼出氣分析的質量控制。
2018 年全球癌癥統計數據顯示，肺癌的發病率及死亡率居所有惡性腫瘤之首[1]。早期確診肺癌患者的 5 年生存率可達到 70%～90%，而晚期確診肺癌患者的 5 年生存率下降至 12%[2-3]。因此，肺癌的早期診斷對降低死亡率、提高生存率至關重要。目前臨床常用的早期肺癌篩查方式為低劑量螺旋 CT（low-dose CT，LDCT），其提高了早期肺癌的診斷率并在一定程度上降低了肺癌的死亡率。在我國，LDCT 逐漸用于>50 歲高危人群的肺癌篩查[4]。隨著 LDCT 的廣泛使用，越來越多的肺結節在中青年人群中被發現。在肺結節的后續隨訪中，LDCT 可帶來輻射傷害，反復 LDCT 檢查可加重患者的心理負擔，同時增加了患者及社會的經濟負擔。目前急需一種快速、靈敏、無創的方法輔助中青年人群肺結節的良惡性診斷。
人體內的代謝產物，如可揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs），通過血液到達肺部，在肺部進行物質交換并通過呼吸道排出體外，因此呼出氣中 VOCs 可反映機體的疾病狀態。呼出氣中 VOCs 的檢測及分析具有無創、快速、可重復等特點，有望成為輔助肺癌早期診斷的有力手段。呼出氣中 VOCs 用于肺癌診斷相關研究已有 30 余年，大量研究結果均表明，VOCs 在肺癌的早期診斷上擁有巨大潛力[5]。但目前已發表的研究中肺癌組與對照組的年齡并不匹配，肺癌組患者的年齡通常明顯大于對照組，且平均年齡多>50 歲[6]。同時，大多數研究的對照組選擇為健康人群，少數研究將不同程度的慢性阻塞性肺疾病伴肺氣腫[7-10]、慢性支氣管炎[11]、肺炎[12]、肺結核[12]、哮喘[9, 12]患者同時作為對照組。目前尚缺乏針對中青年人群以及肺部有明確占位性病變的專門研究。本前瞻性研究將<50 歲且有肺結節的患者作為研究對象，旨在探討 VOCs 對中青年人群肺結節良惡性的預測能力。
1 資料與方法
1.1 試劑和材料
試劑：異戊二烯、丙酮、環戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、鄰二甲苯、β-蒎烯、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷的標準樣品購自上海阿拉丁試劑有限公司。研究中 VOCs 的定性采用標準樣品標定結合 NIST08 數據庫檢索的方式進行。
材料與設備：500 mL-Tedlar 采氣袋，購自大連德霖氣體包裝有限公司；Bio-VOC 采氣筒購自英國 Markes 公司；固相微萃取手柄（57330-U）和 DVB/CAR/PDMS 萃取纖維針購于美國 Sigma-Aldrich 公司；TRACE 1300 氣相色譜聯合 TSQ8000 三重四級桿質譜儀為美國賽默飛世爾科技有限公司產品。
1.2 臨床資料和分組
將 2019 年 8 月 1 日至 2020 年 1 月 15 日于四川省腫瘤醫院胸外科中心就診的、胸部 CT 顯示有肺部占位性病變的患者作為研究對象。
入組標準：（1）年齡<50 歲，性別不限；（2）胸部 CT 測量肺部病變最大直徑≤3 cm；（3）經臨床評估高度懷疑為肺癌并擬行穿刺活檢或手術切除；（4）獲得知情同意。
排除標準：（1）既往有惡性腫瘤病史；（2）同時伴有以下系統性疾病：慢性支氣管肺炎伴肺氣腫、支氣管哮喘、糖尿病、自身免疫性疾病、重度肝功能損害、終末期腎病、炎癥急性期；（3）不能配合呼出氣采集。
根據病理診斷結果，將入組的 147 例患者分為肺癌組和肺良性疾病組。肺癌組 104 例，其中男 36 例、女 68 例，年齡 27～49（43.54±5.73）歲。肺良性疾病組 43 例，其中男 23 例、女 20 例，年齡 22～49（42.49±6.83）歲。收集兩組患者的臨床資料（年齡、性別、吸煙史、飲酒史、病理類型、病理分期等）及呼出氣。研究過程中出現以下情況需出組：（1）放棄穿刺或手術、未獲得病理結果；（2）病理性質不明；（3）無論何種原因要求出組的患者。
1.3 呼出氣采集流程
在穿刺或手術前 1 d，將患者安置于固定場所（通風室內），靜坐 10 min 以上。用軟管將采氣筒、三通閥門和 Tedlar 袋連接，反復 3 次排除 Tedlar 袋內空氣。患者通過吹嘴向氣筒正常呼氣，直到感覺到輕微的阻力。將吹氣筒內的 150 mL 呼氣末的氣體推入 Tedlar 袋中，重復 3 次，共收集 450 mL 氣體。患者被要求禁食至少 8 h，同時禁煙酒。在采集氣體前不允許深吸氣，采集時不允許鼻腔通氣及二次呼吸。采集呼出氣結束時，采集環境氣體用于背景矯正及內源性 VOCs 的篩選。內源性 VOCs 具有正肺泡濃度梯度，即患者呼出氣中濃度大于背景空氣中濃度。裝有呼出氣的 Tedlar 袋馬上放入有冰袋的保溫箱中，溫度計實時監測，確保在 2℃～8℃ 的環境中運輸。若不能及時分析檢測，應保存于–40℃ 冰箱中，檢測要在一周內進行。
1.4 采用氣相色譜質譜技術（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）對 VOCs 進行分析
固相微萃取：選擇應用涂覆 50/30 μm 的混合型纖維頭 DVB/CAR/PDMS 進行預富集。采用直接萃取法，萃取溫度為 37℃，萃取時間為 30 min。
GC-MS：上述樣品在進樣口解析 5 min 后進入 GC-MS，使用儀器為 TRACE 1300 氣相色譜聯合 TSQ8000 三重四級桿質譜儀，采用色譜柱 DB-624（60 m×0.25 mm×1.4 μm）進行化合物分離。條件與參數：（1）流量控制，采用高純氦氣（99.9%）作為載氣，流速控制在 1.0 mL/min；（2）分流比為 5∶1，質譜質量掃描范圍為 35～200 m/z；（3）進樣口、傳輸線、MS 離子源溫度分別為 270℃、250℃、250℃；（4）柱溫箱升溫程序為：40℃ 保持 5 min，先以 10℃/min 的速度升至 160℃，再以 5℃/min 上升到 200℃，最后在 200℃ 保持 5 min。
1.5 統計學分析
計量資料以均數±標準差（±s）表示。單因素分析時，符合正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合的采用 Mann-Whitney U檢驗；性別、吸煙狀態、飲酒狀態和 VOCs 檢出率的比較采用卡方檢驗，當不滿足卡方檢驗條件時選用 Fisher 確切概率法。將P<0.10 的變量納入條件二元 logistic 回歸分析（為避免遺漏掉重要影響因素，將P值上限放寬至 0.10），并建立預測模型，計算模型的敏感度和特異度。構建預測模型的受試者工作特征（ROC）曲線，并計算 ROC 曲線下面積。所有分析使用 SPSS 24.0 軟件進行，檢驗水準為α=0.05。
1.6 倫理審查
本研究已通過四川省腫瘤醫院倫理委員會審批，倫理審批號：SCCHEC-02-2017-011。
2 結果
2.1 臨床特征
肺癌組中浸潤性腺癌 68 例（65.4%），原位腺癌 2 例（1.9%），微浸潤腺癌 29 例（27.9%），鱗狀細胞癌 2 例（1.9%），小細胞癌 1 例（1.0%），非小細胞癌 1 例（1.0%），不明類型癌 1 例（1.0%）。根據國際抗癌聯盟（UICC）2018 年第 8 版 TNM 標準分期，0 期 2 例（1.9%），ⅠA1 期 39 例（37.5%），ⅠA2 期 16 例（15.4%），ⅠA3 期 4 例（3.9%），ⅠB 期 15 例（14.4%），ⅡA 期 1 例（1.0%），ⅡB 期 6 例（5.8%），ⅢA 期 7 例（6.7%），ⅢB 期 3 例（2.9%），ⅣA 期 4 例（3.9%），ⅣB 期 7 例（6.7%）。肺良性疾病組 43 例患者中，肺炎性假瘤 27 例（62.8%），肺良性腫瘤 8 例（18.6%），肺結核 8 例（18.6%）。
兩組年齡（P=0.376）、飲酒史（P=0.304）差異均無統計學意義，而性別（P=0.034）、吸煙史（P=0.047）差異具有統計學意義；見表 1。
表1
兩組患者的一般臨床特征［/例（%）］
2.2 肺癌組與肺良性疾病組的 VOCs 對比
按照設定的 GC-MS 條件對所有呼出氣樣本進行檢測分析，在患者的呼出氣中可檢出 30～40 種 VOCs，排除外源性 VOCs、柱流失、環境物質干擾后，共有 16 種 VOCs 納入研究，這些物質分別為異戊二烯、丙酮、環戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、鄰二甲苯、β-蒎烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷。對兩組 VOCs 的檢出率和含量進行對比，結果顯示環戊烷（P=0.002）、3-甲基戊烷（P=0.043）、乙苯（P=0.009）三種物質的檢出率差異具有統計學意義，其中肺癌組中 3-甲基戊烷和乙苯的檢出率高于肺良性疾病組，環戊烷的檢出率低于肺良性疾病組。肺癌組中環戊烷的含量低于肺良性疾病組，差異具有統計學意義（P=0.009）；見表 2。
表2
兩組患者 VOCs 對比
2.3 預測模型的建立及評價
將性別、吸煙史、環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺、鄰二甲苯納入多因素條件回歸分析，篩選出有意義的變量。性別、環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺作為變量納入模型，建立二元 logistic 回歸預測模型，預測模型回歸方程：logit（p）=0.912+1.237X1–1.084X2–1.353X3+1.283X4–0.790X5，該模型具體參數見表 3。構建預測模型的 ROC 曲線，經計算 ROC 曲線下面積為 0.781；見圖 1。以 0.7 作為分類分界值，利用該診斷模型預測患者的患病情況與金標準（病理診斷）對比，從而計算出該模型的敏感度為 80.8%，特異度為 60.5%。
圖1
回歸模型的 ROC 曲線
表3
logistic 回歸分析方程中的變量
3 討論
本研究得到了 3 種肺癌與肺良性疾病具有明顯差異的 VOCs，即環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯。該 3 種物質屬于烷類及其化合物和苯類，與部分學者研究得到的化合物類型一致。Phillips 等[13-14]在多次研究中均發現與肺癌相關的 VOCs 主要是烷烴類及其衍生物和苯的衍生物。Gaspar 等[15]研究發現，乙苯可作為癌癥標志物之一。雖然關于肺癌 VOCs 標志物的研究很多，但大家的結果差異卻很大，重復性差。1985～2016 年報道的肺癌呼出氣標志物 VOCs，其中重復 5 次的只有 2 種，為 2 丁酮和丙醇，出現 4 次的只有異戊二烯、苯乙烷和苯乙烯，出現 3 次的有 9 種[16]。目前認為肺癌最常見的生物標志物包括丙醇、異戊二烯、丙酮、戊烷、己醛、甲苯、苯和乙苯[6]。造成這種差異的原因很多，如采樣技術、預濃縮技術、分析技術和腫瘤異質性等。總的來說，目前尚未有關于呼出氣中 VOCs 采集、檢測、分析、數據處理等標準化操作流程。此外，關于 VOCs 產生機制的代謝組學研究較少。目前認為烷烴類 VOCs 的產生可能與氧化應激反應密切相關，是由不飽和脂肪酸的過氧化損傷導致，而癌癥的發生發展過程中往往伴隨著異常的氧化應激反應[17]。芳香族化合物則多被認為是外源性污染物在機體內的長期積累再釋放于呼吸道中，因其高度反應性且部分芳香族化合物本身為致癌物，所以其與癌癥的發生發展密切相關[17-18]。遺憾的是目前的研究并不能明確 VOCs 的產生機制，因此需要后續更多的深入代謝機制的研究[19]。
隨著影像技術的飛速發展，早期肺癌的診斷率也逐年增高[20]。但因為 LDCT 的假陽性率高[21-22]，越來越多的肺結節篩查出來，這些結節的良惡性判斷直接影響后續干預。單純影像學結合臨床經驗的判斷是不夠的，據報道在手術切除的肺小結節中良性結節的比例達到了 30%[23]。因此，目前呼出氣診斷肺癌的重點應是對肺結節病變的良惡性鑒別上。Peled 等[24]在其研究中，納入了 53 例肺癌患者和 19 例肺良性結節患者，發現 1-辛烯在兩者間具有明顯差異。本研究發現環戊烷、3-甲基戊烷、乙苯在肺癌與肺良性疾病間存在明顯差異，其中環戊烷和乙苯可對肺結節良惡性的鑒別產生影響。本研究與 Peled 等[24]的研究有所不同，后者的研究對象平均年齡在 60 歲以上，且 50% 患者同時患有慢性阻塞性肺疾病。本研究納入的患者年齡均為 50 歲以下，同時排除了慢性阻塞性肺疾病的干擾。后者研究中良性結節部分未經病理診斷，而本研究肺良性疾病組病例均經病理學診斷明確。因此，兩項研究差別較大，參考價值小。
本研究所建立的預測模型雖可對<50 歲人群的肺結節的良惡性進行預測，但其敏感度、特異度和準確度均不高，預測能力有限。究其原因可能與以下因素有關：（1）總體樣本量少，肺良性疾病例數少，兩組間病例數不匹配，研究結果可能缺乏代表性；（2）納入臨床特征少，本研究僅納入了性別、年齡、吸煙史及飲酒史；（3）肺癌患者中早期患者多，比例達到 73%，0 期與ⅠA 期患者的比例達到 39%。早期肺癌處于癌癥發展的初步階段，對局部微環境及機體代謝的影響尚小，可能對 VOCs 的影響尚不足以與肺良性結節區分；（4）雖然 GC-MS 是檢測呼出氣的經典方法，但是其檢測種類和精度仍有限[25]，可能有更多的 VOCs 未被發現。
本研究的主要局限性為：僅完成了預測模型的初步建立，而未進行進一步的驗證。后續需要增加更多的樣本，特別是肺良性結節的樣本量，對預測模型進行完善及驗證。本研究結果提示在中青年肺結節的性質判別上，單純依靠 VOCs 和部分臨床特征可能達不到良好的效果。因此，在后續的研究中可將 VOCs、更多臨床特征與影像學等相結合，以建立更強健的預測模型，或許可達到良好的預測效果。
利益沖突：無。
作者貢獻：李強負責研究方案的構思和完整方案的審查；謝少華負責研究設計和實施；戴維負責研究設計和數據統計分析；劉明心、向潤、楊曉樽、田博負責呼出氣的采集、運輸；謝天鵬、楊曉軍、胡彬、莊翔負責患者的入組、臨床資料的收集；劉明心、李雯雯負責呼出氣體的分析；段憶翔負責研究方案的構思和呼出氣分析的質量控制。
